骨痹通消顆粒對糖皮質(zhì)激素致成骨細(xì)胞損傷的干預(yù)作用

朱彩玉，朱 磊，顧一帆，韓士鼎，徐 寰，侯文淵，周正新

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031）

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids， GCs）是臨床常用的抗炎和自身免疫調(diào)節(jié)劑，長期或大劑量使用會導(dǎo)致 激 素 性 股 骨 頭 壞 死［1］（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）。SANFH 的發(fā)生機(jī)制尚不明確，目前的研究表明，GCs 環(huán)境下細(xì)胞自噬程序的過度激活，會導(dǎo)致成骨細(xì)胞大面積凋亡，造成骨量減少、股骨頭塌陷［2-5］。因此調(diào)控成骨細(xì)胞自噬與凋亡，促進(jìn)股骨頭壞死區(qū)骨修復(fù)與重建，可能是SANFH 的治療靶點(diǎn)。

近年來，中醫(yī)藥因治療股骨頭壞死的獨(dú)特優(yōu)勢而逐漸成為時下研究的熱點(diǎn)［6，7］。以往一些關(guān)于中藥治療該病的機(jī)制研究中［8-10］，大多側(cè)重于血管內(nèi)高凝狀態(tài)、間充質(zhì)干細(xì)胞分化異常及骨質(zhì)疏松等，而中藥調(diào)控成骨細(xì)胞自噬及凋亡的研究相對較少。中藥骨痹通消顆粒，立足于中醫(yī)補(bǔ)腎活血、通絡(luò)開痹等理論，選擇從整體上調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境，從而達(dá)到補(bǔ)腎壯骨、活血通絡(luò)的功效，是課題組長期使用的保髖經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)方，配合手術(shù)能顯著改善保髖預(yù)后，臨床療效確切［11，12］。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［13］，骨痹通消顆粒能夠有效減少SNAFH 家兔模型股骨頭區(qū)成骨細(xì)胞凋亡，降低空骨陷窩率。為進(jìn)一步證實(shí)骨痹通消顆粒的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞模型，在細(xì)胞分子水平觀察骨痹通顆粒消含藥血清對 GCs 致成骨細(xì)胞功能損傷的影響，并從細(xì)胞自噬與凋亡角度出發(fā)探索其作用機(jī)制，進(jìn)而為中藥骨痹通消顆粒防治SANFH 提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞 選用10 只健康成年雄性清潔級新西蘭白兔制備骨痹通消顆粒含藥血清，體質(zhì)量3.5～4.0 kg。購自安徽省實(shí)驗(yàn)動物中心（許可證號：SYXK（皖）2020-001，動物合格證號：NO.202213666），飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。動物實(shí)驗(yàn)由安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理編號：AHUCM-rabbits-2022020）。小鼠成骨前體細(xì)胞MC3TE-E1 由賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司提供（批號：iCell-m031）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 丹參15 g，川芎10 g，赤芍12 g，當(dāng)歸10 g，制淫羊藿10 g，土鱉蟲6 g，肉桂4 g，甘草6 g，續(xù)斷片10 g，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制成骨痹通消顆粒。注射用地塞米松磷酸鈉購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房（豐原制藥，批號：201011-1）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 胎牛血清（新西蘭NEWZERUM 公司，批號：FBS-S010321）；DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰酶（美國Gibco 公司，批號：8121506、2186968）；CCK-8 檢測試劑盒（Biosharp 生物，批號：21172249）；細(xì)胞自噬/凋亡檢測試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（ 上海碧云天生物，批號：082521210907、062521210726）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（索萊寶生物公司，批號：CR2110087）；總RNA 快速提取試劑盒（廣州美基生物，批號：RJH19-01）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒（上海新貝生物，批號：F2987、F3528）；β-actin、Beclin-1、Bax 及Bcl-2 鼠 抗 均 購 自Bioss 公 司（批 號：AH11286487、BA09245415、BJ10163878、BJ11026965）；羊抗鼠IgG二抗（博士德生物，批號：BST16D22C16C54）；CO2胞 培 養(yǎng) 箱（ 美 國 NuAire 公 司，型 號：NU-5820E）；細(xì)胞超凈臺（蘇州蘇凈安泰公司，型號：SW-CJ）；激光掃描共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，型號：CX53）；Count star 細(xì)胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物，型號：IC1000）；全波段酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司，型號：Epoch 2）；梯度PCR 儀（美國ABI 公司，型號：ABI Veriti）；熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司，型號：LightCycler480Ⅱ）；蛋白凝膠成像儀（上海天能公司，型號：VE-180）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 骨痹通消顆粒含藥血清制備 新西蘭白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后，按人與動物體質(zhì)量折算的等效劑量換算給藥量［家兔等效劑量=（人藥物劑量）/60 kg × 3.3］，給予4.5 g/kg 的骨痹通消顆粒進(jìn)行灌喂，每天灌喂2 次，連續(xù)7 d。末次灌胃2 h 后，用3%戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈麻醉，腹主動脈采血，無菌分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。采血結(jié)束后，對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行耳緣靜脈空氣注射處死，動物尸體送至安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心統(tǒng)一處理。

1.2.2 分組與干預(yù) 設(shè)置空白對照組、實(shí)驗(yàn)組、模型組。無激素誘導(dǎo)細(xì)胞作為空白對照組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為10%的空白血清）。參考文獻(xiàn)中方法［14］，使用梯度濃度地塞米松（dexamethasone，Dex）（10-5M、10-6M、10-7M）溶液誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，隨后將體外激素誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞分為模型組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為10%的空白血清）、實(shí)驗(yàn)組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為10%的骨痹通消含藥血清）。

1.3 主要觀察指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞活力檢測 收集重懸MC3T3-E1 細(xì)胞，按照2×103個/孔接種至96 孔板中，每組10 個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，更換為含有不同血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)。24、48 及72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，放回培養(yǎng)箱中孵育1 h，隨后將96 孔板放入酶標(biāo)儀中，在450 nm 處測定吸光度（OD 值）。

1.3.2 MDC/PI 染色法檢測 MC3T3-E1 細(xì)胞自噬及凋亡情況 重懸對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照1×105個/孔接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換成不同培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時間后移除培養(yǎng)基，用PBS 緩 沖 液 洗 滌1 次，每 孔 加 入1 mL MDC/PI 染 色液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃避光孵育30 min。后吸凈MDC/PI 染色液，使用Assay Buffer 洗滌3 次，最后再加入1 mL Assay Buffer 于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬及凋亡情況。

1.3.3 Western-blot 檢測各組目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平 使用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白含量后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，每孔上樣10 μL，marker 5 μL，半濕法電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯薄膜（PVDF 膜）上，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別孵育1∶1 000 濃度稀釋的Beclin-1、Bax、Bcl-2、β-actin（內(nèi)參）一抗，4 ℃配搖床過夜。TBST 洗膜3 次，用馬來酰胺過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶5 000）室溫配搖床孵育2 h，再次洗膜后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡系統(tǒng)檢測圖像，采用Image J 軟件對條帶進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比計算蛋白相對表達(dá)量。

1.3.4 RT-qPCR 檢測各組目的基因的表達(dá) 各組MC3T3-E1 細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后，使用雙柱離心法快速提取細(xì)胞總RNA，并使用紫外分光光度計測其純度。根據(jù)目的基因在GeneBank 中的己知序列，采用Primer 5.0 設(shè)計引物（表1）。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒說明，設(shè)置反應(yīng)程序，放入q-PCR 儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增并定量檢測。以β-actin 為內(nèi)參，結(jié)果采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 各基因引物序列Tab 1 Primer sequences of each gene

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)值變量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行描述，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間進(jìn)一步比較采用Dunnett-t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖皮質(zhì)激素對成骨細(xì)胞活力的影響

根據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與對照組相比，模型組MC3T3-E1 細(xì)胞在GCs 環(huán)境中數(shù)量減少且呈時 間 和 劑 量 依 賴 性（F=78.732，P＜0.01；F=39.698，P＜0.01）。 不 同 劑 量 Dex 誘 導(dǎo) 的MC3T3-E1 細(xì)胞在24 h 后與正常未處理的細(xì)胞相比沒有明顯差異（P＞0.05），48 h 后僅10-5M 組細(xì)胞活力與對照組相比存在差異（P＜0.01），而在Dex 誘導(dǎo)72 h 后，各組的細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）。（圖1，表2）。

表2 細(xì)胞活力情況（n=10，±s）Tab 2 Cell viability （n=10，±s）

表2 細(xì)胞活力情況（n=10，±s）Tab 2 Cell viability （n=10，±s）

注：與對照組相比，**P＜0.01。

分組時間48 h 0.968±0.060 0.900±0.062 0.876±0.057 0.827±0.065**4.591 0.017 72 h 0.974±0.077 0.841±0.055**0.751±0.030**0.590±0.028**49.188＜0.01 Control MC3T3-E1 10-7M Dex 10-6M Dex 10-5M Dex FP 24 h 1±0.035 0.981±0.104 0.949±0.081 0.909±0.032 5.141 0.162

圖1 Dex 隨時間對MC3T3-E1 細(xì)胞活力的影響Fig 1 Influence of of Dex on MC3T3-E1 cell viability over time

2.2 糖皮質(zhì)激素對成骨細(xì)胞自噬及凋亡的影響

Western-blot 分析結(jié)果如圖所示，暴露72 h 后，自噬標(biāo)記物Beclin-1 的表達(dá)水平從最低劑量（10-7M）開始增加，最大反應(yīng)出現(xiàn)在10-6M Dex 組。當(dāng)用10-5M Dex 處理MC3T3-E1 細(xì)胞時，與10-6M Dex組相比，Beclin-1 的表達(dá)顯著降低，幾乎恢復(fù)到正常水平。然而，與空白對照組相比，10-5M Dex 組的促凋亡蛋白Bax 顯著增加（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平下降（P＜0.01）。見圖2 及表3。

圖2 糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自噬及凋亡情況Fig 2 Osteoblast autophagy and apoptosis induced by glucocorticoid

表3 蛋白免疫印跡分析半定量結(jié)果（n=3，±s）Tab 3 Western blot analysis of semi-quantitative results of protein（n=3，±s）

表3 蛋白免疫印跡分析半定量結(jié)果（n=3，±s）Tab 3 Western blot analysis of semi-quantitative results of protein（n=3，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；Dex 誘導(dǎo)72 h 后，A～C 目標(biāo)蛋白的免疫印跡分析，D～F 用內(nèi)參蛋白校正后的蛋白相對表達(dá)量。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；##P＜0.01。

分組蛋白Bax 0.461±0.084 0.608±0.049 0.950±0.056**1.372±0.109**80.526＜0.01 Bcl-2 1.023±0.092 0.826±0.068*0.701±0.033**0.142±0.031**113.206＜0.01 Control MC3T3-E1 10-7M Dex 10-6M Dex 10-5M Dex F P Beclin-1 0.253±0.030 0.671±0.046**1.062±0.102**0.430±0.058*87.572＜0.01

2.3 骨痹通消顆粒含藥血清對各組細(xì)胞自噬的影響

與對照組相比，模型組暴露72 h 后，10-7M 與10-6M Dex 組細(xì)胞自噬率明顯提高，10-5M Dex 組細(xì)胞自噬水平反而下降（P＜0.01）。而在與骨痹通消顆粒含藥血清聯(lián)合處理后，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組各組細(xì)胞自噬水平均得到抑制，并且呈劑量相關(guān)性（P＜0.01)。見表4。

表4 各組小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞自噬率比較（n=3，±s）Tab 4 Comparison of autophagy rate of MC3T3-E1 cells in each group（n=3，±s）

表4 各組小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞自噬率比較（n=3，±s）Tab 4 Comparison of autophagy rate of MC3T3-E1 cells in each group（n=3，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.01，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01

組別對照組模型組F P劑量-10-7M Dex 10-6M Dex 10-5M Dex 10-7M Dex+GBTX 10-6M Dex+GBTX 10-5M Dex+GBTX自噬率（%）5.925±0.185 26.538±3.338**38.726±5.779**16.631±2.665**10.305±1.163##13.652±3.245##14.116±2.227＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01 0.341 37.969實(shí)驗(yàn)組-- - - - -

2.4 骨痹通消顆粒含藥血清對各組細(xì)胞凋亡的影響

鏡下觀察結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡染色僅見個別紅色熒光點(diǎn)，模型組經(jīng)不同濃Dex 誘導(dǎo)損傷后，可見大片或散在明顯的凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞。與模型組相比，骨痹通消顆粒含藥血清干預(yù)72 h 后，各組紅色熒光明顯減少（P＜0.01）。細(xì)胞凋鏡下觀察結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡染色僅見個別紅色熒光點(diǎn)，模型組經(jīng)不同濃Dex 誘導(dǎo)損傷后，可見大片或散在明顯的凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞。與模型組相比，骨痹通消顆粒含藥血清干預(yù)72 h 后，各組紅色熒光明顯減少（P＜0.01）。細(xì)胞凋亡染色紅色熒光半定量結(jié)果也顯示骨痹通消顆粒含藥血清對GCs 致成骨細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用。見表5 及圖3、4。

表5 細(xì)胞凋亡染色半定量結(jié)果比較（n=3，±s）Tab 5 Comparison of semi-quantitative results of apoptosis staining（n=3，±s）

表5 細(xì)胞凋亡染色半定量結(jié)果比較（n=3，±s）Tab 5 Comparison of semi-quantitative results of apoptosis staining（n=3，±s）

注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。

分組劑量10-7M Dex 10-6M Dex 10-5M Dex Control MC3T3-E1 2.753±0.250 3.050±0.200 4.053±1.050 Dex 9.633±0.375**20.990±1.414**33.310±2.213**Dex+GBTX 4.817±0.252##5.417±1.218##8.513±1.357##F P 420.653 242.753 285.048＜0.01＜0.01＜0.01

圖3 Dex 加或不加骨痹通消顆粒含藥血清培養(yǎng)72 h 后細(xì)胞凋亡水平 （PI 染色×40）Fig 3 Apoptosis levels of cells after 72 h culture with or without Dex plus Gubi Tongxiao granules containing serum （PI staining ×40）

圖4 細(xì)胞凋亡染色半定量分析Fig 4 Semi-quantitative analysis of apoptosis staining

2.5 骨痹通消顆粒含藥血清對各組細(xì)胞Beclin-1、Bcl-2 及 Bax mRNA 表 達(dá) 的 影 響

為進(jìn)一步證明骨痹通消顆粒對GCs 致成骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，各組細(xì)胞在培養(yǎng)72 h 后檢測mRNA 表達(dá)水平的變化。與對照組相比，模型組細(xì)胞Beclin-1 及Bax mRNA 表達(dá)明顯升高，Bcl-2 mRNA 水平下降（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)骨痹通消顆粒含藥血清干預(yù)后Bcl-2 mRNA 表達(dá)上調(diào)，Beclin-1及Bax mRNA 的表達(dá)則受到抑制（P＜0.01）。見圖5 及表6。

圖5 骨痹通消顆粒含藥血清對MC3T3-E1 mRNA 的影響Fig 5 Effect of Gubi Tongxiao granules containing serum on mRNA in MC3T3-E1

表6 骨痹通消顆粒含藥血清對mRNA 的影響（n=3，±s）Tab 6 Effect of Serum containing Gubi Tongxiao Granules on mRNA（n=3，±s）

表6 骨痹通消顆粒含藥血清對mRNA 的影響（n=3，±s）Tab 6 Effect of Serum containing Gubi Tongxiao Granules on mRNA（n=3，±s）

注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。

組別劑量mRNA對照組模型組-10-7M Dex Beclin-1 1.010±0.200 7.030±0.530**Bax 1.020±0.080 1.790±0.100**Bcl-2 1.007±0.025 0.260±0.040**10-6M Dex 9.110±0.456**2.130±0.150**0.230±0.030**10-5M Dex 10-7M Dex+GBTX 10-6M Dex+GBTX 10-5M Dex+GBTX 0.200±0.030**0.940±0.040##0.920±0.060##0.843±0.031##292.408＜0.01實(shí)驗(yàn)組FP--3.757±0.695**1.297±0.270##1.437±0.410##1.777±0.366##156.934＜0.01 2.340±0.120**1.120±0.120##1.220±0.070##1.360±0.060##74.707＜0.01

3 討論

GCs 廣泛應(yīng)用于抗炎及免疫調(diào)節(jié)等方面。尤其是近年來非典及新冠疫情的出現(xiàn)，GCs 被大量適用于臨床。然而，骨丟失甚至股骨頭缺血性壞死等副作用可能會抵消其治療帶來的益處［15］。SANFH病程進(jìn)展快速，關(guān)節(jié)損毀，最終需通過人工髖關(guān)節(jié)置換治療，然而人工關(guān)節(jié)假體的耐受性及可修復(fù)性在一定程度上限制了其適用范圍［16，17］。因此，針對早中期的SANFH 的治療方案仍以保髖為主，即通過藥物、保護(hù)性負(fù)重或手術(shù)等方法修復(fù)病變的股骨頭，保留患者自身髖關(guān)節(jié)，避免或推遲行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)［18，19］。

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，GCs 引起股骨頭壞死與缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密不可分［20，21］。一方面，大劑量或長期使用GCs 會直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管凝血纖溶，股骨頭局部血液微循環(huán)障礙，最終導(dǎo)致SANFH 的發(fā)生；另一方面，長期使用GCs 時，細(xì)胞內(nèi)的溶酶體將會廣泛地回收細(xì)胞器，并可能進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡。先前有研究表明［22］，自噬可能是成骨細(xì)胞抵御GCs 負(fù)面影響的主要機(jī)制。Belin-1 作為自噬發(fā)生的標(biāo)志物之一，是第III 型PI3 激酶（PI3K III）復(fù)合物的一部分，參與自噬前體的形成，并介導(dǎo)其他自噬蛋白在自噬前體的定位［23］。研究證實(shí)，Beclin1/Bcl-2 復(fù)合體對細(xì)胞自噬與凋亡轉(zhuǎn)歸具有重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng) Beclin-1 與Bcl-2 結(jié)合時可競爭性地抑制Bax 與Bcl-2 的結(jié)合，導(dǎo)致Bax/Bcl-2 比值升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但當(dāng)促凋亡蛋白競爭性結(jié)合Bcl-2 時，Beclin-1 被釋放，從而誘發(fā)自噬、抑制細(xì)胞凋 亡［24］。Han 等 實(shí) 驗(yàn) 發(fā) 現(xiàn)［25］，抑 制 自 噬 能 夠 增 加GCs 環(huán)境中促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)量，導(dǎo)致MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化功能障礙，并引起細(xì)胞凋亡。而在與自噬誘導(dǎo)劑聯(lián)合治療后產(chǎn)生了相反的結(jié)果。然而，當(dāng)壓力持續(xù)較長時間，特別是在慢性GCs 治療下，細(xì)胞自噬水平反而受到抑制，細(xì)胞凋亡途徑被激活［26］。這說明自噬不是始終具有保護(hù)作用，調(diào)控自噬可能在長期攝入GCs 期間對成骨細(xì)胞的功能起重要作用［27］。

在本實(shí)驗(yàn)中，MC3T3-E1 細(xì)胞在GCs 環(huán)境中數(shù)量減少呈時間和劑量依賴性，自噬標(biāo)記物Beclin-1水平的增高是從低劑量（10-7M）開始的，最大反應(yīng)出現(xiàn)在10-6M Dex 誘導(dǎo)的細(xì)胞中，當(dāng)暴露于10-5M Dex時，Beclin-1 的表達(dá)量顯著降低。Jia 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)被低劑量GCs 處理時，骨細(xì)胞自噬程序的激活有利于促進(jìn)細(xì)胞存活；然而，更高和持續(xù)的壓力可能會產(chǎn)生大量自噬體，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞大面積凋亡。Zhu 等［14］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 在骨細(xì)胞系MLO-Y4 細(xì)胞中，Dex 對細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)以時間依賴性方式增加。自噬標(biāo)志物（LC3-II 和 Beclin-1）在低劑量的下增加，在高劑量下減少，并且隨著自噬的發(fā)生，促凋亡蛋白Caspase-3 的表達(dá)明顯升高。這與本文的研究結(jié)果一致，MC3T3-E1 細(xì)胞經(jīng)高濃度Dex（10-5M）誘導(dǎo)72 h 后，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)量顯著降低，相反的促凋亡蛋白Bax 的水平顯著升高。這說明GCs 對成骨細(xì)胞自噬與凋亡具有雙向誘導(dǎo)作用，低劑量的GCs 可以激活自噬，清除受損的細(xì)胞器并維持細(xì)胞的自我穩(wěn)態(tài)，而長期或大劑量使用GCs 則會抑制自噬，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為股骨頭壞死屬于“骨痹”、“骨蝕”的范疇。激素為藥邪，進(jìn)入人體后可對經(jīng)絡(luò)產(chǎn)生影響，氣血運(yùn)行不暢，易傷肝腎；肝腎虧損，主骨生髓乏源，骨失所養(yǎng)，最終發(fā)為“骨蝕”［29］。研究表明，補(bǔ)腎活血類中藥用于治療股骨頭壞死，不僅具有鮮明的特色，而且療效確切。朱嘉敏等［30］研究發(fā)現(xiàn)，使用骨蝕寧膠囊聯(lián)合唑來膦酸治療早中期ONFH 患者能夠有效改善患者Harris 評分和疼痛，延緩股骨頭塌陷。梁學(xué)振等［31］實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)腎活血膠囊含藥血清能夠提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化水平并抑制其成脂分化，促進(jìn)股骨頭壞死區(qū)骨修復(fù)及新骨的生成。Waqas 等［32］發(fā)現(xiàn)葛根素能夠上調(diào)抗Bcl-2蛋白的表達(dá)，有效防止細(xì)胞凋亡，維持骨量。Chen［8］等研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯通過調(diào)節(jié)動物模型VEGF的表達(dá)及顯著抑制細(xì)胞凋亡，能夠有效延緩股骨頭壞死的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)中，損傷后的MC3T3-E1 細(xì)胞經(jīng)骨痹通消顆粒含藥血清干預(yù)后，自噬率得到不同程度抑制，且呈劑量相關(guān)性。PI 染色半定量結(jié)果表明喪失完整細(xì)胞膜的紅色熒光明顯減少。除此外，Bcl-2 的mRNA 表達(dá)較模型組明顯上升，而Beclin-1與Bax 的mRNA 表達(dá)受到抑制。研究表明，Bcl-2不僅能與Bax 結(jié)合干擾線粒體依賴性細(xì)胞凋亡過程，而且能通過與Beclin-1 的BH3 域結(jié)合并影響其活性，抑制Beclin-1 依賴性自噬，降低細(xì)胞自噬水平［33］。

綜上所述，骨痹通消顆粒能夠調(diào)控自噬與凋亡的交叉因子Bcl-2，下調(diào)Beclin-1 及Bax 的表達(dá)量，有效減少細(xì)胞自噬及凋亡，從而發(fā)揮治療SANHF 的作用。然而，復(fù)方顆粒成分多且復(fù)雜，今后仍需要開展更細(xì)化的機(jī)制研究，以找到治療疾病靶點(diǎn)的有效成分。同時，還需要更多的動物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其有效性，以發(fā)揮其防治骨壞死疾病的獨(dú)特優(yōu)勢。

作者貢獻(xiàn)度說明：

實(shí)驗(yàn)設(shè)計：周正新；實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)與評估：顧一帆、朱磊；實(shí)驗(yàn)實(shí)施：朱彩玉、侯文淵、韓世鼎；資料收集與統(tǒng)計：徐寰；朱彩玉成文，周正新審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。