四磨湯對心力衰竭大鼠腸道菌群及氧化三甲胺的影響

周慧　肖長江　夏相宜　鄢磊　尹曉芳　莫凌　王孟可

〔摘要〕 目的 觀察腸道-氧化三甲胺（trimethylamine oxide， TMAO）-心力衰竭（heart failure， HF）軸上四磨湯對HF大鼠腸道菌群及TMAO的影響，初步探討四磨湯從腸道菌群方面防治HF的可能機(jī)制。方法 選用40只雄性大鼠，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、四磨湯對照組、模型組、四磨湯模型組，每組10只。對照組、四磨湯對照組予生理鹽水2.5 mg/kg腹腔注射；模型組、四磨湯模型組予異丙腎上腺素2.5 mg/kg腹腔注射造模，4組大鼠連續(xù)4周腹腔注射結(jié)束后，連續(xù)灌胃治療2周。對照組、模型組予生理鹽水7.56 mL/kg灌胃，每日1次；四磨湯對照組、四磨湯模型組予四磨湯7.56 mL/kg灌胃，每日1次。使用液相色譜-質(zhì)譜法檢測血漿TMAO，ELISA法檢測血清氨基端前腦鈉素（N-terminal pro-brain natriuretic peptide， NT-proBNP），16S rRNA檢測糞便樣本，生物信息學(xué)方法分析與比較樣品間的菌群結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果 模型組、四磨湯模型組TMAO、NT-proBNP含量均明顯高于對照組（P＜0.05，P＜0.01），四磨湯模型組TMAO、NT-proBNP含量均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。與對照組相比，四磨湯對照組乳酸桿菌含量明顯升高（P＜0.05），腸球菌含量明顯減少（P＜0.05）；模型組乳酸桿菌、普氏菌、雙歧桿菌含量均明顯減少（P＜0.05），腸球菌、大腸埃希菌含量均明顯升高（P＜0.05）；四磨湯模型組普氏菌含量明顯減少（P＜0.05），腸球菌、大腸埃希菌含量均明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，四磨湯模型組普氏菌含量明顯升高（P＜0.05），腸球菌、大腸埃希菌含量均明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 四磨湯可以降低HF大鼠TMAO、NT-proBNP含量，其機(jī)制可能與四磨湯改變HF大鼠腸道菌群、腸道-TMAO-HF軸相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 心力衰竭；四磨湯；腸道菌群；氧化三甲胺；氨基端前腦鈉素；生物信息學(xué)

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.006

Effects of Simo Decoction on intestinal flora and TMAO in rats with heart failure

ZHOU Hui XIAO Changjiang XIA Xiangyi YAN Lei YIN Xiaofang MO Ling WANG Mengke

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Hospital of Hunan

Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Simo Decoction on intestinal flora and trimethylamine oxide （TMAO） in rats with heart failure （HF） on intestinal-TMAO-HF axis， and to preliminarily explore the possible mechanism of Simo Decoction in preventing and treating HF from the intestinal flora. Methods Forty male rats were selected and divided into control group， Simo Decoction control group， model group and Simo Decoction model group by random number table method， with 10 rats in each group. The control group and Simo Decoction control group received intraperitoneal injection of normal saline 2.5 mg/kg; model group and Simo Decoction model group were given isoprenaline 2.5 mg/kg to establish model by intraperitoneal injection. After 4 weeks of intraperitoneal injection， the rats in 4 groups were continuously treated with gastric gavage for 2 weeks. The control group and the model group were given normal saline 7.56 mL/kg by gastric gavage， once a day; the Simo Decoction control group and Simo Decoction model group were given Simo Decoction 7.56 mL/kg by gastric gavage， once a day. liquid chromatograph-mass spectrometer was used to determine rat plasma TMAO， ELISA was used to measure N-terminal pro-brain natriuretic peptide （NT-proBNP） in rat serum， 16S rRNA was used to examine rat stool samples， and bioinformatics method was used to analyze and compare flora structure characteristics among samples. Results The TMAO and NT-proBNP content in plasma in model group and Simo Decoction model group was significantly higher than that in control group （P<0.05， P<0.01）， and the TMAO and NT-proBNP content in plasma in Simo Decoction model group was lower than that in model group （P<0.05， P<0.01）. Compared with control group， the content of Lactobacillus dramatically increased in Simo Decoction control group （P<0.05）， the content of Enterococcus decreased significantly （P<0.05）; the content of Lactobacillus， Prevotella and Bifidobacterium dramatically decreased in model group （P<0.05）， the content of Enterococcus and Escherichia coli increased significantly （P<0.05）; the content of Prevotella dramatically decreased in Simo Decoction model group （P<0.05）， the content of Enterococcus and Escherichia coli increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the content of Prevotella dramatically increased in Simo Decoction model group （P<0.05）， the content of Enterococcus and Escherichia coli decreased significantly （P<0.05）. Conclusion Simo Decoction can reduce the content of TMAO and NT-proBNP in HF rats， and the mechanism may be related to the change of intestinal flora and intestinal-TMAO-HF axis in HF rats induced by Simo Decoction.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 heart failure; Simo Decoction; intestinal flora; trimethylamine oxide; N-terminal pro-brain natriuretic peptide; bioinformatics method

心力衰竭（heart failure， HF）是由多種原因?qū)е碌男呐K結(jié)構(gòu)和（或）功能的異常改變，使心室收縮和（或）舒張功能發(fā)生障礙，從而引起的一組復(fù)雜臨床綜合征，亦為各種心血管病的終末期表現(xiàn)。我國的HF患者基數(shù)大、發(fā)病率高。我國的心血管病患病率現(xiàn)在處于持續(xù)上升階段，2019年我國農(nóng)村和城市因心血管病死亡的人數(shù)分別占總死亡人數(shù)的46.74%和44.26%，我國現(xiàn)有心血管病患病人數(shù)3.3億人，其中，HF 890萬人[1]。目前，我國的住院患者中的HF患者的平均年齡呈上升趨勢，感染是導(dǎo)致HF發(fā)作最常見的誘因，HF患者住院病死率為4.1%[2]。HF會引起多種病理反應(yīng)，HF患者可有疲乏、無力、頭暈、食欲不振、腹部不適等表現(xiàn)。腸道假說暗示HF伴血流動(dòng)力學(xué)改變，全身性充血增加可導(dǎo)致腸黏膜充血、水腫，黏膜屏障受損，從而導(dǎo)致細(xì)菌移位及循環(huán)內(nèi)毒素增加，此種情況可能導(dǎo)致HF患者潛在炎癥發(fā)生[3]，使患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加。在某種程度上，腸道也被認(rèn)為是人體的“功能器官”[4]。正常情況下，腸道菌群與人類宿主和諧共生，其具有幫助宿主獲取營養(yǎng)和促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育等功能[5]。但當(dāng)腸道菌群出現(xiàn)紊亂時(shí)，也會與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如帕金森病、阿爾茨海默病、原發(fā)性高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖癥、糖尿病等[6]。

HF可引起腸道瘀血的病理改變。研究表明，HF患者的腸道菌群會發(fā)生改變，藥物可引起腸道菌群改變[7]，腸道微生物可能通過其代謝影響心臟的代謝健康[8]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道代謝產(chǎn)物氧化三甲胺（trimethylamine oxide， TMAO）是參與HF進(jìn)展強(qiáng)有力的預(yù)后標(biāo)志物，調(diào)節(jié)腸道微生物群的組成和靶向腸道-TMAO-HF軸都可能對HF患者的生存產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[9]。氨基端前腦鈉素（N-terminal pro-brainnatriuretic peptide， NT-proBNP）因其成分穩(wěn)定，可作為HF診斷和評估的生物學(xué)標(biāo)記物。TMAO與HF相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，TMAO和NT-proBNP的組合可為HF提供額外的預(yù)后信息[10]。有團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，隨著HF的進(jìn)展，患者TMAO的濃度逐漸增加[11]。因此，提出猜想，能否通過干預(yù)腸道菌群或相關(guān)酶來降低循環(huán)TMAO水平，從而影響HF患者的預(yù)后。

中醫(yī)藥對于治療疾病有療效佳，不良反應(yīng)少的特點(diǎn)。研究證明，中醫(yī)藥能顯著調(diào)節(jié)腸道菌群失衡，促進(jìn)有益菌生長，抑制有害菌過度繁殖，平衡有益菌和病原菌的數(shù)量，維持健康的腸道環(huán)境[12]。本課題組前期已對四磨湯進(jìn)行了一些研究[13-15]，前期臨床研究發(fā)現(xiàn)四磨湯對改善HF的臨床療效確切有效[16]。因此，本研究選用腸道經(jīng)典方劑四磨湯干預(yù)HF大鼠。本課題組選用的四磨湯由木香、枳殼、檳榔、烏藥4味藥組成，主要功效為降氣順逆，消積止痛。本研究欲探討四磨湯能否調(diào)節(jié)大鼠的腸道菌群及TMAO，以期為四磨湯防治HF提供更為明確的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，購買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號：SYXK（湘）2020-0008。分籠飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，濕度50%～70%。所有動(dòng)物可自由獲得食物和水，普通飼料由湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。本實(shí)驗(yàn)通過湖南省中醫(yī)藥研究院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會認(rèn)證，倫理批號：2021-0070。

1.2? 實(shí)驗(yàn)藥物

四磨湯口服液（湖南漢森制藥股份有限公司，批號：2107118）；異丙腎上腺素（上海禾豐制藥有限公司，批號：41210501）。

1.3? 主要試劑與儀器

NT-proBNP ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：L11031983）；糞便基因組DNA提取試劑盒（批號：#DP328-02）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（批號：#DP209-03）均購自北京天根生化科技有限公司；雙鏈DNA熒光定量檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號：12640ES76）；磁珠（無錫百邁格生物科技有限公司，貨號：BMSX-200）。

超高效液相色譜儀（香港島津企業(yè)管理有限公司，型號：Nexera UHPLC LC-30A）；渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：XW-80A）；低溫高速離心機(jī)（型號：H1656R）、臺式高速冷凍離心機(jī)（型號：H1650R）均購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；超聲儀（杭州信儀科技有限公司，型號：JY92-IIW）；多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號：MB-530）。

2 方法

2.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模

所有大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組和造模組，每組20只。造模組采用異丙腎上腺素每日2.5 mg/kg腹腔注射，連續(xù)4周[17]。正常組腹腔注射生理鹽水每日2.5 mg/kg，連續(xù)4周。造模結(jié)束后，正常組隨機(jī)分為對照組和四磨湯對照組，造模組隨機(jī)分為模型組、四磨湯模型組，每組10只。

2.2? HF大鼠模型評估

造模結(jié)束后，對HF大鼠模型進(jìn)行評估。

2.2.1? 大鼠一般情況? 正常組大鼠活動(dòng)正常，無明顯特殊表現(xiàn)。造模組大鼠精神萎靡，安靜不欲動(dòng)，進(jìn)食減少，毛發(fā)光澤度降低。

2.2.2? 大鼠超聲心動(dòng)圖情況? 從正常組和造模組中各隨機(jī)抽取6只大鼠，進(jìn)行心臟超聲心動(dòng)圖檢查。與正常組比較，模型組左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter， LVEDD）、左室舒張期內(nèi)徑（left ventricular end systolic diameter， LVESD）、室間隔厚度（inter ventricular septal diameter， IVSd）明顯升高（P＜0.01），左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）明顯降低（P＜0.01）。造模組LVEF均值比正常組降低大于20%[18]并結(jié)合兩組的大鼠一般表現(xiàn)情況，可知造模成功。詳見表1。

2.3? 給藥方法

根據(jù)臨床70 kg體質(zhì)量成人每日服藥量進(jìn)行換算，四磨湯口服液成人每日所需總量為60 mL，換算后200 g大鼠每日所需重量為1.08 mL，即5.4 mL/kg[17]。四磨湯對照組、四磨湯模型組予四磨湯每日7.56 mL/kg灌胃[19]，對照組、模型組予生理鹽水每日7.56 mL/kg灌胃。各組均每日灌胃1次，灌胃2周。實(shí)驗(yàn)期間因打斗死亡6只大鼠（模型組4只，四磨湯模型組2只）。每組隨機(jī)抽取6只進(jìn)行后續(xù)的檢測。

2.4? HE染色觀察心肌病理變化

各組大鼠心肌石蠟切片常規(guī)脫蠟，再浸泡、脫洗、浸洗、染色、沖洗、脫水、封片，鏡下觀察組織形態(tài)。

2.5? 血清NT-ProBNP檢測

灌胃2周結(jié)束后，各組大鼠腹主動(dòng)脈采集血清。采用NT-ProBNP ELISA試劑盒檢驗(yàn)血清中NT-ProBNP的含量，具體操作嚴(yán)格按照所檢測指標(biāo)對應(yīng)的說明書進(jìn)行。

2.6? 血漿TMAO含量檢測

灌胃2周結(jié)束后，每只大鼠腹主動(dòng)脈使用紫色采血管采血得血漿。采用液相色譜-質(zhì)譜法檢測大鼠血漿TMAO含量，用峰面積定量TMAO含量，峰面積越大，TMAO含量越多，峰面積無明顯有效單位[20]。按如下步驟進(jìn)行：（1）取100 mol/L血漿與400 mol/L 甲醇/乙腈（體積比1∶1）渦旋30 s，超聲10 min（4 ℃水?。?；（2）在20 ℃下孵育1 h（促進(jìn)蛋白質(zhì)沉淀）；（3）在13 000 r/min（半徑7 cm）4 ℃下離心15 min；（4）取上清液，用真空濃縮器在4 ℃或室溫下蒸發(fā)至干；復(fù)溶100 mol/L乙腈/H₂O（體積比1∶1）；（5）渦旋30 s超聲10 min（4 ℃水?。?；（6）在13 000 r/min（半徑7 cm）和4 ℃下離心15 min；（7）取上清液進(jìn)行檢測；（8）上液進(jìn)行正向和反向色譜分離和質(zhì)譜檢測。質(zhì)譜分離相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：流速0.3 mL/min，進(jìn)樣盤溫度4 ℃，柱溫40 ℃，色譜柱Waters HSS T3 column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）[H₂O（0.1%FA），Acetonitrile進(jìn)樣量：3 μL]。

2.7? 腸道菌群的檢測

灌胃2周結(jié)束后，每只大鼠以提尾法取無菌糞便樣本0.5 g，置于10 mL無菌凍存管中，液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存以備后續(xù)16S rRNA檢測。使用DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA抽提，將大鼠糞便樣本純化，對樣本采用Illumina NovaSeq PE250進(jìn)行16S擴(kuò)增子測序，獲取下機(jī)原始數(shù)據(jù)（Raw Data）。對Raw Data進(jìn)行去接頭、過濾、去重、堿基矯正以及去除嵌合體序列等操作，得到可以用于后續(xù)分析的有效序列。采用Qiime 2對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。參考數(shù)據(jù)庫：silva-132-99，引物名稱：Bacterial V3/V4（341F+805R），引物序列：CTACGGGNGGCWGCAG、GACTACHVGGGTATCTAATCC。

2.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以“ｘ±s”表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 心肌HE染色結(jié)果

對照組、四磨湯對照組HE染色顯示心肌細(xì)胞排列整齊、致密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，形態(tài)完整，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組可以看到心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，形態(tài)紊亂，心肌細(xì)胞腫大和炎性浸潤；四磨湯模型組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)仍有破壞，但較模型組明顯改善，心肌細(xì)胞腫大和炎性浸潤減少，說明四磨湯可對心肌有所改善，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。詳見圖1。

3.2? NT-proBNP的檢測結(jié)果

與對照組相比，模型組、四磨湯模型組NT-proBNP含量均明顯增多（P＜0.01）。與模型組相比，四磨湯模型組NT-proBNP含量明顯減少（P＜0.01）。詳見表2。

3.3? TMAO的檢測結(jié)果

與對照組相比，模型組TMAO含量均明顯增多（P＜0.05）。與模型組相比，四磨湯模型組TMAO含量明顯減少（P＜0.05）。詳見表3。

3.4? 各組大鼠腸道菌群變化

運(yùn)算分類單元（operational taxonomic unit， OUT）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。通常按照97%的相似性閾值將序列劃分為不同的OTU，每一個(gè)OTU通常被視為一個(gè)微生物物種，相似性小于97%就可以認(rèn)為屬于不同的種。以下的分析均建立在此基礎(chǔ)上。每組送3份樣本進(jìn)行相關(guān)測序。

3.4.1? Rarefaction稀釋性曲線? 根據(jù)抽到的序列數(shù)與它們能代表的數(shù)目構(gòu)建曲線，即稀釋曲線。當(dāng)曲線趨于平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量合理；反之則表明測序不足。本研究中稀釋曲線在15 000左右后趨于平穩(wěn)，隨著抽取數(shù)量加大，曲線不再變化，說明本研究測序量足夠，可以覆蓋所有細(xì)菌物種，足以反應(yīng)物種多樣性的真實(shí)情況，可進(jìn)行下一步分析。詳見圖2。

3.4.2? Rank-Abundance曲線? Rank-Abundance曲線可反映物種豐度和物種均勻度兩個(gè)方面，物種豐度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線在橫軸上的范圍越大，物種的豐度越高；物種均勻度由曲線的形狀（平滑度）來反映，曲線越平坦，表示物種的均勻度越高。本研究可知四磨湯對照組大鼠的糞便的物種豐度最高，對照組、四磨湯對照組的物種豐度都大于400，模型組大鼠的糞便物種豐度最低，四磨湯模型組豐度較模型組高。其中對照組的物種均勻度最好。詳見圖3。

3.4.3? 韋恩圖? 根據(jù)分析各組間的OTU繪制韋恩圖?？芍鹘M間共有OUT 256個(gè)，與對照組相比，其與四磨湯對照組共有404個(gè)，與模型組共有330個(gè)，與四磨湯模型組共有458個(gè)。對照組與四磨湯模型組共有OUT含量最多，與模型組共有OUT含量最少。四磨湯模型組特有的OTU為164，其特有數(shù)量最多，對照組100個(gè)，四磨湯對照組112個(gè)，模型組111個(gè)。說明模型組、四磨湯模型組與對照組在菌群種類和數(shù)量上有較大差別，其中四磨湯模型組較模型組與對照組相比差別更少，說明四磨湯可以改善HF大鼠的腸道菌群組成。詳見圖4。

3.4.4? 豐度熱圖? 為進(jìn)一步直觀表現(xiàn)重要類群在不同樣本間的分布，以總豐度排名前20的ASV進(jìn)行作圖，不同的微生物物種標(biāo)記在縱軸上，橫軸表示為樣品編號，顏色偏紅表示含量偏高，顏色偏藍(lán)表示含量偏低?？芍陂T水平上的物種排名前四的為擬桿菌門（Bacteroidia）、厚壁菌門（Firmicutes）、毛螺旋菌（Lachnospirales）、彎曲菌門（Campilobacterota）。在屬水平上，含量較多的有普氏菌屬（Prevotella）、Muribaculaceae、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Lachnospiraceae_NK4A163_group、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、奎因氏菌屬（Quinella）、梭狀芽胞桿菌（Clostridia）。詳見圖5。

3.4.5? 基于屬水平各組大鼠腸道微生物物種（部分）分布情況? 腸道細(xì)菌的種類非常豐富，有研究發(fā)現(xiàn)增加有益菌的豐度可以調(diào)節(jié)人體腸道菌群微生物屬[21]。目前的相關(guān)研究顯示：在厚壁菌門（Firmicutes）[22]這一門類中，乳酸桿菌（Lactobacillus）屬于“有益菌”，腸球菌（Enterococcus）屬于“有害菌”；在擬桿菌門（Bacteroidia）[23]這一門類中，普氏菌（Prevotella）屬于“有益菌”；在放線菌門（Actinobacteriota）這一門類中，雙歧桿菌（Bifidobacterium）[24]屬于“有益菌”；在變形菌門（Proteobacteria）在一門類中，主要為“有害菌”，包括大腸埃希菌（Escherichia coli）。擬桿菌門（Bacteroidia）、厚壁菌門（Firmicutes）為腸道菌群的主要菌門，占據(jù)腸道菌群的95%以上，現(xiàn)選用以上乳酸桿菌（Lactobacillus）、普氏菌（Prevotella）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）的含量進(jìn)行分析。

與對照組相比，四磨湯對照組乳酸桿菌（Lactobacillus）含量明顯升高（P＜0.05），腸球菌（Enterococcus）含量明顯減少（P＜0.05）；模型組乳酸桿菌（Lactobacillus）、普氏菌（Prevotella）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）含量均明顯減少（P＜0.05），腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）含量均明顯升高（P＜0.05）；四磨湯模型組普氏菌（Prevotella）含量明顯減少（P＜0.05），腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）含量均明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，四磨湯模型組普氏菌（Prevotella）含量明顯升高（P＜0.05），腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）含量均明顯減少（P＜0.05）。詳見表4。

4 討論

腸道菌群參與了人體眾多生理、病理過程[25]，它也被稱為“人體的微生物器官”。有研究表明，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可以直接參與人體正常的生理代謝活動(dòng)，并通過炎癥、免疫、代謝等途徑參與心血管病的發(fā)展過程[26]。HF被認(rèn)為與腸道菌群的改變相關(guān)[27]。降低腸道代謝或改變腸道菌群組成可降低HF的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而腸道菌群失調(diào)則促進(jìn)HF的發(fā)生和發(fā)展。KUMMEN等[28]研究發(fā)現(xiàn)，慢性HF患者的腸道菌群成分變化大，細(xì)菌豐度降低。另一項(xiàng)支持性研究表明，通過高纖維飲食和補(bǔ)充醋酸鹽改變腸道菌群，改變腸道菌群可以預(yù)防高血壓和HF[29]。腸道微生物組研究已經(jīng)確定，心血管病和HF中的一些共同特征，包括腸道微生物豐度降低和TMAO循環(huán)水平升高[30]。

本課題組肖長江教授主張“心病從脾論治”，其認(rèn)為HF的病位主要在心，但卻不局限于心。在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，五臟可相互制約，相互影響，其他四臟功能的失調(diào)都能影響HF的疾病進(jìn)程，五臟之中尤以心脾關(guān)系最為密切。肖長江教授認(rèn)為可從調(diào)脾、健脾等方面治療HF[31]。國醫(yī)大師鄧鐵濤教授也認(rèn)為HF與五臟相關(guān)，尤應(yīng)顧護(hù)脾胃[32]。

心與小腸相表里，小腸主化物而分清別濁，其功能障礙必然會造成心血虛弱，心氣不足。研究表明，小腸為體內(nèi)最主要的吸收器官，小腸的組織結(jié)構(gòu)學(xué)特點(diǎn)為小腸的吸收創(chuàng)造了良好的條件，小腸的生理功能表現(xiàn)在小腸的運(yùn)動(dòng)、分泌、消化及吸收等方面，小腸功能失調(diào)可以選用益生菌進(jìn)行治療[33]。在中醫(yī)學(xué)理論中，脾主運(yùn)化，可將化生的水谷精微輸送全身，因此，中醫(yī)學(xué)的脾包括了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)小腸的功能，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)小腸的功能卻不能等同于中醫(yī)學(xué)的小腸。

HF病理狀態(tài)下[34]心血虧虛、心氣虧虛，不能推動(dòng)血液正常運(yùn)行見血脈瘀滯，脾失健運(yùn)，加重病理產(chǎn)物痰濁、瘀血、水飲影響脾胃，運(yùn)化功能減弱使得脾胃功能受阻。脾之消化、吸收等功能減弱，HF病理狀態(tài)下釋放的有害物質(zhì)堆積于腸道可能引起腸道不適，導(dǎo)致腸壁水腫和腸屏障功能受損[3]，出現(xiàn)腹部脹滿等不適。HF會使每搏輸出量減少，從而引起體循環(huán)淤血，進(jìn)而可出現(xiàn)腸道淤血、水腫，甚至缺血，使得腸道的正常結(jié)構(gòu)與功能，正常的腸道微生物組成和含量發(fā)生改變[35]。

研究發(fā)現(xiàn)，服用益生菌或者發(fā)酵乳制品，可以直接影響人體腸道微生物構(gòu)成[36-38]。特定的腸道微生物群依賴性途徑和下游代謝物都會影響宿主代謝和導(dǎo)致心血管病[39]。腸道菌群與靶器官的相互作用通過多種途徑發(fā)生，其中包括腸道-TMAO-HF軸[9]。TMAO為一腸道代謝產(chǎn)物，一項(xiàng)薈萃分析顯示顯示血漿TMAO水平與心血管風(fēng)險(xiǎn)和死亡率增加之間存在正劑量依賴關(guān)系[40]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)四磨湯干預(yù)后的HF大鼠體內(nèi)NT-proBNP的含量較未干預(yù)的HF大鼠明顯減少，提示四磨湯可能對HF治療有促進(jìn)作用。且經(jīng)四磨湯干預(yù)后的HF大鼠心肌損傷也較未干預(yù)的HF大鼠少。HF大鼠體內(nèi)TMAO較非HF大鼠明顯增多，而四磨湯干預(yù)后的HF大鼠TMAO較未干預(yù)的HF大鼠減少，提示HF狀態(tài)下TMAO會增加，四磨湯對HF大鼠體內(nèi)的TMAO含量有負(fù)性作用。根據(jù)TMAO和NT-ProBNP與HF的相關(guān)性聯(lián)系[10]，四磨湯干預(yù)后的HF大鼠TMAO、NT-ProBNP均較未行干預(yù)的HF大鼠指標(biāo)好轉(zhuǎn)，可驗(yàn)證四磨湯確對HF有降低TMAO、NT-ProBNP的作用。提示四磨湯可能通過影響腸道代謝產(chǎn)物TMAO進(jìn)而改善HF指標(biāo)NT-ProBNP，這也驗(yàn)證了心病與脾之功能密切相關(guān)。16S rRNA 結(jié)果顯示，四磨湯組的腸道菌群物種豐度最高，HF狀態(tài)下大鼠的腸道菌群的物種豐度明顯下降，四磨湯干預(yù)后的HF腸道菌群豐度較未干預(yù)的HF腸道菌群豐度升高。HF大鼠的TMAO、NT-ProBNP升高，可能與腸道菌群多樣性降低密切相關(guān)。各組樣本菌屬含量的變化也不盡相同，在觀察到的部分菌屬中，四磨湯干預(yù)的非HF大鼠乳酸桿菌（Lactobacillus）含量升高，腸球菌（Enterococcus）含量減少；HF大鼠腸道菌群里的乳酸桿菌（Lactobacillus）、普氏菌（Prevotella）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）含量減少，腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）含量增高；四磨湯干預(yù)下的HF大鼠較非四磨湯干預(yù)的HF大鼠普氏菌（Prevotella）含量升高，腸球菌（Enterococcus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）含量減少?？烧J(rèn)為HF可減少“有益菌”的含量，增加“有害菌”的含量；四磨湯可增加“有益菌”的含量，減少“有害菌”的含量。這提示四磨湯可以改變腸道菌群的豐度和種類，對不同菌屬的改變也不是單一的。

綜上所述，四磨湯可以通過改變HF患者腸道中微生物種類和含量，降低腸道代謝產(chǎn)物TMAO含量，降低NT-ProBNP從而達(dá)到防治HF的目的。可以期望四磨湯對今后中醫(yī)藥“心病從脾胃論治”治療HF提供一個(gè)新的思路。在對腸道菌群的研究可知，微生物群可以為腸道微生物群如何促進(jìn)HF提供新的見解，多種代謝物都會導(dǎo)致心臟病，TMAO可能只是冰山一角[41]。

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