染色劑在染色玻璃體切除術(shù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

張可人，雷春燕，張美霞

（四川大學(xué)華西醫(yī)院眼科，四川 成都 610000）

染色玻璃體切除術(shù)可以定義為：在玻璃體切除術(shù)中使用眼內(nèi)染色劑改善透明組織的可見性，以便于手術(shù)操作［1］。對于手術(shù)醫(yī)生來說，實(shí)現(xiàn)玻璃體后脫離、徹底清除玻璃體后皮質(zhì)、剝離透明的眼內(nèi)組織是重要且困難的操作步驟。內(nèi)界膜（internal limiting membrane， ILM），厚約10 微米，位于玻璃體與視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層交界面，構(gòu)成Müller 細(xì)胞和玻璃體膠原纖維的附著支架，不恰當(dāng)剝離可能會導(dǎo)致不可逆的視網(wǎng)膜損傷，并伴隨視野缺失以及視網(wǎng)膜色素 上 皮（retinal pigment epithelium， RPE）缺 損［2］。因此，為了改善眼內(nèi)透明組織的可見性，在玻璃體切除術(shù)中使用眼內(nèi)染色劑逐漸普及。各類染色劑由復(fù)雜的有機(jī)分子團(tuán)組成，而特定的化學(xué)基團(tuán)決定了其特別的顏色。本文將對用于染色玻璃體切除術(shù)的各類眼內(nèi)染料做簡要介紹并且簡述新興的眼內(nèi)染色劑。

1 各類眼內(nèi)染料及其特性

1.1 吲哚菁綠

吲哚菁綠（indocyanine green， ICG）是三碳?xì)浠衔?，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用極為廣泛，常用于淋巴水腫、肝移植、尿路修復(fù)及各種癌癥疾病的診斷。在眼科的應(yīng)用歷史可以追溯到1970 年用于眼內(nèi)血管造影展示脈絡(luò)膜血流的狀態(tài)［3］，時至今日，ICG 仍是視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜血管疾病的重要診斷工具。除此之外，ICG 可以用于白內(nèi)障手術(shù)過程中晶狀體前囊染色輔助撕囊［4］。

從生物學(xué)上來說，ICG 顏色特異并具有雙親性，可以很好的附著于ILM 上的細(xì)胞外基質(zhì)成分，例如：膠原纖維、粘連蛋白及層粘連蛋白等。Bruk 等［5］在2000 年首次將0.5%的ICG 用于尸體眼中，發(fā)現(xiàn)可 以 增 強(qiáng)ILM 可 見 性［5］。后 來ICG 被 廣 泛 應(yīng) 用 于眼內(nèi)染色以改善眼內(nèi)透明組織的可見性及提高玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)的成功率。

ICG 導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和RPE 損害機(jī)制可能與ICG 的氧化毒性有關(guān)，目前認(rèn)為ICG 會導(dǎo)致RPE 損傷、視野缺損、潛在的視神經(jīng)萎縮等并發(fā)癥［6］。有研究將不同種類、不同濃度的眼內(nèi)染色劑用于人類Müller 細(xì)胞并測量染料對細(xì)胞的毒性作用，得出ICG 在較短的暴露時間內(nèi)，且其濃度為0.25%時，可作為安全染色劑［7］?；趯CG 滲透毒性、光毒性相關(guān)作用的共識，避免將染料注入黃斑裂孔區(qū)域、降低ICG 的濃度（低于0.5 mg/mL）、降低滲透壓、減少與視網(wǎng)膜接觸時間、減少眼內(nèi)照明系統(tǒng)光照時間及避免照射黃斑區(qū)，對于降低ICG 相關(guān)毒性有一定作用［8］。

1.2 次菁綠

次菁綠（infracyanine green， IfCG）對ILM 有高親和性，與ICG 具有相同化學(xué)公式、類似的藥理學(xué)性質(zhì)、相似的染色特性，兩者主要的區(qū)別在于IfCG不含碘，這有可能降低對角膜及視網(wǎng)膜的毒性作用［9］。Balaiya 等［10］利 用 體 外 細(xì) 胞 實(shí) 驗(yàn) 對 比 吲 哚 菁綠、亮藍(lán)G、IfCG 對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的毒性作用進(jìn)行研究，結(jié)果顯示IfCG 在暴露時間≤15 min 時，表現(xiàn)出最小的細(xì)胞毒性，故相比于IfCG 濃度相關(guān)毒性來說，IfCG 時間相關(guān)的毒性作用似乎更大［。Penha 等［11］在視網(wǎng)膜下分別注射0.5%濃度的IfCG 溶液及0.5 mg/mL 的ICG 溶液，結(jié)果顯示，IfCG 相關(guān)的組織損傷率更低。

盡管IfCG 的價格相對與ICG 更加昂貴，但用于染色玻璃體手術(shù)中IfCG 展示出更低的毒性作用，由于其能被RPE 吞噬并且可以長期存在于細(xì)胞內(nèi)部，帶來持續(xù)的慢性毒性反應(yīng)，仍需進(jìn)一步研究［12］。

1.3 曲安奈德

曲安奈德（triamcinolone acetonide， TA）是不溶于水的合成皮質(zhì)類固醇，早在19 世紀(jì)90 年代被用于眼科治療多種炎癥性疾病，并且TA 是確定玻璃體基底部和后玻璃體的標(biāo)準(zhǔn)試劑，常規(guī)用量為40 mg/mL，0.3 mL。Torrance 等［13］在2020 年報道了眼內(nèi)使用TA 剝離ERM 以及ILM，認(rèn)為TA 對于增強(qiáng)ERM、ILM 的可見性效果等同于或更優(yōu)于傳統(tǒng)的幾類眼內(nèi)染料。TA 進(jìn)入玻璃體腔后，其晶體顆粒與玻璃體膠質(zhì)緊密結(jié)合，在玻璃體纖維中形成的白色顆粒與空腔之間形成強(qiáng)烈對比，增強(qiáng)了玻璃體的可視性。這種方法可以很好地幫助操作者實(shí)現(xiàn)玻璃體后脫離，其手術(shù)安全性已在世界范圍內(nèi)得到認(rèn)可，潛在的好處是減少了再次手術(shù)的發(fā)生率并抑制了術(shù)后血眼屏障的破壞［1］。

總的來說，TA 不僅作為疾病治療藥物，還是一種多用途染料，既可以用作玻璃體增強(qiáng)劑，也可以用 作 視 網(wǎng) 膜 前 膜（epiretinal membrane， ERM）染色劑。

1.4 臺盼藍(lán)

臺盼藍(lán)（trypan blue， TB）是一種偶氮染料，其中包含偶氮鍵和芳香環(huán)，該環(huán)決定其顏色和染料特性。TB 最早于1999 年由Melles 等人用于染色晶狀體前囊并輔助白內(nèi)障術(shù)中撕囊過程［14］。2002 年首次用于玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)［15］。作為眼內(nèi)染色劑，TB是ERM 的理想染料，臨床常規(guī)用量為：（1.2～1.5）mg/mL，（0.2～0.3） mL，注射后常需等待（5～10）s才能開啟眼內(nèi)灌注并繼續(xù)進(jìn)行手術(shù)。對于ILM 的染色效果，TB 差于ICG，但對于ERM 染色，TB 染色效果優(yōu)于ICG［16］。Brazitikos 等［17］觀察了35 例使用TB 輔助內(nèi)界膜剝離的病例，結(jié)果顯示在術(shù)后6 個月，TB 沒有導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度的改變。

TB 被視為一種低毒性的眼內(nèi)染料，但目前研究報道TB 對于視網(wǎng)膜細(xì)胞有毒性作用［18］。TB 主要對ERM 進(jìn)行染色，但對ILM 的染色效果不佳，主要原因是TB 與失活的細(xì)胞成分可以很好的結(jié)合；濃度為0.15%的TB 對于染色來說相對安全［19］。許多研究發(fā)現(xiàn)TB 對視網(wǎng)膜及RPE 無明顯的毒性作用，盡管有報道稱TB 進(jìn)入視網(wǎng)膜下組織導(dǎo)致了RPE 改變但對視力無明顯影響［20］。

1.5 專利藍(lán)

專利藍(lán)（patent blue， PB）是一類酸性的三苯甲烷染劑，衍生自甲烷碳原子團(tuán)的芳基甲烷染料。在醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用，第一次用于腎臟血流學(xué)研究，并在腫瘤活檢中標(biāo)記淋巴結(jié)［21］。該染料2003 年用于眼科，將濃度為0.24%的PB 溶液用在白內(nèi)障手術(shù)中對晶狀體前囊進(jìn)行染色，隨后又用于染色玻璃體手術(shù)中［22］。

關(guān)于PB 相關(guān)的眼內(nèi)毒性研究較少且與目前存在的研究結(jié)論相互矛盾。一項研究發(fā)現(xiàn)，PB 對于視網(wǎng)膜會產(chǎn)生輕微的可逆性毒性反應(yīng)，對于體外的RPE 細(xì)胞，PB 沒有表現(xiàn)出毒性作用［23］。

1.6 亮藍(lán)G

從有報道稱ICG 會引起視網(wǎng)膜毒性變化后，亮藍(lán)G（brilliant blue G， BBG）作為弱親水性三芳基甲烷染料成為ICG 的替代品，因?yàn)樗菼CG 具有更好的生物相容性。BBG 在歐洲被證明是安全的食品添加劑，并且由于其結(jié)構(gòu)特性，已被用于生物領(lǐng)域的蛋白質(zhì)染色。在眼科手術(shù)中，常用于ILM 的染色及晶狀體前囊染色，常規(guī)用量為：0.25 mg/mL，（0.2～0.3） mL，操作同TB。手術(shù)過程中，染料可以滲透到視網(wǎng)膜下組織區(qū)域，視網(wǎng)膜下注射ICG、TB可導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織及功能損傷，但BBG 不會存在損傷［24］。有研究報道了關(guān)于BBG 對于體外實(shí)驗(yàn)帶來的不同毒性作用，例如：視網(wǎng)膜色素上皮的壞死、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活性的降低［25］。

盡管在體外試驗(yàn)中BBG 被證明了存在細(xì)胞毒性，且這種毒性作用常與計量相關(guān)，但由于BBG 對ILM 具有明顯的親和力并且在人眼術(shù)后的長期隨訪觀察中未觀察到毒性跡象，因此它已在染色玻璃體切除術(shù)中成為ICG 和IfCG 的可替代品。

2 新型眼內(nèi)染色劑

隨著對各類眼內(nèi)染色劑的深入研究，新型染料不斷被開發(fā)，近幾年在天然植物及果實(shí)中提取到安全有效的染色劑，對于染色玻璃體手術(shù)來說，又是一個突破性進(jìn)展。

葉黃素為親脂性色素，屬于傳統(tǒng)上在水果和蔬菜中發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素。因其抗氧化作用和特征性分布在黃斑區(qū)域，故可預(yù)防年齡相關(guān)的黃斑病變。藍(lán)光是導(dǎo)致光感受器和RPE 損傷的主要因素，最新研究發(fā)現(xiàn)葉黃素可通過增加大鼠血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平，達(dá)到對視網(wǎng)膜LED 藍(lán)光損傷相關(guān)的保護(hù)作用［26］。這種新型染料由葉黃素、0.3%的玉米黃質(zhì)晶體和0.025%的BBG組成，研究者認(rèn)為這種染料具有良好的理論安全性，可用于玻璃體切除術(shù)中識別ILM 及玻璃體后皮質(zhì)。該類染料與BBG 的結(jié)合使其比平衡鹽溶液重，從而有助于沉積在后極部，從而避免了不必要的侵入性操作。Christoph 等人將含有葉黃素的眼內(nèi)染料用以增強(qiáng)黃斑前膜術(shù)中透明組織的可見性，并用實(shí)時OCT（intraoperative optical coherence tomography， iOCT）觀察染色有效性，結(jié)論得出：晶體樣葉黃素物質(zhì)比水溶性葉黃素的眼內(nèi)染色劑更能增強(qiáng)視網(wǎng)膜前組織在iOCT 中的可見性［27］。

花青素類染料是從天然果實(shí)里提取的染料，優(yōu)先染色I(xiàn)LM，極具發(fā)展前途。最早用于眼科是于2013年，將該類染料用于尸體眼中展示出很好的染色性能并 增 強(qiáng) 眼 內(nèi) 組 織 的 可 見 性［28］。Caiado 等［29］將 含 有10%、25%濃度的花青素類染料用于兔眼中，兩種濃度的染料均有較高的安全性。隨后該研究組又對花青素類染料進(jìn)行了研究，在此次研究中，向兔眼中分別注入10%、25%、35%濃度的花青素染料，對照組注射平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS）。采用視網(wǎng)膜電圖評估功能變化，用眼底成像、熒光血管成像、光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）、光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)變化評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度為10%、25%的染料不會導(dǎo)致明顯的功能及形態(tài)的毒性作用，然而在24 h的毒性跟蹤反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，35%濃度帶來了明顯的形態(tài)功能改變［30］。由于花青素類染料較BSS 比重大，故染料可以很好的附著在眼底后極部，降低手術(shù)干擾。對使用花青素類染料評估其在眼內(nèi)的抗氧化性以及對于眼內(nèi)組織，特別是RPE 保護(hù)作用的研究均展現(xiàn)出了較好結(jié)果［31］。長期的隨訪及深入研究是必不可少的，但從以往的研究結(jié)果看來，花青素類的天然染料在玻璃體視網(wǎng)膜術(shù)中運(yùn)用有較好發(fā)展。

3 手術(shù)操作技術(shù)

3.1 雙重染色技術(shù)

在手術(shù)過程中常使用兩種染色劑，雙重染色常被定義為：先注入染料以剝離ERM，后再注入另一種染料進(jìn)行ILM 剝離。手術(shù)過程中可以使用不同的染料進(jìn)行雙重染色，或者可以使用相同的染料對多個眼內(nèi)組織進(jìn)行染色［32］。該技術(shù)可以較好的鑒定玻璃體后皮質(zhì)與ERM，玻璃體后皮質(zhì)與ILM。一般是先注射對玻璃體具有高親和力的染料，以實(shí)現(xiàn)玻璃體去除，再注射對ERM/ILM 親和力高的染料以剝除相應(yīng)的組織。例如繼TA 后，再次注射例如IfCG、ICG、TB或BBG 的染料，以染色和剝離ERM。Henrich等［33］認(rèn)為，將BBG 與TB 以低濃度比例混合，比單獨(dú)使用一種染料來說，有更好的染色效果。

3.2 染料注入方法

在手術(shù)過程中注入眼內(nèi)染色劑常有兩種操作方式，分為：干性注射和濕性注射兩種［34］。干性注射操作步驟為：在染料注入之前通過氣-液交換除去玻璃體腔中的液體，當(dāng)玻璃體腔充滿空氣時，再將染料注入玻璃體腔。干性注射的優(yōu)點(diǎn)是可以使染料集中在后極中并可避免染色劑在晶狀體的后囊處附著，但這種手術(shù)方式可能使視網(wǎng)膜表面接觸較高濃度的染料。

濕性注射是不進(jìn)行氣液交換，當(dāng)玻璃體腔內(nèi)充滿液體時將染料注入玻璃體腔內(nèi)，因染料被玻璃體腔中的液體稀釋可以降低與視網(wǎng)膜表面接觸的染料濃度。該技術(shù)的缺點(diǎn)是染料可能分散，可能會降低染色效果及擴(kuò)大染色范圍。

4 結(jié)語與展望

玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)的理想操作過程是避免機(jī)械性損傷、減少光照時間、降低眼內(nèi)染料的毒性作用。理想的眼內(nèi)染色劑應(yīng)具有對眼內(nèi)組織較為安全，良好的著染效果，可選擇性染色，能從眼內(nèi)快速代謝等特點(diǎn)［35］。用于染色玻璃體切除術(shù)的眼內(nèi)染料種類繁多，但對于不同的眼內(nèi)染色劑，均建議在操作過程中使用溶液最低有效濃度、縮短染色時間、準(zhǔn)確定位染色組織、緩慢注入眼內(nèi)，避免猛烈沖洗注射，并且玻璃體腔內(nèi)使用的所有物質(zhì)的滲透壓應(yīng)約為（280～300）mOsm，pH 值為約7.00［1］。由于染色劑常用于MH 及ERM 等手術(shù)，為了防止染料直接進(jìn)入裂孔區(qū)域，降低染料與視網(wǎng)膜下組織的接觸機(jī)率，可對黃斑區(qū)域進(jìn)行保護(hù)，如裂孔附近放置諸如全氟化碳液體、自體全血或透明質(zhì)酸鈉之類的物質(zhì)。針對iMH 閉合率而言，有研究結(jié)果顯示，使用眼內(nèi)染色劑輔助內(nèi)界膜剝離的裂孔閉合率高于未用染色劑情況下的內(nèi)界膜剝離，其中安全性從高到低依次是BBG、TB、TA、ICG、無染料，對于iMH術(shù)后視力改善來說，提升從高到低依次是BBG、TB、無染料、TA、ICG［36］。Li 等［37］對特發(fā)性黃斑裂孔手術(shù)中染色劑輔助內(nèi)界膜剝除等一系列研究進(jìn)行了網(wǎng)狀Meta 分析，1 492 例處于2 期至4 期的特發(fā)性黃斑裂孔術(shù)后，從裂孔閉合率來說，未用染料的內(nèi)界膜剝離優(yōu)于0.25%濃度的ICG 溶液，0.5%濃度的ICG 或TA 溶液優(yōu)于未用染料的病例組，使用0.05%濃度的BBG、0.15%濃度的TB、0.5%或者0.05%ICG 均比0.25% 濃度ICG 的內(nèi)界膜剝離效果好。

總的來說，在染色玻璃體切除術(shù)中，不同類型的染料對不同眼內(nèi)組織有其特異性著色效果，但各類染色劑的毒性作用仍是引人關(guān)注的話題，幾乎所有種類的生物染料都對視網(wǎng)膜具有潛在的副作用。在今后的研究中，除了進(jìn)一步開發(fā)新型眼內(nèi)染色劑之外，更應(yīng)該注重染色劑本身相關(guān)的短期及長期安全性。