高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析

呂愛民 柳 嘯

（湖北省監(jiān)利市監(jiān)利中學(xué) 湖北荊州 433300）

近幾年高考試題和模擬題中出現(xiàn)了大量與引物有關(guān)的試題，而現(xiàn)有高中生物學(xué)教材只提及PCR 技術(shù)需要引物。為什么需要引物？引物是什么？引物的作用是什么？引物的堿基序列如何設(shè)計？PCR 循環(huán)時需要多少引物？如何選擇引物和判斷引物的互補鏈？引物與PCR 反應(yīng)時復(fù)性溫度的高低和時間長短有什么關(guān)系？這些相關(guān)問題在教材中并未提及，需要教師對上述相關(guān)問題進行歸類分析。

筆者在基因工程專題的復(fù)習(xí)過程中構(gòu)建了以引物為核心的知識網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），培養(yǎng)學(xué)生學(xué)科內(nèi)知識的綜合能力，拓展學(xué)生視野，提高學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)。各個擊破相關(guān)知識點，夯實學(xué)生的基礎(chǔ)，加深對引物的理解。利用精選的典型試題，強化鞏固知識，提升學(xué)生的解題能力。同時從側(cè)面為教師的教學(xué)提供參考，提升對教學(xué)廣度和深度的把控。

圖1 “引物”知識網(wǎng)絡(luò)圖

1 引物存在的必要性

1.1 DNA 的復(fù)制需要引物 DNA 聚合酶只能催化脫氧核糖核苷酸加至已有核酸鏈的游離3′-羥基上，而不能使脫氧核糖核苷酸自身發(fā)生聚合，即它需要引物鏈的存在[1]。引物是一小段DNA 或RNA，它能與DNA 母鏈的一段堿基互補配對。細胞內(nèi)DNA 復(fù)制以RNA 作引物，從新合成的岡崎片段上發(fā)現(xiàn)含有一短暫存在的小的RNA 片段附著在5′端這一事實，可說明DNA 復(fù)制時需要RNA引物，這些引物長5～10 bp，現(xiàn)已知RNA 引物的合成是由一種特殊的RNA 合成酶——引物酶所催化的[2]。PCR 反應(yīng)以DNA 作引物。

例1（2011年江蘇卷），請回答基因工程方面的有關(guān)問題：PCR 反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA 聚合酶，下面的表達式（圖2）不能正確反映DNA 聚合酶的功能，這是因為_____。

圖2 DNA 聚合酶催化的反應(yīng)的表達式

答案：DNA 聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合至雙鏈DNA片段的引物鏈上。

1.2 引物的作用 DNA 聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA 鏈。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA 聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA 鏈。不同的引物可結(jié)合不同的目的基因并進行擴增。

例2，請回答基因工程方面的有關(guān)問題：

1）若用PCR 技術(shù)擴增psy基因和crtI基因，需要分別在不同的PCR 擴增儀中加入__種引物，其作用是________。

2）在利用PCR 技術(shù)擴增R（抗旱）或r基因過程中，利用___可尋找抗旱基因的位置并進行擴增。

答案：1）2；引物與DNA 模板鏈通過堿基互補配對結(jié)合，使DNA 聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，從而延伸DNA 子鏈；2）引物。

例3，為研究水稻D基因的功能，研究者將TDNA 插入到D基因中（圖3），致使該基因失活，失活后的基因記為d。為驗證F2植株基因型（DD、Dd和dd），研究者根據(jù)D基因、T-DNA 的序列，設(shè)計了3 種引物，如圖4所示。

圖3 將T-DNA 插入到D 基因

圖4 3 種引物的堿基序列

隨機選取F2植株若干，提取各植株的總DNA，分別用引物“Ⅰ+Ⅲ”組合及“Ⅱ+Ⅲ”組合進行PCR，檢測是否擴增（完整的T-DNA 過大，不能完成PCR）。

如果引物“Ⅰ+Ⅲ”組及“Ⅱ+Ⅲ”組進行PCR均可完成擴增，則相應(yīng)植株的基因型為__。

如果_______，則相應(yīng)植株的基因型為__。

如果_______，則相應(yīng)植株的基因型為__。

答案：Dd；僅引物“Ⅰ+Ⅲ”組進行PCR 能完成擴增，而“Ⅱ+Ⅲ”組不能完成擴增；dd；僅引物“Ⅱ+Ⅲ”組進行PCR 能完成擴增，而“Ⅰ+Ⅲ”組不能完成擴增；DD。

2 引物的設(shè)計

2.1 設(shè)計引物的原則 引物是根據(jù)目的基因特有的一段已知的核苷酸序列設(shè)計合成的，能與目的基因的模板鏈通過堿基互補配對特異性地結(jié)合。

設(shè)計引物的主要原則為[1]：①引物長度應(yīng)大于16 個核苷酸，可防止隨機結(jié)合；②引物與靶序列間的Tm不應(yīng)過低；③引物不應(yīng)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即不能有4 bp 以上的回文序列；④2 個引物間不應(yīng)有4 bp 以上的互補序列或同源序列，在3′端不應(yīng)有任何互補的堿基；⑤引物中堿基的分布盡可能均勻，G+C 含量接近50%。

例4，請回答基因工程方面的有關(guān)問題：

1）通過PCR 技術(shù)可在DNA 分子中專一性擴增出某目的基因，其原因是______。

2）（2011年江蘇卷）請回答基因工程方面的有關(guān)問題：設(shè)計引物是PCR 技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的2組引物（圖5）都不合理，請分別說明理由。

圖5 設(shè)計的2組引物部分堿基序列

①第1 組：_____；②第2 組：_____。

3）科研過程中，可用PCR 技術(shù)檢測受體細胞是否成功轉(zhuǎn)入了目的基因。提取轉(zhuǎn)染后的細胞的全部DNA 分子，用目的基因的引物擴增。擴增完畢后，檢測發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物中除目的基因外，還有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有______。

①模板受到污染；②退火溫度過高；③引物太短；④延伸溫度偏低。

答案：1）引物是根據(jù)目的基因的一段已知核苷酸序列設(shè)計合成的（或引物能與目的基因通過堿基互補配對結(jié)合）；2）第1 組：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效；第2 組：引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效；3）①③。

2.2 引物的處理 由于引物延伸從3′端開始，3′端不能進行任何修飾，引物5′端對擴增特異性影響不大，因此，可給予修飾而不影響擴增特異性。引物5′端修飾包括加酶切位點、標(biāo)記生物素、熒光等[3]。為了使經(jīng)PCR 擴增的目的基因能與運載體正常結(jié)合，需要在2種引物的5′端添加不同的限制酶的識別序列。在2種引物的5′端上添加不同的限制酶識別序列，是為了保證目的基因定向插入運載體并可避免目的基因自身環(huán)化。

例5（2018年江蘇卷），為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶，研究人員從某種海洋細菌中克隆了α-淀粉酶基因（1 656 個堿基對），利用基因工程大量制備α-淀粉酶。為了便于擴增的DNA 片段與表達載體連接，需在引物的____端加上限制性酶切位點，且常在2 條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是_________。

答案：5′；使DNA 片段能定向插入表達載體，減少自連。

2.3 引物的特點 綜合2.1 和2.2 可知，引物具有以下幾個特點：①引物能與DNA 模板通過堿基互補配對結(jié)合；②2種引物之間不能互補配對；③某一引物不能自身折疊出現(xiàn)局部堿基互補配對；④需要在2 種引物的5′端添加不同的限制酶的識別序列；⑤引物不能太短。

3 PCR 循環(huán)時與引物相關(guān)的計算

PCR 的原理是DNA 分子的半保留復(fù)制，所以要根據(jù)DNA 分子的2 條模板鏈設(shè)計2 種引物。PCR 循環(huán)時需要的引物數(shù)量的計算有2種方法。

方法1：第n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA 數(shù)為2n，根據(jù)DNA 分子的半保留復(fù)制可知，需要的引物數(shù)為2n個，從第1 次循環(huán)開始，需要引物的個數(shù)依次為2 個、22個、23個……2n個，故PCR 過程經(jīng)過n次循環(huán)，需要的引物總個數(shù)是2+22+23+……+2n=2n+1-2。

方法2：PCR 經(jīng)過n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA 數(shù)為2n，一共有2n+1條鏈，其中有2條鏈是DNA 母鏈，不含引物，其他的每1 條鏈均含1 個引物，并且2 種引物的數(shù)量相等，故PCR 過程經(jīng)過n次循環(huán)，需要的引物總個數(shù)是2n+1-2，需要某一種引物的總個數(shù)是（2n+1-2）×1/2=2n-1。2n個DNA 中，一個DNA 由1 條母鏈和第1 種引物延伸的子鏈組成，另一個DNA 由另一條母鏈和第2 種引物延伸的子鏈組成，其他的DNA 均由2 種引物延伸的2 條子鏈組成。

例6，通過PCR 方法獲得某目的基因，首先需要設(shè)計______（填“一對”或“一個”）引物，PCR 過程經(jīng)過4 次循環(huán)，第4 次循環(huán)時需要的引物的數(shù)量是__個，4次循環(huán)一共需要的引物的總數(shù)量是____個。

答案：一對；16；30。

例7（2011年江蘇卷），請回答基因工程方面的有關(guān)問題：利用PCR 技術(shù)擴增目的基因，其原理與細胞內(nèi)DNA 復(fù)制類似（圖6）。圖中引物為單鏈DNA 片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。

圖6 PCR 的原理示意圖

①從理論上推測，第4 輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A 的DNA 片段所占的比例為____。

②在第___輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA 片段。

答案：①15/16；②三。

4 引物的選擇和互補鏈的判斷

DNA 聚合酶只能特異性地復(fù)制處于2 個引物之間的DNA 序列，引物5′端的堿基與DNA 母鏈3′端的堿基進行堿基互補配對，可作為DNA 復(fù)制的起始點，DNA 子鏈的合成方向是從引物的5′端向3′端延伸。可利用這一特點判斷引物及引物的互補鏈。

例8（2016年江蘇卷），為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，平板上長出的菌落，常用PCR 鑒定，所用的引物組成為圖7中的。

圖7 引物組成圖

答案：引物甲和引物丙。

例9，下圖是為了擴增某目的基因所用引物的分布示意圖（圖8），已知引物組合1 和2、3 和4可擴增相關(guān)的目的基因，則引物1、3 與___（填α鏈或β 鏈）形成堿基互補配對關(guān)系。

圖8 引物的分布示意圖

答案：β鏈。

5 引物與PCR 反應(yīng)時復(fù)性溫度的高、低和時間長、短的關(guān)系

PCR 的每次循環(huán)可分為變性（90～95℃）、復(fù)性（55～60℃）和延伸（70～75℃）3 步。變性的溫度與目的基因中G+C 含量有關(guān)；變性時間的長短與目的基因的長短有關(guān)，目的基因越長，變性的時間就越長。復(fù)性是讓2 種引物通過堿基互補配對與2 條單鏈DNA 結(jié)合，復(fù)性的溫度與引物中G+C 含量有關(guān)，G-C 堿基對間有3 個氫鍵，A-T 堿基對間只有2 個氫鍵，引物中G+C 含量較高，復(fù)性時溫度就較高；復(fù)性時間的長短與引物的長短有關(guān)，引物越長，復(fù)性的時間就越長。延伸的溫度不能太高，以防止新合成的子鏈DNA 與母鏈DNA 解聚為單鏈，延伸的溫度也不能太低，是為了保證Taq 酶的活性；延伸所需要的時間長短與目的基因的長短有關(guān)，目的基因越長，延伸所需要的時間就越長。

例10（2008年江蘇卷），將動物致病菌的抗原基因?qū)腭R鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過程相關(guān)的圖和表。PCR 過程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類設(shè)定。表1為根據(jù)模板設(shè)計的2 對引物序列，圖9為引物對與模板結(jié)合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？__________。

表1 引物對序列表

圖9 引物對與模板結(jié)合示意圖

答案：引物對B。

例11，請回答PCR 擴增時與退火溫度、延伸溫度與延伸時間有關(guān)的問題：

1）（2018年江蘇卷）進行PCR 擴增時，反應(yīng)的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設(shè)定，下列選項中___的設(shè)定與引物有關(guān)，___的設(shè)定與擴增片段的長度有關(guān)。（填序號）

①變性溫度；②退火溫度；③延伸溫度；④變性時間；⑤退火時間；⑥延伸時間。

2）（2017年江蘇卷）PCR 擴增時，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會破壞___的堿基配對。退火溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，長度相同但___的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。

3）（2017年江蘇卷）如果PCR 反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物，可采取的改進措施有___（填序號）。

①升高退火溫度；②降低退火溫度；③重新設(shè)計引物。

4）（2021年湖北省元月聯(lián)考）通過PCR 方法獲得eGFP 目的片段，首先需要設(shè)計___（填“一對”或“一個”）引物，在體外選擇性擴增eGFP 目的片段。PCR 反應(yīng)一般由95℃熱變性、55～60℃引物和模板配對、72℃延伸3個步驟，經(jīng)過多次循環(huán)完成。延伸階段選用72℃是綜合考慮了2個因素，這2 個因素是_____和_____。

答案：1）②；⑥；2）引物與模板；GC 含量高；3）②③；4）一對；防止DNA 變性；保證Taq 酶所需溫度條件。

提高能力應(yīng)以落實基礎(chǔ)知識為前提，上述典型例題圍繞引物的相關(guān)知識點以考查基礎(chǔ)知識為首要目標(biāo)，落實對基本概念的理解，例如，引物應(yīng)該成對存在、引物5′端與DNA 母鏈3′端堿基互補配對、DNA 子鏈只能從引物的3′端開始延伸等；同時對引物的設(shè)計與處理、與引物相關(guān)的計算及PCR 反應(yīng)時復(fù)性溫度的高低和時間長短等知識點，又可考查學(xué)生的科學(xué)思維和運用知識的能力?！癙CR 反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物”或“擴增產(chǎn)物中除目的基因外還有其他不同大小片段的非目的基因片段”引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注引物在PCR 技術(shù)中的應(yīng)用并學(xué)會解決科學(xué)研究中遇到的問題。教師應(yīng)該在落實基礎(chǔ)知識的同時重視對引物的歸納整理，重視教學(xué)提升，鍛煉學(xué)生的思維，跳出考題。教師應(yīng)該重視滲透科學(xué)、技術(shù)、社會相互關(guān)系的教育，通過具體事例幫助學(xué)生認識生物學(xué)與社會發(fā)展的緊密聯(lián)系[4]。引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注科學(xué)知識在生活、生產(chǎn)技術(shù)中的應(yīng)用，努力將學(xué)生培養(yǎng)成創(chuàng)新型的人才。