PHF19 在肺腺癌中的表達及對免疫微環(huán)境的影響

謝軍瑤，鞏健男，韓曉瑾，李建強

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，山西 太原 030002）

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因之一［1］。其中，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是肺癌最常見的組織學(xué)類型，約占所有肺癌的50%。LUAD具有惡性程度高、早期缺乏典型的臨床癥狀、早期易發(fā)生局部浸潤和轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差等特點［2］。近幾十年來，包括非侵入性手術(shù)切除、化療、放療和免疫治療在內(nèi)的多模式治療策略已取得巨大進展，但LUAD 的治愈結(jié)果仍不令人滿意，5 年的相對總生存率約為22%［3］。為了提高患者生存率，迫切需要確定預(yù)后標志物和有效的藥物靶點。

多梳蛋白家族（polycomb group protein， PcG）是形成染色質(zhì)修飾復(fù)合物的重要表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，其組成與細胞環(huán)境相關(guān)。在哺乳動物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種主要的多梳蛋白抑制復(fù)合物（polycomb repressive complex， PRC），即PRC1（組蛋白泛素連接酶）和PRC2（組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶）。PRC 在表觀遺傳修飾的啟動和維持中起重要作用，并參與癌癥的發(fā)生和進展。PHD 鋅指蛋白19（PHD finger protein 19， PHF19）包含一個Tudor 結(jié)構(gòu)域，兩個植物同源結(jié)構(gòu)域和一個擴展同源結(jié)構(gòu)域，是PRC2 中的重 要 成 員 之 一［4，5］。PHF19 可 通 過 自 身Tudor 區(qū) 域結(jié)合于H3 賴氨酸36 位點來參與染色體活化［6］。PHF19 在表觀遺傳調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，是多 種 病 理 生 理 過 程 的 關(guān) 鍵 調(diào) 控 因 子［7，8］。另 外，PHF19 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲過程中起著重要作用。Zhu 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，PHF19 是與肝細胞癌免疫浸潤和預(yù)后相關(guān)的致癌指標。Jain 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，PHF19 在控制前列腺癌細胞增殖和侵襲性之間的平衡方面有重要作用。Schinke 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，PHF19 可作為多發(fā)性骨髓瘤的治療靶點。然而，PHF19 在LUAD 中的作用尚不清楚。

眾所周知，免疫治療是近年來出現(xiàn)的一種高效的腫瘤治療方法。之前的研究表明［12］，腫瘤微環(huán)境（the tumor microenvironment，TME）中細胞的成分在腫瘤增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移、化療耐藥性以及癌癥的其它標志中起調(diào)節(jié)作用。Zhang 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，TME 中腫瘤浸潤免疫細胞（tumor-infiltrating immune cells，TIICs）調(diào)節(jié)癌癥的進展并發(fā)揮潛在的預(yù)后價值。由于TIICs 是有吸引力的治療靶點，因此發(fā)現(xiàn)更多的免疫靶點或免疫機制對于TIICs 的研究至關(guān)重要。然而，對PHF19 與免疫浸潤的相關(guān)性知之甚少。

本研究探討了PHF19 在LUAD 中的表達水平、臨床預(yù)后、遺傳改變、甲基化值、生物學(xué)功能和免疫調(diào)節(jié)作用。其中，主要探討了PHF19 表達與LUAD 免疫調(diào)節(jié)之間的潛在關(guān)系?？傊?，本研究提示PHF19 在LUAD 中具有重要的預(yù)后價值和免疫相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取和預(yù)處理

所有原始數(shù)據(jù)均從癌癥基因組圖譜（TCGA）（https：//cancergenome.nih.gov/）數(shù) 據(jù) 庫 中 下 載。從TCGA 數(shù)據(jù)庫獲取TCGA-LUAD 的RNA 隊列數(shù)據(jù)，并對所有數(shù)據(jù)進行歸一化處理以去除丟失和重復(fù)的結(jié)果。

1.2 PHF19 在LUAD 中的表達分析

利 用TIMER 數(shù) 據(jù) 庫［14］（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）的“Diff Exp”模塊分析了泛癌中PHF19 的表達譜。Wilcoxon 檢驗比較差異表達情況，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

利 用UALCAN 數(shù) 據(jù) 庫［15］（http：//ualcan.path.uab.edu）分析PHF19 的表達在LUAD 不同臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等中的差異。t檢驗分析表達差異，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 PHF19 表達在LUAD 患者中的預(yù)后價值

通過Kaplan-Meier 生存曲線和Log rank 檢驗對PHF19 mRNA 高表達組和低表達組的TCGALUAD 隊列進行生存分析，以評估PHF19 表達在LUAD 患者總生存期（OS）的預(yù)后價值，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 PHF19 在LUAD 中的基因突變分析

利 用cBioPortal 數(shù) 據(jù) 庫［16］（http：//www.cbioportal.org/）分 析 了230 例LUAD 患 者PHF19 基 因的突變情況，并且可視化每個個體樣本中突變的完整細節(jié)。

利用TIMER 數(shù)據(jù)庫評估PHF19 與TP53 突變的關(guān)系。Wilcoxon 檢驗比較差異表達情況，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 PHF19 在LUAD 中的啟動子甲基化水平分析

為了確定LUAD 中PHF19 啟動子的甲基化水平，利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析正常和腫瘤組織之間的PHF19 甲基化值。t檢驗分析表達差異，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 PHF19 共表達基因的富集分析

LinkedOmics 數(shù) 據(jù) 庫［17］（http：//www.linkedomics.org/login.php）包含了來自TCGA 數(shù)據(jù)庫32 種癌癥類型的多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。在LinkedOmics 的“LinkFinder”模 塊 中，使 用Pearson 檢 驗 對PHF19 的共表達基因進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，并通過熱圖和火山圖顯示結(jié)果。在“LinkInterpreter”模塊中，利用基因集富集分析（Gene set enrichment analysis， GSEA）對PHF19及其共表達基因的GO 功能和KEGG 通路進行了探索。最 后，基 于KEGG 數(shù) 據(jù) 庫［18］（https：//www.kegg.jp/），探索 PHF19 及其關(guān)聯(lián)基因在細胞周期通路中的作用和位置關(guān)系并生成路線圖。

1.7 PHF19 與腫瘤免疫細胞浸潤的相關(guān)性分析

利用TIMER 數(shù)據(jù)庫“Gene”模塊探索PHF19表達與TIICs 浸潤水平之間的關(guān)系，利用“Correlation”模塊探索PHF19 表達與TIICs 的免疫標志物和免疫檢查點相關(guān)基因之間的關(guān)系。采用Spearman 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHF19 在泛癌中的表達分析

利用TIMER 分析了來自TCGA 數(shù)據(jù)庫的PHF19 mRNA 在不同腫瘤組織和鄰近正常組織中的表達差異。結(jié)果顯示，PHF19 在泛癌中上調(diào)，而在LUAD 組織中顯著上調(diào)（P＜0.001），見圖1。

圖1 PHF19 在泛癌中的表達Fig 1 Expression of PHF19 in pan-cancer

2.2 PHF19 表達與LUAD 臨床病理特征的關(guān)系

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析PHF19 表達在LUAD 組織和正常肺組織中的差異，結(jié)果顯示：515例LUAD 組織中PHF19 的表達明顯高于59 例正常肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝1.624E-12），見圖2A。

分析PHF19 表達在LUAD 中不同臨床分期中的差異，結(jié)果顯示：Stage 1 組、Stage 2 組、Stage 3 組和Stage 4 組中PHF19 的表達與正常肺組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜1E-12，P＜1E-12，P＝1.624E-12，P＝3.417E-06），見圖2B。

分析PHF19 表達在LUAD 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的差異，結(jié)果顯示：N0組、N1組、N2組中PHF19的表達與正常肺組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜1E-12，P＜1E-12，P＝1.626E-12），而在N3 組患者中PHF19的表達無統(tǒng)計學(xué)差異（1.349E-01），見圖2C。

2.3 PHF19 表達與患者總生存期的關(guān)系

PHF19 低表達組患者的OS 明顯高于PHF19高表達組（HR=1.21，P=0.022），見圖2D。結(jié)果表明，PHF19 表達與患者OS 顯著相關(guān)，可成為預(yù)測LUAD 患者生存的一個生物標志物。

2.4 PHF19 在LUAD 中 的 基 因 突 變

利用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫分析了LUAD 中PHF19 的突變狀態(tài)，結(jié)果顯示：0.9%的患者出現(xiàn)遺傳變異，擴增和錯義突變是最常見的突變，見圖3A、B。

利用TIMER 數(shù)據(jù)庫評估PHF19 與TP53 突變的關(guān)系，結(jié)果顯示：TP53 突變體中PHF19 表達明顯高于TP53 野生型，即PHF19 的高表達與TP53 的突變呈正相關(guān)（P＜0.001），見圖3C。

圖3 PHF19 在LUAD 中的基因突變Fig 3 PHF19 gene mutation in LUAD

2.5 PHF19 在LUAD 中的啟動子甲基化

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫比較了正常組織和腫瘤組織之間PHF19 的甲基化值。結(jié)果顯示，PHF19的啟動子甲基化水平在LUAD 中顯著降低（P=4.088E-05），表明PHF19 的轉(zhuǎn)錄表達可能是由于啟動子甲基化的改變，見圖4。

圖4 LUAD 中PHF19 的啟動子甲基化水平Fig 4 Promoter methylation levels of PHF19 in LUAD

2.6 PHF19 共表達基因的富集分析

基于515 名TCGA -LUAD 患者的PHF19 mRNA 測序數(shù)據(jù)，利用LinkedOmics 的“LinkFinder”模塊，分析PHF19 在LUAD 中的共表達基因，以探索其在腫瘤組織中的潛在功能。深紅色點表示的基因與PHF19 呈正相關(guān)，深綠點表示的基因與PHF19 呈負相關(guān)（FDR＜0.01），見圖5A。并且篩選出關(guān)聯(lián)最緊密和最疏遠的Top 50 基因繪制熱圖，見 圖5B、C。 在“LinkInterpreter”模 塊 中，利 用GSEA 對PHF19 及其共表達基因的GO 功能和KEGG 通路進行探索。GO 項分析表明，這些關(guān)聯(lián)基因主要富集于染色體分離、DNA 復(fù)制、細胞周期檢查點、雙股斷裂修復(fù)、細胞周期G2/M 相變、細胞周期G1/S 相變等生物過程中，見圖5D。KEGG 分析主要富集于細胞周期、DNA 復(fù)制、同源重組、黃體酮介導(dǎo)的卵母細胞成熟、錯配修復(fù)、卵母細胞減數(shù)分裂、p53 信號通路、核苷酸切除修復(fù)等通路中，其中，以細胞周期通路最明顯，見圖5E。此外，進一步探索PHF19 及關(guān)聯(lián)基因在細胞周期通路中的作用和位置關(guān)系，生成路線圖并用紅色標記標出通路中對應(yīng)基因的相關(guān)位置，大部分基因與細胞周期的G1/S 期和G2/M 期有關(guān)，見圖5F。這些結(jié)果表明，PHF19 可能參與LUAD 細胞增殖和凋亡。

圖5 LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫分析LUAD 組織中的PHF19 共表達基因Fig 5 The PHF19 co-expressed gene in LUAD tissues analysed by the LinkedOmics database

2.7 PHF19 表達與TIICs 浸潤水平之間的關(guān)系

PHF19 的表達與CD4+T 細胞（r=0.136，P=2.80E-03）、中性粒細胞（r=0.169，P=1.96E-04）、樹突狀細胞（r=0.163，P=3.02E-04）的浸潤呈顯著正相關(guān)，與B 細胞、CD8+T 細胞、巨噬細胞的浸潤呈無相關(guān)性（P＞0.05），見圖6。

圖6 LUAD 組織中PHF19 表達與TIICs 浸潤水平之間的關(guān)系Fig 6 Relationship between PHF19 expression and TIICs infiltration level in LUAD tissues

2.8 PHF19表達與TIICs的免疫標志物之間的關(guān)系

PHF19 的表達與CD8+T 細胞的免疫標志物（CD8A、CD8B）、CD4+T細胞的免疫標志物（CD4）、M1型巨噬細胞的免疫標志物（IRF5）、M2型巨噬細胞的免疫標志物（CD163、VSIG4）、中性粒細胞的免疫標志物（ITGAM）、樹突狀細胞的免疫標志物（NRP1、ITGAX）呈正相關(guān)，與中性粒細胞的免疫標志物（CEACAM8）、樹突狀細胞的免疫標志物（CD1C）呈負相關(guān)，見表1。

表1 通過TIMER 數(shù)據(jù)庫檢測LUAD 組織中PHF19 表達與TIICs 的免疫標志物之間的關(guān)系Tab 1 The relationship between the expression of PHF19 in LUAD tissue and the immune markers of TIICs detected by the TIMER database

2.9 PHF19表達與免疫檢查點相關(guān)基因之間的關(guān)系

PHF19 的表達與LUAD 組織TME 中PD-L1、PD-1 和CTLA-4 相關(guān)基因的表達密切相關(guān)（均P＜0.05），表明PHF19 可能通過參與LUAD 的免疫逃逸從而導(dǎo)致癌癥發(fā)生，見圖7。

圖 7 LUAD組織中PHF19表達與免疫檢查點相關(guān)基因之間的關(guān)系Fig 7 Relationship between PHF19 expression and immune checkpoint related genes in LUAD tissues

3 討論

LUAD 是一種惡性腫瘤，其特征是肺和支氣管中細胞不受控制的生長。盡管過去幾十年LUAD的診斷和治療取得了很大進展，但晚期患者的預(yù)后仍然很差。其中，大量研究集中在LUAD 的免疫治療上，幾種免疫檢查點抑制劑提高了晚期LUAD 患者的存活率［19］。然而，由于治療上耐藥，大量患者逐漸對免疫治療無反應(yīng)。因此，探索LUAD 的敏感診斷和預(yù)后的生物標志物至關(guān)重要。

表觀遺傳機制與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌發(fā)展的不同階段發(fā)生了各種各樣的表觀遺傳修飾，其中一些修飾是腫瘤進展的關(guān)鍵［20］。表觀遺傳學(xué)是指影響基因表達而不修改主基因組DNA 序列的有絲分裂遺傳變化。表觀遺傳特征包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 和染色質(zhì)的重塑。表觀遺傳調(diào)控基因突變引起的表觀基因組圖譜變化具有明確的臨床意義，尤其對預(yù)后風險分層及預(yù)測疾病進展或復(fù)發(fā)具有重要意義［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，0.9%的LUAD 患者出現(xiàn)了PHF19 遺傳變異，擴增和錯義突變是最常見的突變，提示PHF19 可能成為LUAD 的預(yù)測指標。眾所周知，TP53 突變是LUAD 中最常見的突變之一，它影響LUAD 的進展和預(yù)后。TP53 突變體中PHF19 的表達明顯高于TP53 野生型，這可以部分解釋TP53 的突變可以促進LUAD 的進展。之前的研究還發(fā)現(xiàn)［22］，LUAD 中的TP53 突變狀態(tài)與較高的PD-L1 表達水平相關(guān)。上述結(jié)果為LUAD 的免疫治療進一步提供支持。另外，啟動子DNA 甲基化已被證明會影響轉(zhuǎn)錄抑制并參與腫瘤腫瘤發(fā)生［23］。上述分析結(jié)果顯示，PHF19 的啟動子甲基化水平在LUAD 中顯著降低，表明PHF19 的轉(zhuǎn)錄表達可能是由于啟動子甲基化的改變。

為了進一步了解PHF19 參與致癌的潛在分子機制，本研究首先利用LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫確定PHF19 的共表達基因，結(jié)果顯示，LUAD 中與PHF19 共表達的基因有ASF1B、HMGB2、CDT1、KIF18B、PTTG1 等。其 中，與PHF19 最 相 關(guān) 的ASF1B 和HMGB2 已經(jīng)被證實可以促進LUAD 的增 殖 和 侵 襲，并 可 以 作 為 潛 在 靶 標［24，25］。這 提 示PHF19 可能參與LUAD 的進展。接下來，通過功能富集分析了PHF19 共表達基因在LUAD 中的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。GO 項分析發(fā)現(xiàn)，PHF19 的生物學(xué)過程主要集中在細胞分裂過程中。KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，PHF19 在細胞周期途徑中顯著富集。同時，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫進一步探索了PHF19 及關(guān)聯(lián)基因在細胞周期通路中的作用和位置關(guān)系，可視化發(fā)現(xiàn)大部分相關(guān)基因與細胞周期的G1/S 期和G2/M 期有關(guān)，進一步表明PHF19 可能通過細胞周期通路參與LUAD 進 展。Mason M 等［26］研 究 發(fā) 現(xiàn)，低 水 平 的PHF19 可以導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤的生長和細胞周期停滯。García-Montolio 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，慢性髓系白血病細胞中低水平的PHF19 可以引起細胞周期停滯并促進其向紅系途徑分化。這與本研究分析的結(jié)果一致，故我們推測PHF19 可能是LUAD 腫瘤細胞增殖的必要條件。

癌癥的生長和擴散不僅取決于腫瘤細胞的特征，還取決于與TME 中TIICs 的相互作用，這與LUAD 患者的生存率呈正相關(guān)［28］。本研究表明，PHF19 的表達不僅與TME 中部分免疫細胞亞型浸潤相關(guān)，而且還與這些免疫細胞的生物標志物相關(guān)，但不絕對一致。Zhang 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，TME 中的中性粒細胞浸潤增強了非小細胞肺癌細胞在體外的增殖和侵襲能力。另外，由于樹突狀細胞具有啟動和調(diào)節(jié)T 細胞反應(yīng)的獨特能力，已被廣泛用于肺癌在內(nèi)的許多腫瘤的免疫治療［30］。上述結(jié)果提示，TIICs 可能是PHF19 介導(dǎo)的LUAD 致癌作用的部分原因。免疫檢查點阻斷法已經(jīng)成為各種惡性腫瘤的標準治療方法。然而，只有一小部分特定類型的癌癥患者對免疫治療有反應(yīng)，這可能是由于免疫激活不足，無法識別腫瘤特異性抗原［31］。因此，必須確定其它潛在的治療靶點。之前研究已經(jīng)表明，PD-1、PD-L1 和CTLA-4 是負責腫瘤免疫逃逸的重要免疫檢查點。PD-1 通路是TME 局部免疫抑制的關(guān)鍵介質(zhì)［32］，通過抑制免疫細胞上的PD-1 受體或腫瘤細胞上的PD-L1 配體來阻斷PD-1 途徑可以抑制腫瘤生長。本研究探討了PHF19 與3 種免疫檢查點相關(guān)基因之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，LUAD 組織中二者呈顯著正相關(guān)，提示PHF19 可能在LUAD的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明，PHF19 可以作為LUAD 免疫治療的有效靶點，為腫瘤患者的臨床治療提供新的希望。

總之，本研究利用生物信息學(xué)分析技術(shù)，探討了PHF19 在LUAD 中的表達水平、臨床預(yù)后、遺傳改變、甲基化值、生物學(xué)功能和免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，PHF19 可能是LUAD 患者一種新的潛在預(yù)后和免疫相關(guān)生物標志物。本研究為進一步研究PHF19 在LUAD 的發(fā)展和治療中的具體機制奠定了基礎(chǔ)。然而，這項研究是基于公共數(shù)據(jù)庫的，所以有一些局限性。因此，還需要更多基礎(chǔ)實驗來驗證這種生物學(xué)影響。

作者貢獻度說明：

謝軍瑤：研究課題的提出、設(shè)計和論文初稿寫作；鞏健男：研究課題數(shù)據(jù)分析和論文修改；；韓曉瑾：數(shù)據(jù)獲取；李建強：審閱及指導(dǎo)工作。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。