諾卡菌分子鑒定方法的研究進(jìn)展*

黃 磊 綜述，張 藝 審校

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034)

諾卡菌是一群需氧革蘭陽性分枝桿菌，可存在于土壤、空氣、水、動(dòng)植物排泄物中，主要通過吸入或破損皮膚侵入人體引起感染，可引起局部或全身感染，好發(fā)于免疫功能低下患者(例如器官移植后，使用糖皮質(zhì)激素，HIV感染等免疫抑制狀態(tài))，也可見于健康人[1- 2]。近年來國(guó)際上和我國(guó)有關(guān)諾卡菌感染的報(bào)道不斷增多，日益受到關(guān)注[3-6]。

諾卡菌感染在臨床及影像學(xué)上缺乏特異性，其診斷往往依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，涂片鏡檢的靈敏度低且不能鑒定到種，培養(yǎng)出可疑菌落后用生化方法僅有少數(shù)幾種諾卡菌能鑒定到種[7]。諾卡菌有50多個(gè)種，其中膿腫諾卡菌、皮疽諾卡菌、巴西諾卡菌、新諾卡菌、豚鼠耳炎諾卡菌等13個(gè)菌種可引起人類感染，且不同菌種對(duì)抗菌藥物的敏感性不同，所以對(duì)早期診斷和治療，鑒定到種非常重要。

目前只有分子生物學(xué)方法能將諾卡菌準(zhǔn)確鑒定到種，從早期的PCR擴(kuò)增目的片段后電泳檢測(cè)、PCR-限制性核酸內(nèi)切酶分析、反向點(diǎn)雜交、焦磷酸測(cè)序等，發(fā)展到目前廣泛應(yīng)用的基因測(cè)序(16S rRNA、hsp65、recA1、gyrB和rpoB)、多位點(diǎn)序列分析(MLSA)和質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)[7]。以上方法各有優(yōu)勢(shì)和局限性，本文對(duì)目前廣泛應(yīng)用的3類方法作一綜述。

1 基因測(cè)序

1.116S rRNA基因 細(xì)菌16S rRNA序列內(nèi)同時(shí)存在高度保守和高度變異的區(qū)域，是一個(gè)穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記，可將細(xì)菌鑒定到種水平，獲得不依賴表型特征的客觀結(jié)果，是最早和最廣泛用于諾卡菌鑒定的基因[1,8]。但是在諾卡菌中的某些種，該基因存在多拷貝現(xiàn)象，不同拷貝顯示為不同的堿基序列，在測(cè)序峰圖上顯示為多個(gè)重疊峰。目前已知存在多拷貝基因的模式菌株包括凹陷諾卡菌、未知諾卡菌、山梨諾卡菌、新諾卡菌等，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中這些菌株的16S rRNA基因序列存在相當(dāng)比例的錯(cuò)誤[9-10]。此外16S rRNA序列也無法區(qū)分親緣關(guān)系非常接近的諾卡菌，例如新諾卡菌復(fù)合體[11]。

XIAO等[12]針對(duì)諾卡菌16S rRNA基因5′端606 bp區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，以一致性≥99%作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，鑒定25株常見諾卡菌的準(zhǔn)確率為96%，其中包括12株圣喬治諾卡菌、9株皮疽諾卡菌、2株膿腫諾卡菌和1株豚鼠耳炎諾卡菌，但是未鑒定出一些少見的種，比如華萊士諾卡菌。因此單獨(dú)使用16S rRNA測(cè)序來鑒定諾卡菌有一定的局限性。

1.2hsp65基因 hsp65基因編碼是相對(duì)分子質(zhì)量為6.5×104的熱休克蛋白，也可用于鑒定諾卡菌，既往研究多為比較其與16S rRNA基因測(cè)序?qū)χZ卡菌的鑒定能力。RODRGUEZ-NAVA等[13]評(píng)估了hsp65基因特定的441 bp區(qū)域?qū)Σ煌N諾卡菌的鑒定能力，發(fā)現(xiàn)該基因比16S rRNA擁有更多可變區(qū)，諾卡菌種間差異更顯著，這種差異可用于區(qū)分某些16S rRNA序列非常相似甚至是100%一致的菌株，例如可以區(qū)分16S rRNA序列非常相似的塞拉多諾卡菌和老兵諾卡菌。

RUDRAMURTHY等[14]對(duì)來自印度的25株臨床分離的諾卡菌同時(shí)用16S rRNA和hsp65測(cè)序，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因均可鑒定90%的常見諾卡菌，例如皮疽諾卡菌、圣喬治諾卡菌等，同時(shí)也存在少量不一致的情況。由于GenBank中的北京諾卡菌、關(guān)節(jié)炎諾卡菌、亞洲諾卡菌的hsp65序列的信息很少，故使用hsp65序列比對(duì)不能很好地區(qū)分上述3種諾卡菌，而16S rRNA的長(zhǎng)片段(1 000 bp以上)測(cè)序則可以。此外還發(fā)現(xiàn)hsp65基因在圣喬治諾卡菌中存在異質(zhì)性，可用于該菌的進(jìn)一步分子分型。

1.3secA1基因 secA1基因編碼分泌蛋白A1，蛋白A1對(duì)于蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜的輸出非常重要。secA1基因特定的468 bp區(qū)域可用于諾卡菌鑒定。KONG等[15]在對(duì)120株諾卡菌臨床分離株的研究中，發(fā)現(xiàn)用secA1基因的鑒定結(jié)果與16S rRNA的5′末端606bp序列的鑒定結(jié)果存在某些不一致，例如16S rRNA鑒定為新諾卡菌、膿腫諾卡菌、苛養(yǎng)諾卡菌和德蘭士瓦諾卡菌的菌株，secA1基因則對(duì)相應(yīng)菌株分別鑒定為諾卡菌某些種、亞洲諾卡菌、非洲諾卡菌、布氏諾卡菌。此外secA1比16S rRNA序列具有更多的序列多樣性，尤其是新諾卡菌有14個(gè)序列型、皮疽諾卡菌和老兵諾卡菌各有7個(gè)序列型。因此secA1是16S rRNA鑒定的補(bǔ)充，并且可用于諾卡菌種系發(fā)育和亞型研究。此外secA1還可用于鑒定某些極少見諾卡菌，例如曾經(jīng)在1例器官移植后患肺諾卡菌病的患者中用secA1測(cè)序方法鑒定出泰國(guó)諾卡菌，并與16S rRNA測(cè)序進(jìn)行了比較，一致性很高，這是在全球范圍內(nèi)第3次報(bào)道該種諾卡菌[16]。

1.4gyrB基因 gyrB基因編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶的β亞基，雖然某些菌種存在多重拷貝，但gyrB基因也可用于諾卡菌的菌種鑒定。TAKEDA等[17]對(duì)56株諾卡菌模式菌株的評(píng)估結(jié)果表明，gyrB基因1 200 bp范圍內(nèi)的種間差異度82.4%～99.9% (2～270個(gè)堿基差異)，是16S rRNA的種間差異的3.6倍。這表明gyrB比16S rRNA在諾卡菌鑒定中具有更高分辨率。CARROSCO等[18]的研究表明，gryB可用于臨床常見諾卡菌鑒定、分型和親緣關(guān)系比較，這包括膿腫諾卡菌、圣喬治諾卡菌、皮疽諾卡菌、新諾卡菌。CARROSCO等[19]的進(jìn)一步研究表明，16S rRNA結(jié)合gyrB可提高常見諾卡菌的鑒定能力，這包括巴西諾卡菌、豚鼠耳炎諾卡菌，以及不常見諾卡菌，包括熊本諾卡菌、未知諾卡菌、寡食諾卡菌、肺炎諾卡菌、膿液諾卡菌、武田諾卡菌、老兵諾卡菌、酒紅諾卡菌，但是未鑒定出其他12種諾卡菌。gyrB基因?qū)τ谌庵Z卡菌、德蘭士瓦諾卡菌、巴西諾卡菌和豚鼠耳炎諾卡菌的鑒定率較高。

1.5rpoB基因 rpoB基因編碼DNA依賴的RNA聚合酶的β亞基，也可用于諾卡菌鑒定，但目前單獨(dú)評(píng)價(jià)該基因的文獻(xiàn)報(bào)道較少，已有報(bào)道多為將rpoB的測(cè)序結(jié)果作為多為點(diǎn)序列分析(MLSA)的一部分。CARROSCO等[18]研究表明，rpoB基因在膿腫諾卡菌、圣喬治諾卡菌、皮疽諾卡菌和新諾卡菌復(fù)合體，比16S rRNA具有更高的基因多態(tài)性，而16S rRNA用于鑒定膿腫諾卡菌和新諾卡菌復(fù)合體時(shí)效果不好，因此rpoB是16S rRNA測(cè)序的有益補(bǔ)充。

2 多位點(diǎn)序列分析(MLSA)

由于使用單個(gè)基因測(cè)序存在不足，MCTAGGART等[20]最早對(duì)190株臨床分離的諾卡菌和36株模式菌株，采用MLSA方法，同時(shí)測(cè)序16S rRNA、gyrB、secA1、hsp65、rpoB基因，然后把5個(gè)基因的測(cè)序結(jié)果串聯(lián)在一起，創(chuàng)建基于序列的種系發(fā)生簇，結(jié)果顯示71.3%的臨床株可與模式株聚類在一起，從而鑒定到種水平，也可以鑒定出之前未曾報(bào)道過的新種。并且發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因位點(diǎn)組合(gyrB-16S-secA1)和4個(gè)基因位點(diǎn)組合(gyrB-16S-secA1-hsp65)與5個(gè)基因位點(diǎn)組合具有相當(dāng)?shù)蔫b定能力，鑒定一致率分別為98.5%和95.5%。并且研究中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用hsp65和rpoB時(shí)，得到的鑒定結(jié)果與MLSA的結(jié)果存在顯著差異，這可能是因?yàn)镸LSA檢測(cè)多個(gè)基因時(shí)削弱了單個(gè)基因序列中有差異的等位基因的影響。

CARRASCO等[8]用4個(gè)位點(diǎn)MLSA鑒定了67株經(jīng)16S rRNA測(cè)序和質(zhì)譜方法鑒定不一致的諾卡菌，結(jié)果表明MLSA在少見諾卡菌種，如塞拉多諾卡菌、未知諾卡菌、肺炎諾卡菌的鑒定能力很好，而不能區(qū)分經(jīng)16S rRNA鑒定為華萊士諾卡菌和布氏諾卡菌(質(zhì)譜方法僅對(duì)這兩種諾卡菌給出了不可靠的鑒定結(jié)果)，MLSA也不能區(qū)分短鏈諾卡菌/寡食諾卡菌、關(guān)節(jié)炎諾卡菌/微白諾卡菌、克魯切克諾卡菌/青葉町諾卡菌、非洲諾卡菌/新諾卡。

XIAO等[12]用五位點(diǎn)MLSA(16S rRNA-gyrB-secA1-hsp65-rpoB)和16S rRNA測(cè)序同時(shí)鑒定25株諾卡菌臨床分離株，其中24株的鑒定結(jié)果一致，且MLSA能夠準(zhǔn)確鑒定華萊士諾卡菌，而16S rRNA測(cè)序不能，并且MLSA將圣喬治諾卡菌進(jìn)一步分為3個(gè)亞群。因此MLSA比16S rRNA具有更高的分辨率。

3 基質(zhì)輔助激光解吸電離-時(shí)間飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)

MALDI-TOF MS技術(shù)根據(jù)不同微生物蛋白質(zhì)的核質(zhì)比差異，將單個(gè)菌株的質(zhì)譜圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中的質(zhì)譜圖譜進(jìn)行比較，從而得到鑒定結(jié)果，近年來由于其通量增加和潛在的優(yōu)勢(shì)，已逐漸用于諾卡菌鑒定[21]。

BLOSSER等[22]的多中心研究評(píng)價(jià)了使用經(jīng)FDA和CFDA認(rèn)可的商品化布魯克MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀對(duì)150株諾卡菌的鑒定結(jié)果，他們使用了標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)、蛋白提取和質(zhì)譜鑒定方法。結(jié)果表明，86%菌株準(zhǔn)確鑒定到種/種復(fù)合群水平，6%菌株未出鑒定結(jié)果，4%通過現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)(布魯克的參考數(shù)據(jù)庫(kù)、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院的諾卡菌補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫(kù)、俄亥俄州立大學(xué)的諾卡菌補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫(kù))鑒定為少見種，對(duì)這些鑒定不理想的菌株重新提取蛋白檢測(cè)，并使用自建數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，使鑒定結(jié)果在種水平和屬水平的一致性分別提高了18.2%和36.9%。

BUCKWALTER等[23]使用布魯克MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀評(píng)估了質(zhì)譜方法和16S rRNA測(cè)序在148株諾卡菌鑒定中的一致性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用廠家提供的商品化數(shù)據(jù)庫(kù)(布魯克的參考數(shù)據(jù)庫(kù)、布魯克的分枝桿菌特異性數(shù)據(jù)庫(kù))時(shí)正確率僅42%，當(dāng)使用客戶實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)正確率可達(dá)90%，說明廠家提供的商品化數(shù)據(jù)庫(kù)存在一定的局限性，主要因?yàn)樵搸?kù)中的諾卡菌圖譜多為模式菌株，而缺少足夠數(shù)量的臨床菌株圖譜，尤其是少見諾卡菌。

CARRASCO等[8]使用布魯克MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀和布魯克的參考數(shù)據(jù)庫(kù)分析了西班牙地區(qū)高分離率(25株)、中分離率(20株)和低分離率(55株)的諾卡菌，結(jié)果表明MALDI-TOF對(duì)高分離率菌株的鑒定一致率與16S rRNA測(cè)序相當(dāng)(達(dá)76%)，對(duì)中分離率和低分離率菌株則存在較大差異，一致率分別為45%和27%。

XIAO等[12]的研究表明，使用布魯克MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀檢測(cè)25株諾卡菌臨床分離株，當(dāng)使用布魯克的參考數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，上述菌株均未鑒定成功；當(dāng)使用已知鑒定結(jié)果的5株菌的圖譜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，上述菌株有95%可準(zhǔn)確鑒定到種水平(≥2.0分)。此外用MALDI-TOF不能準(zhǔn)確鑒定出親緣關(guān)系很近的種，如新諾卡菌復(fù)合體成員。

GIRARD等[24]使用經(jīng)FDA和CFDA認(rèn)可的商品化威泰科(VITEK) MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀檢測(cè)164株諾卡菌臨床分離株，他們優(yōu)化了樣本制備流程，并使用即將面世的VITEK MS IVD數(shù)據(jù)庫(kù)(3.0版)。其結(jié)果與16S rDNA測(cè)序進(jìn)行比對(duì)，一致率為94%，僅有少量不常見的諾卡菌鑒定錯(cuò)誤。該結(jié)果與使用布魯克質(zhì)譜儀及其相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的結(jié)果相比，顯示出很大的優(yōu)越性[8,12,22-23]。

綜上所述，MALDI-TOF用于諾卡菌鑒定最主要的局限性是現(xiàn)有商品化數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏相應(yīng)的圖譜，某些諾卡菌模式菌株的質(zhì)譜圖譜與臨床株不同，因此當(dāng)遇到不常見諾卡菌時(shí)，需要用已鑒定好的臨床菌株建立和完善原有數(shù)據(jù)庫(kù)。當(dāng)遇到某個(gè)種可能含有質(zhì)譜圖雖不同，但又關(guān)聯(lián)的菌株時(shí)，比較同一種諾卡菌的所有質(zhì)譜圖可提高鑒定準(zhǔn)確率。因此對(duì)諾卡菌的鑒定來說，仍需進(jìn)一步豐富現(xiàn)有的商品化數(shù)據(jù)庫(kù)，尤其是不常見諾卡菌的數(shù)據(jù)庫(kù)。

4 小 結(jié)

目前，僅有分子生物學(xué)方法可將諾卡菌準(zhǔn)確鑒定到種，其中應(yīng)用較廣泛的方法包括基因測(cè)序(16S rRNA、hsp65、secA1、gyrB和rpoB)、MLSA和MALDI-TOF MS技術(shù)。在基因測(cè)序方法中，16S rRNA基因是應(yīng)用最早、最廣泛的目的片段，對(duì)于常見諾卡菌具有較好的鑒定準(zhǔn)確度，但在某些少見諾卡菌中因存在基因多拷貝現(xiàn)象，而無法準(zhǔn)確鑒定。hsp65、recA1、gyrB、rpoB與16S rRNA相比，在不同種諾卡菌中具有更高的基因序列多態(tài)性，在鑒定少見諾卡菌和親緣關(guān)系非常接近的諾卡菌時(shí)，是16S rRNA的有益補(bǔ)充。MLSA是將上述基因中的3～5個(gè)分別測(cè)序后串聯(lián)在一起構(gòu)建種系發(fā)生簇，根據(jù)種系間的親緣關(guān)系來鑒定菌株，比單個(gè)基因測(cè)序具有更高分辨率。質(zhì)譜技術(shù)簡(jiǎn)便、快速、成本低，可高通量檢測(cè)，但現(xiàn)有的商品化數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏足夠的臨床菌株圖譜，直接使用效果較差，實(shí)驗(yàn)室依據(jù)臨床菌株自建數(shù)據(jù)庫(kù)后，鑒定準(zhǔn)確度可顯著提高。