宏基因組二代測序技術在艾滋病合并肺諾卡菌病診斷中的應用（附1例報告）

趙蕊，鄒俊

南寧市第四人民醫(yī)院［廣西艾滋病臨床治療中心（南寧）］感染科，廣西南寧 530023

諾卡菌在自然界廣泛存在，常寄生于腐物，形態(tài)為分枝棒狀，屬革蘭陽性需氧菌，部分諾卡菌抗酸染色結果表現(xiàn)為弱陽性，培養(yǎng)生長速度緩慢。諾卡菌病常見于艾滋病（AIDS）等免疫功能受損且伴有其他機會性感染患者，臨床表現(xiàn)無特異性，診斷依賴于病原學。由于諾卡菌與分支桿菌在形態(tài)、染色特征方面相似，臨床上易誤診。近年來，高通量測序技術不斷發(fā)展，逐步應用到感染性疾病領域，用于致病菌的快速精準鑒定。宏基因組二代測序技術（mNGS）可對感染標本直接進行高通量測序，保留并檢測樣本中全部病原信息，為AIDS復雜性感染提供快速精準診斷。本文報告1例老年AIDS合并諾卡菌病患者經常規(guī)診治及結合mNGS技術最終確診過程，總結臨床經驗，為該類疾病的快速準確診斷、治療及預后提供參考。

1 病例資料

1.1 基本資料 患者男，65歲，1個月前無明顯誘因下出現(xiàn)咳嗽，咳白色粘液痰，偶有咳血絲痰，伴乏力、納差、活動后氣促，無畏寒、寒戰(zhàn)，無胸痛、心悸、端坐呼吸。于南寧市第九人民醫(yī)院行胸部CT：左下肺團塊狀軟組織密度灶，考慮占位性病變（周圍肺癌可能性大）。抽血檢查提示HIV初篩陽性。遂于2020年11月16日轉入我院。既往體健，有不潔性行為史。

1.2 入院查體及實驗室檢查 體溫37.1 ℃，脈搏96 次/分，呼吸20 次/分，血壓95/59 mmHg，口腔黏膜未見白膜，心肺腹查體未見異常。全血細胞五分類+全程CRP：血紅蛋白78 g/L、中性粒細胞數(shù)6.4×109/L、淋巴細胞數(shù)0.5×109/L、超敏CRP（免疫熒光法）＞5 mg/L、CRP定量33.40 mg/L。血清淀粉樣蛋白A＞200 mg/L。血沉116 mm/h。血氣分析、降鈣素原（PCT）定量、新型隱球菌莢膜多糖抗原檢測、特殊腫瘤標志物五項、結核抗體均未見異常。曲霉菌半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖、血清呼吸道病原體IgM均為陰性。CD4+T淋巴細胞18個/微升。2020年11月18日胸部平掃+增強（圖1A），初步診斷：①肺部感染，結核待排；左肺下葉團片實變影，考慮感染性病變（馬爾尼菲藍狀菌或馬紅球可能）；②兩肺上葉間隙旁型肺氣腫；③主動脈、冠狀動脈硬化；④左側胸膜增厚，雙側胸腔少量積液；⑤肝內膽管輕度擴張。

1.3 診斷治療及預后 結合患者以上臨床資料，入院初步考慮AIDS可能性大，且合并細菌性肺炎。入院后予哌拉西林他唑巴坦（4.5 g靜滴，每8 h一次）、止血等對癥治療。患者仍有發(fā)熱、咳嗽、咳血絲痰癥狀。11月23日復查胸部CT提示肺部病灶較前增多（圖1B）。次日對患者肺穿刺組織行病理檢查（圖2）：鏡下肺組織局灶可見壞死伴大量中性粒細胞浸潤，未見肉芽腫及朗漢斯巨細胞，形態(tài)上傾向于化膿性炎癥?？顾幔ǎ?，糖原染色（－）。結核分枝桿菌復合群DNA未檢出。結合患者癥狀、胸部CT表現(xiàn)，不能排除肺結核可能，遂予加用異煙肼（0.3 g/d）、利福平（0.45 g/d）、乙胺丁醇（0.75 g/d）和吡嗪酰胺（1.5 g/d）診斷性抗結核分枝桿菌治療。11月25日HIV-1抗體確認試驗陽性，確立診斷：AIDS。因患者反復咯血，考慮哌拉西林他唑巴坦有引起出血可能，改為頭孢他啶（2 g靜滴，每8 h一次）抗感染。患者痰培養(yǎng)出陰溝腸桿菌復合菌、鮑曼不動桿菌（頭孢他啶、阿米卡星均敏感），根據(jù)藥敏結果加阿米卡星（0.2 g，每12 h一次）聯(lián)合抗感染治療，并予氣管鏡肺泡灌洗液送長沙賽哲醫(yī)學檢驗實驗室行mNGS檢測。肺泡灌洗液mNGS檢測檢出諾卡菌屬，檢出序列數(shù)512（91.59%）。患者免疫力低下，為諾卡菌病易感者，且mNGS檢出諾卡菌序列數(shù)高，診斷考慮合并諾卡菌病，予加用復方磺胺甲唑（1.44 g口服，3次/日）聯(lián)合阿米卡星抗諾卡菌治療。用藥后患者無發(fā)熱，咳嗽減少，無咳血絲痰。11月30日胸部CT提示病灶減少（圖1C）。12月3日患者癥狀好轉，結合肺穿刺病理及灌洗液結果，暫排除肺結核診斷，修正診斷為：AIDS合并肺諾卡菌病。予停用其余藥物，繼續(xù)復方磺胺甲唑聯(lián)合阿米卡星抗諾卡菌治療。

圖2 艾滋病合并諾卡菌肺炎患者肺穿刺組織病理檢查（蘇木精-伊紅染色法）

12月8日復查胸部CT（圖1D）提示肺部病灶減少。次日患者病情好轉出院。出院后繼續(xù)復方磺胺甲唑（1.44 g，3次/日）抗諾卡菌治療3個月，2020年12月12日開始艾考恩丙替片抗HIV治療，隨訪至2022年4月18日，患者一般情況可，無不適癥狀。

圖1 艾滋病合并諾卡菌肺炎患者胸部CT表現(xiàn)

2 討論

諾卡菌病多發(fā)生于免疫缺陷或長期應用免疫抑制劑的人群，且免疫缺陷患者比非免疫缺陷患者病情更嚴重，病死率明顯更高，但臨床表現(xiàn)無差異［1-2］。諾卡菌感染以肺諾卡菌病最為常見，考慮與諾卡菌經呼吸道侵入相關。主要臨床癥狀有咳嗽、咳痰，痰為膿性或血性，可伴發(fā)熱、盜汗、消瘦等類似結核中毒癥狀，胸部影像學檢查可表現(xiàn)為結節(jié)、大片滲出、實變、腫塊和空洞等多種形態(tài)，可伴有膿腫、胸腔積液［3-4］。肺外諾卡菌病包括顱內諾卡菌感染［5-6］、皮膚諾卡菌?。?］、諾卡菌角膜炎［8］和諾卡菌敗血癥等。AIDS患者機體免疫功能障礙，是諾卡菌病的好發(fā)人群，然而諾卡菌病并不是常見機會性感染，其診斷依賴于病原學，常規(guī)檢查方法包括直接涂片鏡檢和培養(yǎng)，陽性可確診。諾卡菌繁殖速度慢，一般2～7 d可見菌落，有時可能需要長達4周的時間，尤其是在選擇性分枝桿菌培養(yǎng)基上生長時。改良抗酸染色和革蘭染色涂片鏡檢對于在等待培養(yǎng)結果的同時提供快速推定診斷尤為重要［9］，臨床醫(yī)師懷疑諾卡菌感染時需與檢驗科微生物室充分溝通，以便采取措施針對性培養(yǎng)及早期識別。然而由于諾卡菌病較少見，且臨床表現(xiàn)無特異性，臨床及檢驗易忽略。

本病例中患者血培養(yǎng)、肺穿刺組織培養(yǎng)、肺泡灌洗液培養(yǎng)均為陰性，考慮與培養(yǎng)時間不足有關，如延長培養(yǎng)時間或可得到陽性結果。mNGS技術具有快速、準確的特點，應用mNGS技術檢測出諾卡菌不應被視為污染物，但需注意排除氣道定植菌可能，需結合患者臨床表現(xiàn)、影像學表現(xiàn)等綜合判斷。本病例中患者發(fā)熱、咳嗽、咯血，CT表現(xiàn)為大片實變影及結節(jié)、斑片、條索影，與報道相符，結合病原學證據(jù)及治療過程，最終診斷限定為AIDS合并諾卡菌肺炎。

近年來，mNGS技術對于感染性疾病的診斷價值逐步顯現(xiàn)，mNGS技術提取標本中全部核酸信息進行測序，可檢測樣本中全部微生物信息，為AIDS復雜性感染提供精準、及時的診斷。mNGS對所檢測標本中病原微生物具有全覆蓋、耗時短、無偏倚等優(yōu)勢，現(xiàn)已有較多關于應用mNGS技術輔助感染性疾病診斷的研究報道［11-12］，包括呼吸系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨關節(jié)、皮膚、眼內、血液等幾乎全身各部位感染［11］。特別是在一些免疫缺陷患者合并復雜感染，傳統(tǒng)檢驗難以確定的病原感染或罕見病原感染的病例中，mNGS技術在臨床診斷中表現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。本病例患者為AIDS合并肺部感染，由于免疫缺陷患者機會性感染表現(xiàn)不典型，本病例初始誤診為結核，經抗結核治療效果欠佳，完善肺泡灌洗液mNGS檢查后明確病原為較為少見的諾卡菌，最終調整治療方案后好轉。

mNGS技術缺點在于費用高，報告結果不能區(qū)分檢測出的微生物是否為致病菌，建議聯(lián)合傳統(tǒng)檢驗技術綜合判定，提高診斷的特異性和敏感性。送檢標本推薦血液、無菌體液或無菌病理組織。對于肺泡灌洗液標本，由于其可能混入氣管定植菌，因此需結合患者臨床表現(xiàn)、檢驗及影像學資料等進行綜合分析判定。檢測報告中序列數(shù)較高、排名靠前的病原微生物，需要排除污染菌、定植菌的可能后，可認為是感染致病菌。對于特殊致病病原體（如諾卡菌、支原體、流感病毒）、胞內菌（如結核、傷寒、布魯菌）、厚壁菌（如真菌）檢出序列數(shù)不高，也要考慮其為致病病原體的可能。本病例mNGS檢測出諾卡菌為特殊致病病原體，且臨床癥狀、體征、影像學表現(xiàn)均與肺諾卡菌病相符，經針對性抗諾卡菌治療后病情好轉，最終明確診斷。同樣，mNGS檢測技術也可能出現(xiàn)假陰性報告情況，可能原因有：應用抗生素后送檢、罕見病原體感染、胞內菌感染等，因檢出序列數(shù)少而未在報告中列舉，如臨床懷疑特定病原菌感染，可檢測后追溯原始數(shù)據(jù)庫查詢［13］。

諾卡菌病規(guī)范治療首選磺胺類藥物［10］。在重癥感染或免疫抑制患者中，需要兩種或以上的藥物聯(lián)合使用，推薦復方磺胺甲唑聯(lián)合阿米卡星或亞胺培南，根據(jù)藥敏結果及時調整。肺諾卡菌感染或中樞神經系統(tǒng)外的多發(fā)膿腫，最小療程為6周，對于播散型或中樞神經系統(tǒng)諾卡菌感染，療程可用至3個月［6］。由于諾卡菌病易誤診，且免疫缺陷患者感染諾卡菌后病死率高，對于AIDS合并肺部感染者，胸部DR見單發(fā)或多發(fā)的結節(jié)伴空洞或肺實變，治療效果差，特別是合并皮下膿腫表現(xiàn)者，則需考慮諾卡菌病的可能性，及時行血、膿液、痰、支氣管灌洗液、肺組織穿刺等多部位標本培養(yǎng)及mNGS檢測，以盡早確診，提高本病的好轉率、治愈率。

本病例的診療經過提示，由于諾卡菌培養(yǎng)生長速度緩慢，臨床常難以明確諾卡菌病診斷，需結合患者的臨床表現(xiàn)、影像學資料及治療經過綜合分析，對于疑似諾卡菌感染病例，應及時與檢驗科溝通，必要時延長病原培養(yǎng)時間。由于感染性疾病應用常規(guī)檢驗明確病原診斷具有一定難度，mNGS技術可以為感染性疾病診斷提供新的思路，其在病原診斷中具有廣闊的應用前景，值得繼續(xù)深入探索。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明趙蕊：數(shù)據(jù)采集、整理及分析，文章撰寫；鄒俊：對病例診治及論文進行指導批閱