夏紅霞,唐其柱,周 恒,劉哲宇
(1.武漢大學人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,代謝與相關慢病湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430060;2.武漢大學第一臨床學院,湖北 武漢 430060)
巨噬細胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和許多生理過程中發(fā)揮關鍵作用,如細胞代謝、清除衰老細胞和組織碎片、組織修復和重構等[1,2]。炎癥存在于全身各系統(tǒng)疾病中,如在心血管系統(tǒng)中,心肌重構和心力衰竭與局部和全身炎癥信號級聯(lián)反應的激活有關[3,4],巨噬細胞作為炎癥反應中最主要的免疫防御細胞,可以釋放促炎介質(zhì)促進炎癥因子的形成,從而促進疾病的進展。炎癥反應中,大量的炎性單核細胞(巨噬細胞前體)通過趨化因子梯度和各種粘附分子從骨髓中被招募,并隨著組織局部微環(huán)境釋放的生長因子和細胞因子而發(fā)生表型和功能的顯著改變。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信 號通路介導了炎癥反應中促炎細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生,參與抗炎和組織損傷的預防過程[5,6]。MAPK 相互作用絲蘇氨酸激酶1(MAPK-interacting serine/threonine kinase 1,Mnk1)是Mnks 激 酶(Mnk1 和Mnk2)之一,在所有成年組織均有較多表達[7,8]。Spry2 是Mnks 重 要 的 底 物 之 一[9]。Spry 蛋 白屬于一組抑制ERK 激活和信號傳導的膜相關蛋白[7]。研 究 表 明,Mnk1 可 磷 酸 化Spry2 的S112 和S121 兩個位點,從而延長Spry2 的半衰期,增強Spry2 的 穩(wěn) 定 性,抑 制ERK 信 號 轉(zhuǎn) 導[7]。MAPKs 信號通路在炎癥中的作用及相關機制已有大量研究,而Mnk1 對炎癥的影響及其對巨噬細胞的功能調(diào)節(jié)的研究鮮有報道,本研究推測Mnk1可能通過調(diào)節(jié)其底物Spry2 的表達,從而影響巨噬細胞在炎癥反應中的功能變化。因此,本研究通過體內(nèi)外實驗初步探討Mnk1基因缺失對LPS 誘導的巨噬細胞炎癥反應的影響。
脂多糖購于美國Sigma 公司,RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco 公司,紅細胞裂解液購于碧云天生物,RIPA 裂解液(美國賽默飛世爾公司,89900),抗F4/80、Spry2 抗體購于英國Abcam公司,GAPDH、Mnk1、ERK1/2、P-ERK1/2、P-p38、P-JNK 抗體購于美國CST 公司。Trizol 試劑購于美國賽默飛世爾公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑購于瑞 士Roche 公 司,IL-1β Elisa 試 劑 盒 購 于 上 海 酶 聯(lián)生物。定量RT-PCR 儀為瑞士Roche 公司生產(chǎn)(型號:LC480)。
選取8~10 周齡健康雄性WT、Mnk1 基因KO小鼠,體質(zhì)量23.5~27.5 g。WT 小鼠購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,Mnk1 KO 小鼠是由日本大阪大學前沿生物科學研究生院Rikiro Fukunaga 教授友情贈予,均飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院心血管病研究所,飼養(yǎng)環(huán)境SPF 級。所有操作經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院動物福利倫理審查委員會批準(批號:20171202)。
腹腔注射PBS 或LPS(1 mg/mL)的小鼠眼眶取血后分離血清,Elisa 試劑盒檢測血清中IL-1β 的濃度;分離上述小鼠脾臟巨噬細胞:頸椎脫臼法處死小鼠后取出脾臟,剪成小塊置于含有冷的RPMI 1640 小皿中并機械研磨脾臟組織塊,用200 目無菌篩網(wǎng)過濾得混懸液,將此混懸液1 000 r/min 離心3 min 除去細胞碎片,加入紅細胞裂解液裂解紅細胞,5 min 后1 000 r/min 離心3 min 除去紅細胞碎片,PBS 洗滌3 次后用RPMI 1640 重懸得到脾臟巨噬細胞,將此懸液接種于細胞培養(yǎng)板中于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,24 h 后棄去上清,用RPMI 1640 培養(yǎng)基洗1~2 次,棄去未黏附細胞,貼壁細胞為單層巨噬細胞。
參照繼往文獻報道的方法[10],頸椎脫臼法處死小鼠后,無菌條件下PBS 灌洗并收集腹腔液。1 000 rpm 離心10 min,所得細胞沉淀用 RPMI 1640培養(yǎng)基重懸接種至6 孔板中,于37 ℃培養(yǎng)4 h 后,洗去未貼壁細胞,余下的貼壁細胞即為腹腔Mφ,并在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。體外使用 LPS(終濃度10 ng/mL)刺激腹腔Mφ,分為WT+PBS 組、KO+PBS 組、WT +LPS 組、KO+LPS 組,每 組6 只小鼠。
腹腔注射PBS 或LPS(1 mg/mL)的各組小鼠提取出巨噬細胞后,調(diào)整巨噬細胞數(shù)至2.0×106/ mL,每管500 μL 加入1.5 mLEP 管內(nèi),EP 管置于37℃水浴搖床分別震蕩培養(yǎng)10、30 min 和60 min,各時間點分別取100 μL 細胞懸液,用細胞計數(shù)儀檢測細胞密度。黏附功能以黏附率=(初始細胞密度-某時間點懸液中細胞密度)/初始細胞密度×100%表示。
將上述1.4 培養(yǎng)的Mφ 鋪于6 孔板,按照MOI=100 加入過表達Spry2 的腺病毒[11](中國山東維真生物構建),分為WT+AdGFP、KO+ AdGFP 、KO+AdSpry2 組,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h 后換無血清的培養(yǎng)基,12 h 后每組均用LPS(10 ng/mL)刺激24 h。
使用抗F4/80 抗體對提取的WT 和Mnk1 小鼠腹腔Mφ 進行免疫熒光染色,用含DAPI 的抗熒光淬滅劑封片,然后于正置熒光顯微鏡下觀察,拍照。
取各組Mφ,加入RIPA 裂解液進行裂解,提取蛋白并定量。 每孔蛋白上樣量50 μg 進行SDS-PAGE 電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉后分別孵育一抗GAPDH、Mnk1、Spry2、ERK1/2、P-ERK1/2、P-p38、P-JNK 抗 體 4 °C 過 夜,次 日 二 抗 孵 育1 h 后顯色。以GAPDH 作為內(nèi)參,采用Image lab 軟件檢測各條帶的吸光度(OD)值。
采用Trizol 法提取各組脾臟Mφ 和腹腔Mφ 總RNA 后,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再用RT-qPCR 試劑盒擴增 上 述cDNA 并 分 析LFA-1α、CD206、IL-1β 和Spry2 的mRNA 表達情況。引物均由上海生工生物公司合成,主要基因引物序列:LFA-1α(上游引物:5'-CATGCAGCCTATCCTGAGAC-3', 下 游 引物 : 5'-AATCGCACCCAGTAGGCATC-3') ;CD206 ( 上 游 引 物 :5'-AAACACAGACTGACCCTTCCC-3',下 游 引 物:5'-GTTAGTGTACCGCACCCTCC-3')IL-1β( 上 游 引 物 :5'-GGCAACTGTTCCTGAACTCAA-3',下 游 引物:5'-GACAGCCCAGGTCAAAGGTT-3');iNOS(上游引物:5'-TCGGGTTGAAGTGGTATGC-3',下游引物: 5'- TCGGGTTGAAGTGGTATGC-3');Arg1(上 游 引 物:5'-AGTGTGGTGCTGGGTGGAGAC-3',下 游 引 物: 5'-GCGGAGTGTTGATGTCAGTGTGAG-3')Spry2(上游引物:5'-TGAAAGACTCCACGGTCTGC-3',下游引物:5'-AGCTGACAGTGCTGATGGAC-3')。
采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,結果用均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
實驗提取WT 和KO 小鼠腹腔Mφ,免疫熒光染色結果如圖1A 所示,可觀察到兩組細胞中表達F4/80+的細胞。Western blot 檢測WT、KO 巨噬細胞Mnk1 的表達如圖1B 所示。
圖1 小鼠腹腔巨噬細胞免疫熒光染色及Mnk1 表達Fig 1 Immunofluorescence staining and Mnk1 expression of mouse peritoneal macrophages
在LPS 刺激下,WT、KO 組Mφ IL-1β、iNOS 的mRNA 表達水平較PBS 組明顯升高,CD206、Arg1表達水平較PBS 組明顯下降(P<0.05,表1)。與WT+LPS 組 比,KO+LPS 組Mφ IL-1β、iNOS 的mRNA 表達水平升高更顯著,而CD206、Arg1 表達水平下降更明顯(P<0.05,表1)。在體實驗提示,小鼠腹腔注射LPS 后,KO 組比WT 組小鼠血清中IL-1β 的濃度升高也更為顯著,且KO 組比WT 組脾臟Mφ 中IL-1β 的mRNA 表 達 也 顯 著 升 高(P<0.05,表3)。故Mnk1 可能進一步影響了LPS 刺激下Mφ 的極化。另 一方面,與WT 組相比,KO 組LFA-1α 的mRNA 表達水平下降(P<0.05);經(jīng)過LPS 的刺激后,KO+LPS 組Mφ LFA-1α 的mRNA表達水平明顯上升(P<0.05,表1)。然而,WT 組Mφ 在LPS 刺激前、后的LFA -1α 的mRNA 表達無顯著差異(P>0.05,表1)。在巨噬細胞黏附功能實驗中,各時間點的LPS 組Mφ 的黏附率均較PBS 組顯著增高(P<0.05,表2);與WT+PBS 組相比,KO+LPS 組Mφ 的黏附率有明顯升高,且在30 min、60 min 時,KO+PBS 組較WT+PBS 組的Mφ黏附率也有升高(P<0.05,表2)。因此,Mnk1 可能影響了LPS 刺激條件下Mφ 的黏附作用。
表2 各組巨噬細胞的LFA-1α 和Spry2 的mRNA 表達水平以及巨噬細胞黏附功能(n=6,±s)Tab 2 LFA-1 of macrophages in each group α MRNA expression level and macrophage adhesion function of Spry2 and Spry2(n=6,±s)
表2 各組巨噬細胞的LFA-1α 和Spry2 的mRNA 表達水平以及巨噬細胞黏附功能(n=6,±s)Tab 2 LFA-1 of macrophages in each group α MRNA expression level and macrophage adhesion function of Spry2 and Spry2(n=6,±s)
與WT+PBS 組相比, aP<0.05;與KO+PBS 相比,bP<0.05;與對照組(WT+PBS 組、KO+PBS 組)相比,cP<0.05;與WT+LPS 組比, dP<0.05; 與WT+PBS 組相比, eP<0.05
組別WT+PBS KO+PBS WT+LPS KO+LPS黏附率mRNA 表達Spry2 0.0077±0.0009 0.0042±0.0021a 0.0047±0.0007 0.0008±0.0001b 34.407<0.0001 10 min 15.75±3.29 13.06±1.86 24.36±5.88c 40.27±4.68c,d 25.515<0.0001 30 min 36.24±3.48 53.26±1.26e 62.82±0.92c 74.20±1.77c,d 175.267<0.0001 60 min 38.34±9.00 64.96±1.39e 69.50±3.04c 80.15±4.80c,d 32.910<0.0001 FP LFA-1α 0.0590±0.0175 0.0290±0.0025a 0.0513±0.0044 0.0955±0.0271b 17.163<0.0001
與WT 組 相 比,KO 組Spry2 的mRNA 表 達 水平顯著下降(P<0.05,表1),且KO+LPS 組Spry2的mRNA 表達水平較KO+PBS 組下降更顯著,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05,表1)。體內(nèi)實驗中脾臟Mφ Spry2 的mRNA 表達也符合上述變化(表3)。
表1 各組巨噬細胞的IL-1β、iNOS、CD206、Arg1 的mRNA 表達水平(n=6,±s)Tab 1 IL-1 of macrophages in each group β、 MRNA expression levels of iNOS, CD206, Arg1(n=6,±s)
表1 各組巨噬細胞的IL-1β、iNOS、CD206、Arg1 的mRNA 表達水平(n=6,±s)Tab 1 IL-1 of macrophages in each group β、 MRNA expression levels of iNOS, CD206, Arg1(n=6,±s)
注:與對照組(WT+PBS 組、KO+PBS 組)相比,a P <0.05;與WT+LPS 組比, b P <0.05。
Arg1 2.1653±0.2888 2.0497±0.0675 1.3897±0.0307a 0.6591±0.0275a,b 129.109<0.000 1組別WT+PBS KO+PBS WT+LPS KO+LPS FP IL-1β 0.0696±0.0109 0.0410±0.0111 0.5734±0.0291a 0.8336±0.0756a,b 533.957<0.000 1 iNOS 0.0001±0.0000 0.0001±0.0000 0.0060±0.0006a 0.0108±0.0028a,b 78.848<0.000 1 CD206 0.0766±0.0249 0.0603±0.0038 0.0080±0.0022a 0.0030±0.0005a,b 51.285<0.000 1
表3 體內(nèi)實驗血清IL-1β 濃度和脾臟巨噬細胞IL-1β、Spry2 的mRNA 表達水平(n=6,±s)Tab 3 Serum concentration of IL-1β in vivo and mRNA expression level of splenic macrophages IL-1β and Spry2(n=6,±s)
表3 體內(nèi)實驗血清IL-1β 濃度和脾臟巨噬細胞IL-1β、Spry2 的mRNA 表達水平(n=6,±s)Tab 3 Serum concentration of IL-1β in vivo and mRNA expression level of splenic macrophages IL-1β and Spry2(n=6,±s)
注:與對照組(WT+PBS 組、KO+PBS 組)相比,aP<0.05;與WT+LPS 組比, bP<0.05;與WT+PBS 組相比, cP<0.05;與KO+PBS相比,dP<0.05
Spry2組別 血清IL-1β(pg/mL)IL-1β 1.297 7±0.068 7 0.624 0±0.033 4c 0.914 9±0.571 5 0.225 8±0.404 4d 409.139<0.000 1 WT+PBS KO+PBS WT+LPS KO+LPS FP 27.00±1.33 18.15±1.37 74.56±3.21 a 117.24±1.09 a,b 3 343.582<0.000 1 0.523 1±0.067 8 0.326 7±0.043 6 1.256 9±0.085 1 a 2.495 5±0.129 8 a,b 756.506<0.000 1
Western blot 結 果 顯 示(圖2A),四 組Mφ 總ERK1/2 的 表 達 無 差 異,LPS 刺 激 后,WT 組P-ERK1/2 表 達 較PBS 組 升 高,KO 組 的P-ERK1/2表達較對應的PBS 組也明顯升高。與WT+LPS 組相比,KO+LPS 組P-ERK1/2 表達水平明顯升高,而Spry2的表達水平明顯下降。且實驗結果顯示W(wǎng)T+LPS 組和KO+LPS 組 的P-p38、P-JNK 表達無明顯差異(文中未展出數(shù)據(jù))。表明Mnk1可能主要影響Spry2/ERK1/2通路調(diào)節(jié)巨噬細胞炎癥水平。為進一步驗證上述結果,使用Spry2 過表達腺病毒和對照病毒 轉(zhuǎn) 染Mφ,驗 證WT+AdGFP、KO+AdGFP、KO+AdSpry2 三 組Mφ 中Spry2 和P-ERK1/2 蛋 白表 達變化。如圖2B 所示:KO+AdSpry2 組Spry2 的表達明顯上調(diào),表明腺病毒轉(zhuǎn)染成功。同時KO+Ad-Spry2組較KO+AdGFP組P-ERK1/2蛋白表達顯著下降。提示LPS 刺激的Mφ 中,Mnk1 參與了Spry2/ERK1/2 信號通路的調(diào)控。Mnk1很可能通過Spry2/ERK1/2信號通路影響巨噬細胞功能。
圖2 各組巨噬細胞相關蛋白表達水平Fig 2 Expression level of macrophage associated protein in each group
本研究發(fā)現(xiàn),Mnk1 可以影響LPS 刺激后的巨噬細胞炎癥水平,在體實驗顯示,KO 組小鼠腹腔注射LPS 后其血清炎癥因子IL-1β 和脾臟Mφ 的IL-1β表達水平均較WT 組明顯升高。Mnk1 KO 的Mφ在LPS 刺激后,其炎癥因子IL-1β、iNOS 和黏附因子LFA-1α 的表達較對照組和WT+LPS 組均有升高,M2 型Mφ 表面標志物CD206、Arg1 的表達較對照組和WT+LPS 組明顯下降,且KO 組Mφ 黏附率較WT 組顯著升高。進一步研究發(fā)現(xiàn),Mnk1 調(diào)節(jié)Mφ 炎癥可能是通過Spry2/ERK1/2 通路實現(xiàn)的,在驗證蛋白水平表達時發(fā)現(xiàn),較WT 組比較,LPS 刺激使Mnk1 KO 組的Mφ Spry2 表達下降,P-ERK1/2表達升高。Mφ 轉(zhuǎn)染過表達Spry2 的腺病毒并用LPS 刺激后,KO+AdSpry2 組Mφ Spry2 表達上升,P-ERK1/2 表達較KO+AdGFP 組明顯下降。
研究顯示,Mφ 分M1 和M2 兩種表型,LPS 可刺激Mφ 轉(zhuǎn)化為M1 型,使M1 表型標志物IL-1β、iNOS、TNF-α、IL-6 等表達升高,并使M2 表型標志物CD206、Arg1 表達降低[12-15]。LPS 刺激的小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 的水平顯著升高[16],LPS 刺 激的Mφ 中的LFA-1 表達顯著增加[17],且LPS 刺激可使Mφ 黏附能力增強[18]。提示LPS 刺激可增強Mφ 促炎表型,減弱了Mφ 向M2 型極化及其抗炎作用,Mφ 黏附作用也相應增強。本研究中,LPS 刺激使Mnk1 KO 組 小 鼠 血 清IL-1β 和 脾 臟Mφ 的IL-1β 表達均較WT 組明顯升高;LPS 刺激后,Mnk1 KO 組Mφ 的 IL-1β、iNOS 和LFA-1α 的表達較對照組和WT+LPS 組 均 明 顯 升 高,M2 型Mφ 表 面 標 志 物CD206、Arg1 的表達較對照組和WT+LPS 組明顯下降。因此,Mnk1 KO 后,在LPS 刺激下,Mφ 向M1 型極化增加,向M2 型極化減少,Mφ 黏附率及黏附相關因子表達上調(diào),故Mnk1 在LPS 刺激條件下,可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化和黏附。
有研究指出,Spry2 通過與GRB2 結合,抑制Ras/ERK 信 號 通 路[19,20]。更 有 研 究 顯 示,Mnk1 缺失會導致顯著的心肌肥大、纖維化、功能障礙和心肌細胞凋亡,Mnk1 的抗心肌肥厚作用可能是通過調(diào)節(jié)Spry2 的表達,抑制ERK1/2 的激活而實現(xiàn)的[11]。提示Mnk1 與Spry2/ERK1/2 信號通路密切相關。本研究中,LPS 刺激后,Mnk1 KO 小鼠脾臟Mφ 的Spry2 mRNA 表達水平較PBS 刺激的對照組顯著下調(diào);且Mnk1 KO 小鼠腹腔Mφ 中Spry2 mRNA 和Spry2 蛋白表達水平較PBS 組明顯下降;進一步研究顯示,LPS 刺激后,Mnk1 KO 小鼠腹腔Mφ 中P-ERK1/2 表達水平較WT 組明顯升高;使用過表達Spry2 腺病毒恢復LPS 刺激后Mnk1 KO 小鼠腹腔Mφ 中Spry2 表達,抑制P-ERK1/2 的表達。因 此,LPS 刺 激 的Mφ 中,Mnk1 參 與 了Spry2/ERK1/2 信號通路的調(diào)控。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Mnk1 基因敲除可增強LPS 誘導的Mφ 炎癥反應,其機制可能是通過調(diào)節(jié)Spry2/ERK1/2 通路發(fā)揮作用。本研究提示Mnk1有可能成為調(diào)節(jié)炎癥性疾病的靶點,為治療巨噬細胞參與的相關炎癥疾病提供實驗依據(jù)。
作者貢獻度說明:
夏紅霞:負責參與實驗、查閱文獻及論文撰寫;唐其柱:負責課題設計指導、試劑和相關耗材購買、文章寫作指導;周恒:論文撰寫和校對;劉哲宇:負責數(shù)據(jù)分析并參與實驗。
所有作者聲明不存在利益沖突關系。