針刺干預(yù)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠細(xì)胞凋亡的時(shí)效研究

劉學(xué)文 周 競 彭 平 張宏生 李 平 荊志偉

（1.首都醫(yī)科大學(xué)潞河教學(xué)醫(yī)院，北京 101100；2.北方工業(yè)大學(xué)醫(yī)院，北京 100041；3.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；5.天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170；6.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700）

腦出血是指原發(fā)性非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，是急性腦血管疾病中的危重類型，發(fā)病率、死亡率及致殘率均較高，嚴(yán)重危害人類健康及生活質(zhì)量［1］，目前神經(jīng)內(nèi)、外科治療效果并不令人滿意［2］，腦出血早期是治療的關(guān)鍵［3］。中醫(yī)藥包括針灸療法在腦出血急性期治療中得到廣泛應(yīng)用，已成為整個(gè)治療體系中重要的一部分［4-6］。但在腦出血發(fā)病后不同時(shí)期給予針刺療效是否相同，針刺介入時(shí)機(jī)是否越早越好，是需要解決的問題。本研究通過觀察不同時(shí)機(jī)介入針刺對(duì)細(xì)胞凋亡因子Bcl-2/Bax及HSP70的表達(dá)的影響，研究針刺治療腦出血時(shí)機(jī)和療效關(guān)系及其機(jī)理，以期為臨床提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康Wistar大鼠（北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量250～320 g，雄性。隨機(jī)分為空白組、模型組及按針刺介入時(shí)間分為的3 h針刺組、9 h針刺組、24 h針刺組、48 h針刺組，每組10只。

1.2 儀器與試藥 腦立體定向儀（日本SR-6N）；微量注射器（上海激光醫(yī)學(xué)儀器廠）；渦輪牙鉆機(jī)（北京自動(dòng)化儀表三廠）；電子天平（日本ANDHR-120，精確度為0.1 mg）；恒溫干燥箱（北京市朝陽區(qū)來廣營醫(yī)療器械廠）；CMIS型細(xì)胞醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（重慶天海）；石蠟切片機(jī) （德國LEICA RM 2135）；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡（日本）；天平（常熟市衡器廠HR-120）；手術(shù)器械。

磷酸鹽緩沖試劑（0.1 mol/L PBS 液，pH 7.2～7.4）：用氯化鈉9g，12水磷酸氫二鈉6 g，水磷酸二氫鈉0.4g，加蒸餾水至1000 mL，調(diào)整pH到7.2～7.4。枸櫞酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）：枸櫞酸三鈉 3 g，枸櫞酸 0.4 g，加蒸餾水至1000 mL。防脫片劑：APES購自北京中山生物技術(shù)有限公司。甲苯、丙酮、無水乙醇、30%過氧乙酸，均為上海試劑一廠產(chǎn)品。蘇木素、伊紅為北京試劑三廠產(chǎn)品。即用型SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、一抗均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。TUNEL盒購于博海生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型制備 以10%水合氯醛（300 mg/kg體質(zhì)量）腹腔麻醉后俯臥位固定于立體定向儀上。固定大鼠時(shí)，先固定耳間線，待聽到水平針穿破耳鼓膜的破裂聲后，移頭部至正中，接著固定門齒于門齒鉤上，調(diào)整立體定向儀，使門齒鉤平面比耳間線平面低2.4 mm，此時(shí)前后囟基本上在同一平面上。頭部正中皮膚切開長約1 cm的縱切口，血管鉗鈍性分離暴露前囟，調(diào)整立體定向儀，使其上的微量注射儀套管尖端移至前囟后0.5 mm，左側(cè)中線旁開3 mm，用微型電鉆鉆孔，穿透顱骨但不傷及腦組織。用40℃水溫浴大鼠尾巴約10min后取出擦干，在距離大鼠尾巴末端約5 mm處剪斷鼠尾，用微量注射儀吸取新鮮血液約50 μL，迅速插入已鉆好的孔內(nèi)，向內(nèi)進(jìn)針6 mm（相當(dāng)于尾狀核部位）。在2min內(nèi)勻速注入10 μL血液，停針2min，再在2min內(nèi)勻速注入40 μL血液，留置4min后，將針頭提升2 mm，再留置8min，然后緩慢將微量注射器針頭拔出，用醫(yī)用骨蠟封閉骨孔。觀察無出血后，縫合頭部皮膚，加壓包扎尾部切口。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià) 術(shù)后1 h左右，造模大鼠清醒后即開始進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)，根據(jù)Bederson神經(jīng)體征評(píng)分法［7］進(jìn)行分級(jí)。輕抓鼠尾，提起高于桌面10 cm，正常大鼠前爪伸直。0級(jí)（0分）：無神經(jīng)功能缺損。1級(jí)（1分）：血腫對(duì)側(cè)前肢回收屈曲于腹下，同側(cè)前肢向地面伸展。2級(jí)（2分）：1級(jí)體征加俯臥于桌面時(shí)從血腫側(cè)向?qū)?cè)推大鼠時(shí)阻力降低。3級(jí)（3分）：1級(jí)體征加2級(jí)體征加大鼠行走向血腫對(duì)側(cè)肢體旋轉(zhuǎn) （呈追尾狀）。4級(jí)（4分）：意識(shí)喪失不能行走。

1.5 針刺穴位與方法 大鼠腧穴定位根據(jù)《動(dòng)物針灸穴位圖譜》，針刺組選取內(nèi)關(guān)、人中針刺，內(nèi)關(guān)用捻轉(zhuǎn)瀉法1min，人中用雀啄手法10次。各針刺組分別于造模成功后相應(yīng)時(shí)間開始針刺，3 h針刺組在造模成功后3 h開始介入針刺，9 h針刺組在造模成功后9 h開始介入針刺，24 h針刺組在造模成功后24 h開始介入針刺，48 h針刺組在造模成功后48 h開始介入針刺，均每日針刺2次，連續(xù)針刺3 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 模型組與針刺組均于造模成功后5 d處死，用斷頭器將大鼠斷頭處死，小心剝離顱骨，取出完整腦組織，以左側(cè)大腦半球中部注射針眼處為中點(diǎn)，冠狀位切割腦組織，層厚約2 mm，用于免疫組化，在注射針眼處后4 mm的層厚約1 mm的組織用于腦含水量測定。將應(yīng)用免疫組化方法的組織固定在4%多聚甲醛中24 h，標(biāo)本依次梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，在石蠟切片機(jī)上連續(xù)切片，片厚5 μm，相鄰切片分別作免疫組化和TUNEL染色，相關(guān)方法按照試劑盒說明。

1.7 判斷標(biāo)準(zhǔn) （1）免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)。以細(xì)胞胞漿或細(xì)胞核出現(xiàn)黃色顆粒為陽性，對(duì)每張玻片取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)，然后計(jì)算每個(gè)高倍視野下陽性細(xì)胞的均數(shù)。（2）TUNEL染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)。高倍鏡下可見TUNEL陽性細(xì)胞大部分為核呈棕黃色或棕褐色，標(biāo)記細(xì)胞核有明顯固縮、碎裂，少量為彌漫性淡染的核。前者是要計(jì)數(shù)的凋亡細(xì)胞。每張切片光鏡下（×400）分別隨機(jī)計(jì)算5個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)，以平均值代表計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。各項(xiàng)檢測結(jié)果以（）記錄，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組動(dòng)物Bcl-2在血腫周圍的表達(dá)情況 見表1。各針刺組分別與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；3 h針刺組與9 h針刺組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余各針刺組之間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05）。正常組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平較低，僅見少數(shù)該細(xì)胞胞漿著色；模型組大鼠腦血腫周圍腦組織表達(dá)水平明顯增高，胞漿著色且著色較深。針刺組各組血腫周圍也有不同程度的表達(dá)，按表達(dá)水平從高到低依次為3 h針刺組、9 h針刺組、24 h針刺組、48 h針刺組。

表1 各組Bcl-2表達(dá)水平比較（）

表1 各組Bcl-2表達(dá)水平比較（）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與 3 h 針刺組比較，**P＜0.05；與9 h 針刺組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與 24 h 針刺組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01。下同。

2.2 各組動(dòng)物Bax在血腫周圍的表達(dá)情況 見表2。各針刺組分別與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05或0.01）；3 h針刺組與9 h針刺組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余各針刺組之間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。正常組大鼠腦組織中Bax蛋白的表達(dá)水平較低，僅見少數(shù)該細(xì)胞胞漿著色；模型組大鼠腦血腫周圍腦組織表達(dá)水平明顯增高，胞漿著色且著色較深。針刺組各組血腫周圍也有不同程度的表達(dá)，按表達(dá)水平從低到高依次為3 h針刺組、9 h針刺組、24 h針刺組、48 h針刺組。

表2 各組Bax表達(dá)水平比較（）

表2 各組Bax表達(dá)水平比較（）

組 別 n空白組 10模型組 103 h針刺組 10陽性細(xì)胞數(shù)4.27±1.3123.03±2.8115.33±1.94△△9 h 針刺組 10 15.96±1.84△△24 h 針刺組 10 18.21±1.84△△**☆48 h 針刺組 10 20.58±2.46△**☆☆●

2.3 各組動(dòng)物HSP70在血腫周圍的表達(dá)情況 見表3。各針刺組分別與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；3 h針刺組與9 h針刺組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余各針刺組之間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。正常組大鼠腦組織中HSP70蛋白的表達(dá)水平較低，僅見少數(shù)該細(xì)胞胞漿著色；模型組大鼠腦血腫周圍腦組織表達(dá)水平明顯增高，胞漿著色且著色較深。針刺組各組血腫周圍也有不同程度的表達(dá)，按表達(dá)水平從高到低依次為3 h針刺組、9 h針刺組、24 h針刺組、48 h針刺組。

2.4 各組動(dòng)物凋亡細(xì)胞在血腫周圍的表達(dá)情況 見表4。各針刺組分別與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；3 h針刺組與9 h針刺組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余各針刺組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05）。正常組大鼠腦組織中各視野偶見TUNEL陽性細(xì)胞。模型組大鼠腦血腫周圍腦組織表達(dá)水平明顯增高，胞漿著色且著色較深。針刺組各組血腫周圍腦組織也有不同程度的表達(dá)，按表達(dá)水平從低到高依次為3 h針刺組、9 h針刺組、24 h針刺組、48 h針刺組。

表3 各組HSP70表達(dá)水平比較（）

表3 各組HSP70表達(dá)水平比較（）

表4 各組凋亡細(xì)胞表達(dá)水平比較（）

表4 各組凋亡細(xì)胞表達(dá)水平比較（）

3 討 論

本研究采用立體定向技術(shù)向大鼠左側(cè)腦基底節(jié)注入自體定量不凝血制作腦出血模型［8］?；坠?jié)是大鼠腦內(nèi)最大的核團(tuán)，易于立體定向，也是人類腦出血好發(fā)部位。注入自體不凝血50μL，相當(dāng)于人類腦出血40mL，為臨床最多見出血量。本研究采用兩次注血兩次退針法，可有效地避免自體血從穿刺針孔處溢出及腦室反流。

腦出血后多種因素導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡參與腦出血后某些神經(jīng)細(xì)胞損傷［9-12］，典型的凋亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為最終形成由細(xì)胞膜包裹、含有多少不等核碎片及細(xì)胞質(zhì)的小體，稱之為凋亡小體（apoptosis body），吞噬細(xì)胞快速吞噬凋亡小體。大鼠自體血腦出血后血腫周圍腦組織有Bcl-2/Bax、HSP70表達(dá)及細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax和HSP70在腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中起重要調(diào)控作用。Bcl-2是一種凋亡抑制基因，Bax是一種促抑制基因，通過作用于線粒體而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Bcl-2過度表達(dá)可有效地抑制神經(jīng)元凋亡，但Bax的作用卻相反，且將死的神經(jīng)元Bax表達(dá)增加，Bcl-2則減少，故Bcl-2/Bax的比率可能決定神經(jīng)元存亡［13-16］。HSP70是一種應(yīng)激保護(hù)蛋白，可通過抑制細(xì)胞因子炎癥反應(yīng)，抑制凋亡激活基因Bax表達(dá)，與抑凋亡基因Bcl-2協(xié)同作用，保護(hù)線粒體功能等發(fā)揮抑制凋亡的的作用［17-20］。

中醫(yī)的預(yù)防醫(yī)學(xué)概念主要包括兩方面：未病先防，既病防變。任何疾病都有一定的傳變規(guī)律和發(fā)展趨勢，中醫(yī)十分重視掌握病能病勢，主張?jiān)诩膊∥窗l(fā)生或剛發(fā)生時(shí)就及時(shí)截?cái)嗥鋹盒园l(fā)展的趨勢［21-22］。腦損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上和功能上能夠進(jìn)行重組和代償，部分神經(jīng)可以再生，這是大腦可塑性的生理、生化或形態(tài)學(xué)改變的基礎(chǔ)［23-24］。針刺可加速腦組織的側(cè)支循環(huán)建立，促進(jìn)病灶周圍組織或健側(cè)腦細(xì)胞的重組或代償，更大地發(fā)揮腦的可塑性［25-26］。細(xì)胞凋亡是腦出血血腫周邊腦組織損傷的主要病理生理機(jī)制之一，主要發(fā)生在血腫周圍的缺血半暗帶區(qū)。在腦出血早期及時(shí)有效地治療血腫周圍的半暗帶區(qū)，可抑制細(xì)胞凋亡，提高神經(jīng)功能的恢復(fù)程度。否則，當(dāng)細(xì)胞損害進(jìn)入不可逆階段，即病理損害過程已形成后，就失去了治療的最佳時(shí)機(jī)。

總之，本研究表明，從出血后3 h到出血后48 h各時(shí)間點(diǎn)介入針刺，均可抑制腦組織的細(xì)胞凋亡，但介入時(shí)間越早，對(duì)促凋亡因子Bax陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)降低越顯著，對(duì)抑凋亡因子Bcl-2及HSP70陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)增加越顯著，對(duì)腦組織病理變化改善越明顯，提示干預(yù)時(shí)機(jī)越早，細(xì)胞凋亡損傷越小。針刺治療腦出血大鼠腦組織損傷，介入時(shí)間越早效果越好，在出血后3～9 h進(jìn)行針刺干預(yù)是最佳時(shí)機(jī)，48 h內(nèi)治療仍有意義，可通過抑制細(xì)胞凋亡減輕腦組織的繼發(fā)性損傷。

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