基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實驗驗證探討?zhàn)B陰活胃合劑治療慢性萎縮性胃炎的作用機制

邵昌明　謝姍珊　智勇　曙阿克·哈爾恒　林柏桐　于燕艷　曾斌芳

〔摘要〕 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測養(yǎng)陰活胃合劑治療慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）的活性成分及潛在靶點，通過動物實驗進行驗證PI3K-Akt、信號通路，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法 通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）、SymMap數(shù)據(jù)庫篩選得到中藥的有效活性成分，同時從 GeneCard、OMIM和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫對CAG的靶點進行檢索及篩選；預(yù)測其活性成分與疾病靶點，使用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析篩選節(jié)點，利用STRING數(shù)據(jù)庫分析核心靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)，利用DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點基因進行GO和KEGG富集分析，探討?zhàn)B陰活胃合劑治療CAG的作用機制。實驗驗證：選用SPF級SD雄性大鼠，采用隨機分配法分為空白組及造模組，利用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine， MNNG）及饑飽失常法等方法進行造模，造模成功后隨機分為模型組、維酶素組以及養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組，每組10只，連續(xù)干預(yù)56 d；通過HE染色觀察各組SD大鼠胃黏膜病理組織的變化，IHC檢測各組大鼠胃黏膜PI3K、AKT1、mTOR中蛋白的表達含量。結(jié)果 從養(yǎng)陰活胃合劑中篩選出309個化學(xué)成分，涉及治療CAG的靶點378個；篩選疾病靶點698個，共同靶點130個，根據(jù)節(jié)點自由度≥平均自由度，篩選核心靶點38個；通過GO、KEGG富集分析得到，養(yǎng)陰活胃合劑可以影響PI3K-Akt、TNF信號通路、MAPK信號通路、癌癥相關(guān)等多個信號通路。養(yǎng)陰活胃合劑能夠有效降低CAG模型大鼠胃組織中PI3K、AKT1、mTOR中蛋白表達情況（P<0.05）。結(jié)論 養(yǎng)陰活胃合劑通過多通路、多靶點治療CAG，可以有效改善CAG模型大鼠胃黏膜細胞的增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)等，有效調(diào)控PI3K/Akt信號通路，能夠有效改善CAG大鼠胃黏膜的損傷。

〔關(guān)鍵詞〕 養(yǎng)陰活胃合劑；慢性萎縮性胃炎；胃黏膜；活性成分；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；作用機制

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.013

Mechanism of action of Yangyin Huowei Mixture in treating chronic atrophic gastritis based on network pharmacology and experimental verification

SHAO Changming1， XIE Shanshan1， ZHI Yong1， SHUAK Harheng1， LIN Baitong2， YU Yanyan1， ZENG Binfang1*

1. Xinjiang Medical University Institute of TCM， Urumqi， Xinjiang 830011， China; 2. Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150006， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To predict the active ingredients and potential targets of Yangyin Huowei Mixture （YYHWM） in treating chronic atrophic gastritis （CAG） based on network pharmacology， and to provide scientific basis for clinical application through animal experimental verification of PI3K-Akt， signaling pathways. Methods The effective active ingredients of Chinese medicine were screened by traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP） and SymMap database， and the targets of CAG were searched and screened from GeneCard， OMIM and DisGeNET database. To predict the active ingredients and disease targets， the network diagram was constructed by Cytoscape 3.7.1 software and the nodes were screened by topological analysis of the network. The protein-protein interaction （PPI） network of the core target was analyzed by STRING database. GO and KEGG enrichment analysis was performed on the core target genes using DAVID database to explore the mechanism of YYHWM in treating CAG. Experimental verification： SPF SD male rats were selected and randomly divided into blank group and model group. N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine （MNNG） and hunger-satiety disorder were used for modeling. After successful modeling， they were randomly divided into model group， vitamycin group， low-， medium- and high-dose YYHWM groups， with 10 rats in each group， and were continuously intervened for 56 d. The pathological changes of gastric mucosa in SD rats were observed by HE staining. The expressions of PI3K， AKT1 and mTOR in gastric mucosa of rats in each group were determined by IHC. Results A total of 309 chemical ingredients were screened from YYHWM， involving 378 targets for treating CAG; a total of 698 disease targets and 130 common targets were screened， and 38 core targets were screened according to the the nodal degree of freedom ≥ average degree of freedom. Through GO and KEGG enrichment analysis， YYHWM can affect PI3K-Akt， TNF signaling pathway， MAPK signaling pathway， cancer-related and other signaling pathways. YYHWM can effectively reduce the protein expressions of PI3K， AKT1 and mTOR in gastric tissue of CAG model rats （P<0.05）. Conclusion Through multi-pathway and multi-target treatment of CAG， YYHWM can effectively alleviate the proliferation， the apoptosis and inflammatory response of gastric mucosal cells in CAG model rats， and regulate PI3K/Akt signaling pathway， thus reducing gastric mucosal injury in CAG rats.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yangyin Huowei Mixture; chronic atrophic gastritis; gastric mucosa; active ingredients; network pharmacology; mechanism of action

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）大部分由于幽門螺桿菌（helicobacter pylori， HP）感染及自身免疫功能缺陷致使胃黏膜內(nèi)固有腺體萎縮、減少、胃黏膜變薄而引起的疾病[1-3]，嚴重可能發(fā)展成為伴腸上皮化生或異型增生的疾病，最后發(fā)展成為胃癌[4]，是腸型胃癌Correa模式的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。西醫(yī)治療主要是以對癥治療為主，比如消炎保護胃黏膜、促進胃腸道蠕動、根除HP以及抗氧化治療[6]，對于部分患者的治療可能效果不明顯。經(jīng)研究及臨床試驗表明，中藥復(fù)方治療CAG具有突出的效果，并且預(yù)后較好，對藥物依賴性比較小。中藥復(fù)方具有“多成分、多靶點、多途徑”的特點[7]，因此，中醫(yī)治療CAG具有巨大優(yōu)勢，在治療中可以改善胃黏膜的萎縮癥狀，防止病情的蔓延，并且能夠?qū)崿F(xiàn)萎縮的逆轉(zhuǎn)[8]。

中醫(yī)學(xué)將CAG歸屬為“胃痞”“呃逆”“胃脘痛”“痞滿”等范疇[9]。CAG主要是由于外邪入侵、情志內(nèi)傷及飲食不潔而引起的，致使脾失健運，胃失和納，肝郁氣滯，肝胃不和，痰濕阻滯，痰瘀互結(jié)，氣血運行失常，致使胃黏膜發(fā)生萎縮甚至發(fā)展成為腸化生[10]，應(yīng)以“活血化瘀，益氣養(yǎng)胃”為治療大法?！梆B(yǎng)胃陰”的思想在古代就已經(jīng)流行，養(yǎng)陰活胃合劑是曾斌芳教授的經(jīng)驗方[11-12]，經(jīng)過組方加減及臨床研究，得到了養(yǎng)陰活胃合劑，對于臨床的治療具有豐富的經(jīng)驗。圍繞CAG的發(fā)病機制，以活血化瘀、益氣養(yǎng)胃為原則，“養(yǎng)陰”意為滋陰生津，“活胃”意為活血化瘀，從而推動胃腸動力，促進蠕動，使萎縮恢復(fù)，目前養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG在臨床上取得了很好的療效，通過前期臨床實驗研究，證實了養(yǎng)陰活胃合劑可以治療多種證型的CAG[13]。養(yǎng)陰活胃合劑是由蘆根、莪術(shù)、甘草、玉竹、茜草、白術(shù)、雞內(nèi)金組成，具有活血化瘀、益氣養(yǎng)胃的功效。方中君藥蘆根止嘔、生津止渴、滋養(yǎng)胃內(nèi)津液；莪術(shù)破血行氣、消積止痛。臣藥玉竹養(yǎng)陰潤燥、生津止渴能夠顧護胃陰；茜草入脾胃經(jīng)，涼血止血、活血化瘀。佐藥白術(shù)健脾益氣、化濁和胃；雞內(nèi)金寬中健脾、消食磨胃。使藥甘草健脾益氣，調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏活血化瘀、益氣養(yǎng)胃之功。因此，本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來挖掘養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的主要靶點并進行實驗驗證，來探討?zhàn)B陰活胃合劑的對于臨床應(yīng)用的作用機制。

1 資料與方法

1.1? 實驗藥物、藥品和試劑

蘆根30 g（批號：20210901）、莪術(shù)9 g（批號：201001）、玉竹10 g（批號：200301）、茜草9 g（批號：191201）、白術(shù)10 g（批號：200601）、雞內(nèi)金9 g（批號：210301）、甘草6 g（批號：201002），以上藥材均購自于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（MNNG，上海羅恩試劑，批號：RH222415）；鹽酸雷尼替丁膠囊（云鵬醫(yī)藥集團有限公司，批號：E210303）；雷尼替丁大鼠飼料（含3%的雷尼替?。┯尚陆t(yī)科大學(xué)動物實驗中心制作；維酶素膠囊（德州博誠制藥有限公司，批號：w20210401）；無水乙醇、氯化鈉AR分析純（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，批號20220201、20210601）；無菌去離子水、中性樹膠（北京索萊寶科技有限公司，批號：F0020、1117L021）；4%多聚甲醛通用型組織固定液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：BA02198228）；蘇木素染液、伊紅染液（Biosharp公司，批號：21236146）；黏附載玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司，REF.188105）；兔二步法試劑盒、封閉用羊血清、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號分別為2241D0301、228060225、21110301、224020208）；PI3K、AKT1、mTOR抗體（美國Abcam試劑公司，批號分別為ab151549、ab81283、ab32028）。

1.2? 動物

健康雄性SD大鼠SPF級別選用4～5周齡，體質(zhì)量為180～220 g，購買于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，采用架式籠養(yǎng)，維持室溫在19～22 ℃，晝夜明暗交替12 h，許可證號：SCXK（新）2018-0002。該實驗通過新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心倫理委員會審批（審批號：IACUC-20210331-03）。

1.3? 儀器

EG1150型組織包埋機、RM2235型石蠟切片機、CV5030封片機（德國LEICA公司）；XSP-C204型光學(xué)顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；電子秤（AB104-N，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.4? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.4.1? 養(yǎng)陰活胃合劑有效活性化學(xué)成分的篩選及其靶點的預(yù)測? 通過TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、SymMap（http：//www.symmap.org/）數(shù)據(jù)庫收集養(yǎng)陰活胃合劑中蘆根、甘草、莪術(shù)、玉竹、茜草、白術(shù)的成分，設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，獲得有效成分，雞內(nèi)金通過SymMap數(shù)據(jù)庫獲取有效化學(xué)成分，F(xiàn)DR（BH）<0.05，再通過TCMSP輸入有效化學(xué)成分，同上篩選條件，得到雞內(nèi)金的有效活性成分。

1.4.2? 有效成分的靶點預(yù)測? 通過TCMSP、SymMap數(shù)據(jù)庫將有效活性成分通過UniProt數(shù)據(jù)庫中查詢成分并設(shè)置已被認證的Reviewed，設(shè)置生物物種為Homo sapiens，來獲取藥物的有效成分靶點，查閱文獻獲取相關(guān)藥物成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用SMILES格式保存，對無法直接獲取的活性成分，利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫來繪制2D結(jié)構(gòu)獲取。

1.4.3? CAG靶點的預(yù)測? 通過OMIM、DisGeNET和GeneCard數(shù)據(jù)庫對CAG的靶點進行檢索，輸入“Chronic atrophic gastritis”，查詢CAG靶點，通過3個數(shù)據(jù)庫的整合，去除重復(fù)項及刪除假陽性來獲取疾病的靶點。

1.4.4? 養(yǎng)陰活胃合劑的靶點與CAG的相關(guān)靶點的相互作用及網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建? 通過Venny 2.1.0分別將養(yǎng)陰活胃合劑和CAG的靶點錄入在線作圖工具平臺上，來繪制韋恩圖，獲得兩者交集的靶點蛋白。用Cytoscape 3.7.1軟件進行構(gòu)建養(yǎng)陰活胃合劑成分、靶點及疾病的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4.5? PPI絡(luò)拓撲分析及核心靶點的選擇? 通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫輸入藥物和疾病共同靶點，選擇蛋白種類為“Homo sapiens”獲取相關(guān)信息，將結(jié)果導(dǎo)出為TSV格式，通過Cytoscape 將文件導(dǎo)入進行拓撲分析，通過選擇節(jié)點自由度≥平均自由度，篩選出核心靶點，導(dǎo)出文件。在通過STRING數(shù)據(jù)庫將得到的核心靶點輸入來繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4.6? GO功能和KEGG通路富集分析? 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對重要靶點進行GO和KEGG分析，物種選擇人類（Homo sapiens），統(tǒng)計學(xué)方法運用超幾何法以P＜0.01評估GO注釋中的蛋白質(zhì)群，以P值反映蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的突出性，選擇生物過程（biological process， BP）、細胞組分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）。通過對重要靶點進行KEGG富集分析，分析中藥復(fù)方靶點具有的生物學(xué)功能及信號傳導(dǎo)通路，進而得到養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的主要作用通路。

1.5? 動物實驗驗證

1.5.1? 實驗動物造模? 選取健康SD雄性大鼠60只，采用隨機數(shù)字表法隨機分組：空白組10只、造模組50只；空白組采取普通飼養(yǎng)，其他50只進行造模，造模組參考文獻改良的四因素法進行造模[14-15]。（1）采用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）：150 μg/mL MNNG溶液每天飲用，全程避光；（2）鹽酸雷尼替?。褐谱骱?%雷尼替丁的特殊飼料進行隔日喂養(yǎng)；（3）饑飽失常法：即每周一、周三、周五飽食，每周二、周四、周六、周日禁食，不禁水，禁食日來灌胃；（4）禁食日進行隔天灌胃，周二、周六進行空腹灌胃15% NaCl 溶液2 mL/100 g，周四、周日進行空腹灌胃30%乙醇1 mL/100 g；持續(xù)造模10周，在第10周隨機抽取空白組和模型組各一只大鼠空腹12 h，進行麻醉解剖，取全胃，使用HE染色，光鏡下觀察CAG大鼠胃黏膜的病理變化，可以觀察腺體萎縮，減少，病理分析采取全國慢性胃炎的中西醫(yī)結(jié)合診治方案意見中的病理診斷為標準[16]。造模成功后，將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、維酶素組以及養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組。

1.5.2? 實驗動物分組及處理? 空白組不進行藥物干預(yù)，進行正常飼養(yǎng)；造模成功后，于第11周開始進行藥物干預(yù)，干預(yù)組停止飲用MNNG及特殊飼料喂養(yǎng)，恢復(fù)飲用正常水和正常飼料。各組藥物干預(yù)時間每天1次，連續(xù)給藥56 d，模型組不進行藥物干預(yù)，繼續(xù)飲用MNNG及特殊飼料；養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組按照成人與大鼠的體表面積換算等效劑量[17]，以1∶2∶4的比例給藥，低劑量組中藥飲片量3.55 g/kg、中劑量組中藥飲片量7.11 g/kg，高劑量組中藥飲片量14.22 g/kg；維酶素組藥量0.16 g/kg。大鼠最后一次灌胃干預(yù)后，禁食24 h，水正常給予，次日進行麻醉解剖以10%水合氯醛（0.3 mL/kg）腹腔注射進行麻醉，取全胃，生理鹽水清理，分離后迅速放入4%多聚甲醛固定液及凍存管放入液氮中，-80 ℃冰箱存放。

1.5.3? HE染色觀察胃黏膜組織病理變化? 胃組織固定，脫水，石蠟包埋切片，烤片1 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，蘇木素染色，1％鹽酸乙醇分化，PBS返藍，伊紅染色，乙醇梯度脫水、二甲苯脫蠟，中性樹膠封片，光鏡下多倍視野進行觀察SD大鼠胃黏膜的病理情況。

1.5.4? IHC法觀察胃黏膜組織PI3K、AKT1、mTOR含量表達情況? 將石蠟切片在烤片機上60 ℃ 1 h后，二甲苯透明，乙醇梯度脫蠟，檸檬酸鹽修復(fù)，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加一抗（PI3K，1∶100抗體稀釋液稀釋；AKT1，1∶250抗體稀釋液稀釋；mTOR，1∶400抗體稀釋液稀釋）孵育過夜大于16 h，滴加酶標山羊抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育20 min，DAB顯色。蘇木素染核，1％鹽酸乙醇注液分化，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析。

1.6? 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 8.0.2對實驗結(jié)果進行分析，采用“ｘ±s”表示，多組間采取平均數(shù)比較，單因素方差分析，各組間比較單因素ANOVA分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析

2.1.1? 養(yǎng)陰活胃合劑的有效成分? 從TCMSP、SymMap數(shù)據(jù)庫獲得養(yǎng)陰活胃合劑有效成分309種，其中蘆根1種、莪術(shù)23種、玉竹8種、茜草168種、白術(shù)7種、雞內(nèi)金10種、甘草92種，其中2種及以上中藥所共有成分為2種。

2.1.2? 作用靶點的篩選? 獲取的有效活性成分經(jīng)Uniport轉(zhuǎn)換疾病靶點，經(jīng)過去除重復(fù)項，共獲得養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG靶點378個。通過Cytoscape 3.7.1繪制出藥物成分與靶點之間的關(guān)系圖。詳見圖1。

2.1.3? CAG相關(guān)靶點的篩選? 通過OMIM、DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫對CAG的靶點進行檢索，分別收集了蛋白靶點基因83、203、681個，整合后去除重復(fù)值共獲得698個CAG的相關(guān)蛋白靶點。

2.1.4? 養(yǎng)陰活胃合劑的作用靶點與CAG相關(guān)靶點基因的Venny分析? 將養(yǎng)陰活胃合劑中的378個作用靶點與CAG中698個作用靶點輸入Venny 2.1作圖工具平臺，共獲得130個共同靶點，繪制韋恩圖，得到養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG潛在的活性靶點。

2.1.5? PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析以及核心靶點的篩選? 將獲得的共同靶點輸入到STRING數(shù)據(jù)庫后獲得TSV格式文件后，將信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1選擇自由度（degree）≥平均自由度的節(jié)點后，獲取到重要靶點38個，將核心靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫繪制核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖2。圖中包含38個節(jié)點，159條邊，平均節(jié)點度是8.37，節(jié)點為蛋白，邊與邊是蛋白和蛋白的相互關(guān)系，線條越多顯示各個蛋白之間的關(guān)聯(lián)性越大，核心靶點排在前幾位的分別是PPARG、ALB、MTOR、PTEN、AKT1、CD4、HMOX1、MMP2、CCL2、IL-2。

2.1.6? 重要靶點的富集分析? 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫，將養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的38個核心靶點進行G0富集分析，BP、CC、MF每組按照P值選擇前10個利用微生信繪制條形圖。詳見圖3。

在GO富集分析過程中，主要包括細胞因子介導(dǎo)的信號通路、基因表達的正調(diào)控、耐藥性藥物敏感性/耐藥性、激活平滑肌細胞增殖、對異種生物刺激的反應(yīng)、細胞凋亡抑制等生物過程、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物、細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、蛋白質(zhì)均聚、細胞對缺氧應(yīng)激的反應(yīng)等信號通路。在KEGG富集分析中，應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫，將養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的38個核心靶點進行KEGG富集分析，每組按照P值選擇前30個通過微生信繪制氣泡圖，結(jié)果顯示，養(yǎng)陰活胃合劑可能涉及PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、癌癥相關(guān)等信號通路見圖4。

養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的最主要的研究通路為PI3K-Akt信號通路選擇的研究靶點為PI3K、AKT1、mTOR，胃癌的疾病示意圖見圖5，從圖中可以看出胃癌在發(fā)育不良的階段與PI3K-Akt信號通路最為密切，可以使細胞重生。主要的作用靶點是AKT1、MTOR、EGF、PTEN、EGFR、IL-2、VEGFA、IL-6、CCND1等，通過Cytoscape 3.7.1構(gòu)建養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的KEGG活性成分與靶點之間的關(guān)系圖。詳見圖6。

2.2 養(yǎng)陰活胃合劑治療慢性萎縮性胃炎動物實驗結(jié)果驗證

2.2.1? 大鼠胃黏膜的病理觀察? 經(jīng)HE染色后，光鏡下顯示，空白組胃黏膜細胞排列緊密整齊，腺體大小正常，沒有炎癥增生以及腸化的出現(xiàn)；模型組胃黏膜出現(xiàn)腺體萎縮，排列不規(guī)則，黏膜層可見充血，顯現(xiàn)出炎癥以及腸化現(xiàn)象：與模型組相比，養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組及維酶素組胃黏膜腺體萎縮明顯減少，并未見大量炎癥浸潤，沒有出現(xiàn)腸上皮化生，并且均有不同程度的改變，主要以養(yǎng)陰活胃合劑中劑量組和高劑量組較為明顯。詳見圖7。

2.2.2 養(yǎng)陰活胃合劑對CAG模型大鼠PI3K、AKT1、mTOR含量的影響? 與空白組相比，模型組大鼠胃組織PI3K、AKT1、mTOR的表達量均升高（P<0.05）；與模型組相比，養(yǎng)陰活胃合劑低、中、高劑量組及維酶素組胃組織中PI3K、AKT1、mTOR的蛋白表達量降低（P<0.05）。詳見表1和圖8—10。

3 討論

CAG中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見指出：CAG的確診主要是應(yīng)用醫(yī)學(xué)技術(shù)胃鏡檢查及胃黏膜組織學(xué)檢查，尤其是胃黏膜組織學(xué)檢查的診斷價值更大，可見胃黏膜內(nèi)固有腺體萎縮、黏膜層變薄、伴或不伴腸腺化生和（或）假幽門腺化生等為特征的消化系統(tǒng)疾病。中醫(yī)講究的是辨證論治，對于HP感染的CAG患者，加蒼術(shù)、薏苡仁、黃柏、仙鶴草等，對于細菌的抑制有很好的療效。對一些膽汁反流的患者，加枳實、茯苓、香附、青皮等，對于吐酸、噯氣有一定療效。出現(xiàn)腸上皮化生及癌前病變的患者，可加白花蛇舌草、紫花地丁、半枝蓮、半邊蓮等藥物治療，這些藥物對于胃黏膜的保護及抑制腸上皮化生具有很好的作用[6]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的作用機制，對獲取養(yǎng)陰活胃合劑有效成分及得到的核心靶點進行分析，共獲得有效成分309種，這些可能是治療CAG的重要成分。β-谷甾醇、豆甾醇是植物甾醇類化合物，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)該類物質(zhì)具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化和抗菌等生物活性[18-20]；槲皮素屬于黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、防止血管增生等多種藥理學(xué)活性，槲皮素可以下調(diào)p-PI3K的表達，展現(xiàn)了槲皮素能夠有效誘導(dǎo)CAG的凋亡，與PI3K/AKT信號通路密切相關(guān)，細胞內(nèi)可以降低p-PI3K蛋白的表達，阻止胃上皮細胞免受氧化損傷[21-24]。

本研究預(yù)測出養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的130條信號通路，結(jié)果表明養(yǎng)陰活胃合劑主要通過PI3K/Akt信號通路來治療CAG。PI3K/Akt信號通路主要參與及調(diào)控細胞的增殖和凋亡。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，其結(jié)構(gòu)為調(diào)節(jié)亞基p85及催化亞基p110，具有絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶的活性。文獻研究表明，PI3K在CAG模型大鼠的胃黏膜上表達，PI3K被激活后，p110使PIP2磷酸化后為PIP3，使Akt 的N端PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促使AKT活化[25-26]。磷酸化后作用到下游的mTOR通路，與mTOR發(fā)生磷酸化反應(yīng)，調(diào)控下游基因，使細胞生長，遏制細胞凋亡，抑制了PI3K/AKT信號通路的激活，減少了對于大鼠胃黏膜的損傷，使在CAG過程中出現(xiàn)細胞增殖和凋亡最終引起細胞死亡，進一步阻斷胃癌前病變[27-30]。本研究將大鼠造模之后給予養(yǎng)陰活胃合劑進行干預(yù)，觀察大鼠胃組織PI3K、AKT1、mTOR的蛋白表達情況，模型組中胃組織PI3K、AKT1、mTOR蛋白表達均升高，這說明PI3K、AKT1、mTOR能夠抑制細胞的遷移、侵襲和腫瘤的生長，防止胃癌前病變的發(fā)生，而養(yǎng)陰活胃合劑各組及維酶素組藥物干預(yù)后，胃組織PI3K、AKT1、mTOR中的蛋白表達均下降，進一步驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果，但需臨床研究進一步加以驗證。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測其重要通路 PI3K/Akt信號通路，并進行動物實驗驗證，結(jié)果表明：養(yǎng)陰活胃合劑能有改善CAG模型大鼠胃黏膜組織的病理變化，調(diào)控PI3K/Akt信號通路，抑制細胞的增殖和凋亡，阻斷其癌變，實現(xiàn)萎縮逆轉(zhuǎn)，為臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也有一定的局限性，TCMSP數(shù)據(jù)庫只包括一些草藥的活性成分，其他藥物還需根據(jù)查閱文獻分析其化學(xué)成分來預(yù)測其靶點，中藥復(fù)方也是將各個中藥簡單疊加，人體內(nèi)的代謝也會影響其作用，在后期本團隊將對其他的一些領(lǐng)域繼續(xù)驗證，來進一步闡明養(yǎng)陰活胃合劑治療CAG的研究機制。

參考文獻

[1] 李昆陽， 劉華一. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索丹參飲治療慢性萎縮性胃炎的機制研究[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥， 2020， 13（8）： 1323-1332.

[2] ISLAMI F， SHEIKHATTARI P， REN J S， et al. Gastric atrophy and risk of oesophageal cancer and gastric cardia adenocarcinoma： A systematic review and meta-analysis[J]. Annals of Oncology， 2011， 22（4）： 754-760.

[3] 黃新星. 雷貝拉唑聯(lián)合葉酸及替普瑞酮治療老年幽門螺桿菌陽性慢性萎縮性胃炎的臨床療效[J]. 臨床合理用藥雜志， 2022， 15（1）： 93-95.

[4] YE X S， YU C P， AGGARWAL A， et al. Genomic alterations and molecular subtypes of gastric cancers in Asians[J]. Chinese Journal of Cancer， 2016， 35： 42-48.

[5] 王? 杰， 高云霄， 馬虹宇， 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證探討香連化濁方對慢性萎縮性胃炎的作用機制[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2022， 28（18）： 161-168.

[6] 鄧冬梅. 慢性萎縮性胃炎的臨床治療進展[J]. 臨床醫(yī)藥文獻電子雜志， 2018， 5（85）： 105-106.

[7] 李軍祥， 陳? 誩， 呂? 賓， 等. 慢性萎縮性胃炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見（2017年）[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志， 2018， 26（2）： 121-131.

[8] 范? 明， 王玲玲， 郅扶旻， 等. 慢性萎縮性胃炎證治簡析[J]. 中醫(yī)藥學(xué)刊， 2004， 22（3）： 482-516.

[9] 李賽鶴， 劉? 力， 王捷虹， 等. 基于“和”法探究中醫(yī)藥治療慢性萎縮性胃炎[J]. 陜西中醫(yī)， 2020， 41（6）： 793-795.

[10] 馮五金.慢性萎縮性胃炎之中醫(yī)觀[J].中華消化雜志，2021， 41（Z1）： 19-23.

[11] 馬慧娟. 從水通道蛋白AQPs探討?zhàn)B陰活胃合劑治療CAG的作用機制研究[D]. 烏魯木齊： 新疆醫(yī)科大學(xué)， 2021.

[12] 曙阿克·哈爾恒， 謝姍珊， 邵昌明， 等. 養(yǎng)陰活胃合劑對CAG大鼠胃內(nèi)菌群組成及物種差異性分析[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2022， 45（7）： 789-795.

[13] 戴? 明， 雷云霞， 曾斌芳. 養(yǎng)陰活胃合劑治療慢性萎縮性胃炎30例[J]. 陜西中醫(yī)， 2012， 33（1）： 21-23.

[14] 林倚莉， 王煜姣， 賈慶玲， 等. MNNG綜合法誘導(dǎo)大鼠胃癌形成的胃組織學(xué)與超微結(jié)構(gòu)研究[J]. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2021， 24（2）： 8-12.

[15] 馬慧娟， 謝姍珊， 曙阿克·哈爾恒， 等. 養(yǎng)陰活胃合劑對慢性萎縮性胃炎大鼠血清胃蛋白酶原和胃組織水通道蛋白的影響[J]. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2021， 40（4）： 69-74.

[16] 張萬岱， 陳治水， 危北海， 等. 慢性胃炎的中西醫(yī)結(jié)合診治方案（草案）[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志， 2004， 12（5）： 314-317.

[17] 陳? 奇. 中藥藥理研究方法學(xué)[M]. 2版. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2006： 30.

[18] 任建敏. 食物中植物甾醇生理活性及藥理作用研究進展[J]. 食品工業(yè)科技， 2015， 36（22）： 389-393， 399.

[19] SALEHI B， QUISPE C， SHARIFI-RAD J， et al. Phytosterols： From preclinical evidence to potential clinical applications[J]. Frontiers in Pharmacology， 2020， 11： 599959.

[20] 陳元堃， 曾? 奧， 羅振輝， 等. β-谷甾醇藥理作用研究進展[J]. 廣東藥科大學(xué)學(xué)報， 2021， 37（1）： 148-153.

[21] 周? 樂， 趙曉莉， 狄留慶， 等. 黃酮類化合物口服吸收與代謝特征及其規(guī)律分析[J]. 中草藥， 2013， 44（16）： 2313-2320.

[22] 祝珊珊， 陸靈松， 畢麗偉， 等. 槲皮素影響胃癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡的研究[J]. 海峽藥學(xué)， 2021， 33（11）： 14-17.

[23] LESJAK M， BEARA I， SIMIN N， et al.. Antioxidant and anti-inflammatory activities of quercetin and its derivatives[J]. Journal of Functional Foods， 2018， 40： 68-75.

[24] WANG Y Y， CHANG C Y， LIN S Y， et al. Quercetin protects against cerebral ischemia/reperfusion and oxygen glucose deprivation/reoxygenation neurotoxicity[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry， 2020， 83： 108436.

[25] 段永強， 鞏子漢， 王麗園， 等. 香砂六君子湯對慢性萎縮性胃炎大鼠胃組織PI3K信號通路相關(guān)因子表達的影響[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志， 2020， 27（3）： 33-38.

[26] 張玉揚， 趙津平， 張? 丹， 等. 沉默CENP-N基因表達對胃癌細胞增殖、凋亡及PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué)， 2022， 43（4）： 426-433.

[27] MAO S， LUO X H， LI Y， et al. Role of PI3K/AKT/mTOR pathway associated oxidative stress and cardiac dysfunction in takotsubo syndrome[J]. Current Neurovascular Research， 2020， 17（1）： 35-43.

[28] 韋? 維， 林壽寧， 汪? 波， 等. 安胃湯對慢性萎縮性胃炎大鼠PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路的影響[J]. 遼寧中醫(yī)雜志， 2018， 45（5）： 1088-1091， 1122.

[29] 鞏子漢， 王艷威， 段永強， 等. 白及多糖對GU模型大鼠胃組織PI3K/Akt的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2020， 26（6）： 52-57.

[30] WANG L L， ZHANG L， CUI X F. Downregulation of long noncoding RNA LINC01419 inhibits cell migration， invasion， and tumor growth and promotes autophagy via inactivation of the PI3K/Akt1/mTOR pathway in gastric cancer[J]. Therapeutic Advances in Medical Oncology， 2019， 11： 1-16.