氨基酸同時消除甲醛和乙二醛的機理及消減產(chǎn)物的細胞毒性

林佳鈺，黃才歡，鄭 潔,2，劉 付，歐雋瀅，周 華，胡嘉漫，歐仕益,2,*

（1.暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2.焙烤食品安全粵港聯(lián)合創(chuàng)新平臺，廣東 廣州 510632；3.暨南大學食品安全與營養(yǎng)研究院，廣東 廣州 510632）

甲醛已被國際癌癥研究機構(gòu)定義為人類和動物的第一類致癌物，對人體具有巨大的危害。它能夠通過外源性和內(nèi)源性產(chǎn)生。外源性甲醛主要來源于環(huán)境和膳食暴露。環(huán)境暴露主要包括煙霧、工業(yè)污染、汽車尾氣、生物質(zhì)燃燒、化妝品、實驗室和醫(yī)院使用的防腐劑等[1]。在食品加工過程中，甲醛也可通過多不飽和脂肪酸氧化、甘氨酸的斯特勒克降解[2]、丙酮醛和乙二醛的降解[3]而產(chǎn)生。內(nèi)源性甲醛可通過甲醇的氧化而產(chǎn)生。甲醇能通過水果和植物果膠中的甲酯產(chǎn)生，甲醇在體內(nèi)被迅速吸收并代謝成甲醛。在細胞內(nèi)，甲醛也可通過葉酸衍生物的分解、蛋白質(zhì)和核酸的去甲基化而產(chǎn)生[1]。因此，甲醛廣泛存在于熱加工食品及水果、蔬菜、蘑菇、肉類和魚類等食品原料中。橙子、火腿、蘑菇和馬鈴薯塊莖中的甲醛含量分別為56.9、293、188、16.5 mg/kg[4-6]。甲醛的亞慢性毒性閾值（以最低基準質(zhì)量為10%計算）是2800 μg/（kg·d），為其每日容許攝入量（acceptable daily intake，ADI）的19 倍。因此，甲醛清除劑的開發(fā)已成為近年來的研究熱點[7]。

乙二醛、丙酮醛和3-脫氧葡萄糖酮等二羰基化合物易誘發(fā)體內(nèi)活性氧產(chǎn)生，引起細胞損傷、細胞凋亡，與生物大分子如蛋白質(zhì)、DNA等發(fā)生不可逆的結(jié)合等[7]。同時是晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）形成過程的中間產(chǎn)物。AGEs已被證明與許多慢性疾病，如葡萄糖性視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、糖尿病和腎病等有關(guān)[9]。乙二醛與甲醛一樣，能夠通過外源性和內(nèi)源性產(chǎn)生。外源性乙二醛的主要來源有環(huán)境污染和膳食攝入。環(huán)境污染主要包括煙霧、居民原木火災、汽車尾氣等[10]。在不同的食品，如發(fā)酵食品（啤酒、葡萄酒、酸奶、豆醬等）、熱加工食品（面包、曲奇、咖啡和薯條等）、新鮮產(chǎn)品（豆類、果蔬、魚類）以及油中均存在乙二醛[11-13]內(nèi)源性乙二醛可通過碳水化合物和抗壞血酸的自氧化、糖化蛋白的降解和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生[14]。乙二醛的平均暴露量為1000 μg/（kg·d），是其ADI值的5 倍[15]。

甲醛和乙二醛是兩種很活潑的醛，在熱加工過程中形成后迅速消失。Nowshad等[16]發(fā)現(xiàn)土豆塊莖因自身生化代謝產(chǎn)生16.5 mg/kg甲醛，Bastos等[17]研究表明油炸油（菜籽油）中甲醛含量達到250 mg/kg，但Wang Wenli等[18]在油條中卻檢測不到甲醛（檢測限0.58 nmol/L）。Gobert等[19]采用賴氨酸與葡萄糖在50 ℃反應7 d，測出添加鄰苯二胺捕捉時的乙二醛濃度為3.3 mmol/L，而不添加鄰苯二胺捕捉時乙二醛濃度為0.06 mmol/L，乙二醛的形成量是其終產(chǎn)物中殘留量的55 倍。說明在熱加工過程中，甲醛和乙二醛通過一些消減途徑而消失了。近年來國內(nèi)外研究表明，氨基酸在甲醛和乙二醛的消除中發(fā)揮重要作用。一些氨基酸如半胱氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸等在室溫下對甲醛的消除效果可達到40%以上[20]，其機理是氨基酸的親電基團如巰基、氨基與甲醛易發(fā)生親核加成反應[20]。乙二醛是美拉德反應的中間產(chǎn)物，與氨基酸發(fā)生親核加成反應后，發(fā)生Strecker反應，是食品中風味物質(zhì)如呋喃、吡嗪、吡啶等形成的主要途徑[22]。但乙二醛等二羰基化合物也與氨基酸反應生成AGEs。Jiang Kaiyu等[23]通過模擬胃腸道消化過程研究幾種蛋白質(zhì)對幾種活潑羰基化合物如丙烯醛、乙二醛和丙酮醛的消除作用，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的攝入對幾種活潑羰基化合物具有較好的消除效果，并通過實驗證明了蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物氨基酸能夠降低活潑羰基化合物的含量，且消減產(chǎn)物降低了丙烯醛的細胞毒性。Hu Jiaman等[24]表明甲醛和丙酮醛通過與甘氨酸、絲氨酸結(jié)合之后形成咪唑鹽而降低了對正常胃上皮細胞GES-1和結(jié)腸癌細胞Caco-2的細胞毒性。但目前對氨基酸同時消除乙二醛和甲醛的機理還有待研究。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于植物、動物和微生物中。GABA是一種新資源食品，已被廣泛應用于醫(yī)藥和功能性食品開發(fā)中，它在治療癲癇、精神分裂癥、抑郁癥、失眠、高血壓等哺乳動物疾病中發(fā)揮著重要作用，它的存在將提高益生元在降低糖尿病患者高血壓方面的潛在能力[25]。L-丙氨酸（L-alanine，Ala）是一種非必需氨基酸，已被GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》列為一種食品添加劑，廣泛用于食品增味。丙氨酸-谷氨酰胺可作為腸外營養(yǎng)改善慢性阻塞性肺病急性加重期合并II型呼吸衰竭患者的營養(yǎng)狀況、肺功能及生活質(zhì)量[26]。本研究基于甲醛和乙二醛廣泛存在于食品中的實際，研究GABA和Ala同時消除甲醛和乙二醛的效率及其消除機理，揭示食品加工過程中甲醛和乙二醛的消減途徑；同時，測定消減產(chǎn)物在食品中的含量和細胞毒性，以期為控制食品中的甲醛和乙二醛毒性提供一種新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙二醛（質(zhì)量分數(shù)40%） 上海麥克林生化科技有限公司；甲醛（質(zhì)量分數(shù)37%）、鹽酸（質(zhì)量分數(shù)37%）天津大茂化學試劑廠；GABA（純度99%）、Ala（純度99%）、2,4-二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）（分析純） 北京百靈威科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國默克試劑有限公司；氘代甲醇 美國Cambridge Isotope Laboratories公司；A-HG型十八烷基鍵合硅膠（octadecylsilyl，ODS）日本東京YMC有限公司；所有分離用有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀、LC-MS8045三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 日本島津儀器公司；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會社；SHA-BA恒溫振蕩器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；X500RQTOF型高分辨質(zhì)譜儀 美國SCIEX公司；HR-200分析天平 日本A&D公司；600 MHz Avance III型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀瑞士布魯克公司；Scientz-10N型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技有限公司；WA-BYM-15SFT壓面機 江蘇無錫市麥威電器有限公司；RJ-81型油炸鍋 廣州佛洛麗斯廚具設備有限公司；XW-80A型微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；5804-R型離心機 艾本德中國有限公司；MB-580型酶標儀 深圳匯松科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GABA和Ala對乙二醛和甲醛的清除作用

分別設置甲醛對照組：于10 mL具塞比色管中，加入2 mL GABA或Ala，2 mL甲醛和2 mL去離子水；乙二醛對照組：于10 mL具塞比色管中，加入2 mL GABA或Ala，2 mL乙二醛和2 mL去離子水；實驗組：于10 mL具塞比色管中，分別加入2 mL GABA或Ala，2 mL乙二醛和2 mL甲醛。其中，氨基酸濃度為200 mmol/L，甲醛和乙二醛濃度均為40 mmol/L，在95 ℃條件下反應4 h。

反應結(jié)束后，參照Jiang Kaiyu等[23]的檢測方法，以DNPH檢測反應體系中剩余的甲醛和乙二醛含量。具體檢測方法如下：將反應后溶液稀釋100 倍后，取0.2 mL于5 mL試管中，再加入1 mL DNPH（6 mmol/L，V乙腈/V水=9∶1，采用10%鹽酸將pH值調(diào)為2）和1.8 mL乙腈，在70 ℃衍生2 h。衍生后樣品經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾后，采用高效液相色譜儀（配有SPDM20A光電二極管陣列檢測器）檢測。具體檢測條件參照胡嘉漫等[27]的方法，色譜柱為ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為水-乙腈（30∶70，V/V），進樣體積5 μL，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃；檢測波長353 nm（甲醛衍生物）和425 nm（乙二醛衍生物）。甲醛和乙二醛均以標準物質(zhì)衍生后進樣，每個樣品采用3 次平行測定，以濃度和峰面積繪制標準曲線，以標準曲線計算得出樣品中甲醛和乙二醛的殘余量。

1.3.2 消減產(chǎn)物的分離純化

分別稱取GABA/Ala、甲醛和乙二醛于裝有20 mL去離子水的100 mL三角瓶中，其中氨基酸濃度為0.5 mmol/L，甲醛和乙二醛濃度為0.1 mmol/L。于95 ℃反應10 h。反應結(jié)束后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將反應液濃縮至1～2 mL，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾后，用膠頭滴管加到平衡好的反相硅膠層析柱（ODS填料）上，進行柱層析分離。玻璃層析柱規(guī)格為25 mm×600 mm，反相硅膠柱填料體積為200 mL。分離方法參考鄒照佳等[28]，用體積分數(shù)5%甲醇溶液平衡柱子后，濕法上樣，以5%甲醇溶液等度洗脫150 mL后開始收集樣品，流速為3 s/滴，餾分體積為5 mL。各餾分液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，采用高效液相色譜儀測定消減產(chǎn)物的純度。色譜柱為ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為水（含0.1%甲酸）-甲醇（95∶5，V/V），進樣體積1 μL，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃；檢測波長208 nm。收集高純度餾分并冷凍干燥48 h，獲得消減產(chǎn)物固體。

1.3.3 消減產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

將純度大于95%的餾分，采用高分辨質(zhì)譜儀獲得消減產(chǎn)物的精確分子質(zhì)量。取20 mg固體樣品溶于550 μL氘代水中，采用NMR儀獲得目標產(chǎn)物的一維譜圖（1H NMR、13C NMR、Dept-135NMR）和二維譜圖（HMBC、HSQC、H-H COSY）。

1.3.4 餅干和油炸薯片的制備

餅干配方參考翁婷等[29]的方法，先將烘焙細砂糖、碳酸氫鈉、碳酸氫銨和氯化鈉放入盆中，稱取GABA和Ala。GABA和Ala添加量均為1.5 mg/kg，分別作為GABA對照組和Ala對照組，同時設置空白組，不添加氨基酸。再用16 g的水少量多次溶解后，與之前準備的原料混合攪拌均勻。待油融化后加入原料迅速攪拌均勻，加入面粉混合均勻制成面團。用壓面機輥壓2 次，制成餅干后放在吸油紙上，置于提前預熱30 min的烤箱中，在165 ℃加熱15 min后放置在干燥器中保存。

油炸薯片制備參考郭鴻陽等[30]方法，將瀝干的馬鈴薯切片在165 ℃的花生油中油炸3 min后將其取出，瀝干油漬，冷卻至常溫后裝入密封袋置于干燥器中保存。

1.3.5 食品體系中消減產(chǎn)物含量的測定

食品樣品選自1.3.4節(jié)制備得到的餅干及薯片，以及兩種市售餅干和薯片，餅干和薯片的主要原材料分別為小麥粉和馬鈴薯。將10 g食品樣品碾碎后，取3.0 g于50 mL離心管中，加入5 mL正己烷渦旋5 min后，在10000 r/min離心10 min，去除上清液，此過程重復2 次，于通風櫥中將殘余正己烷過夜揮干。加入15 mL 20%甲醇溶液，渦旋5 min后于10000 r/min離心10 min，此過程重復2 次，收集上清液后濃縮定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾后，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的多反應監(jiān)測模式對消減產(chǎn)物進行測定，每個樣品重復3 次。測定參數(shù)：色譜柱為ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為水（A，含0.1%甲酸）和甲醇（B），流動相條件為：0～2 min，95%～5% A、5%～95% B；2～8 min，5% A、95% B；8～10 min，5%～95% A、95%～5% B；10～18 min，95% A、5% B。進樣量0.5 μL，流速0.4 mL/min。以正離子模式運行，離子源為電噴霧離子源，掃描范圍m/z0～800；離子源溫度300 ℃，去溶劑化溫度250 ℃，毛細管電壓4000 V，掃描速率1000 Da/s。GABA和Ala來源的消減產(chǎn)物質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 兩種消減產(chǎn)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for two reaction products

1.3.6 細胞毒性實驗

MTT法分別檢測甲醛、乙二醛、甲醛和乙二醛的混合物，以及兩種消減產(chǎn)物對人正常胃上皮細胞（GES-1）的毒性。GES-1采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞生長至匯合率為80%左右時，加入1.5 mL胰酶消化成單細胞懸液，顯微鏡下計數(shù)后，向96 孔細胞培養(yǎng)板中（除外周36 孔）中加入100 μL細胞數(shù)5000 個/mL的單細胞懸液。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～24 h，使細胞貼壁生長。分別加入100 μL不同濃度的藥物孵育細胞。GABA或Ala咪唑鹽、乙二醛濃度均為0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L，甲醛濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mmol/L，混合醛中甲醛、乙二醛濃度均為0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mmol/L。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移除孔板中的培養(yǎng)基和藥物，加入100 μL含0.5% MTT的培養(yǎng)基替代藥物，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，移除培養(yǎng)基，加入150 μL/孔二甲基亞砜溶液，使用酶標儀振蕩后，于570 nm檢測吸光度。每個濃度重復3 次，細胞存活率表達均為。

1.3.7 細胞活力計算

式中：A1為藥物組的吸光度；A2為對照組的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸對甲醛和乙二醛的消除作用

利用DNPH作為衍生劑檢測甲醛和乙二醛殘余量，以此評價氨基酸對甲醛和乙二醛的消除效果。分別在生理溫度（37 ℃）和95 ℃研究GABA和Ala對甲醛和乙二醛的消除效果，發(fā)現(xiàn)低溫下兩種氨基酸對甲醛和乙二醛的消除效果不高，所以本研究重點探討95 ℃條件下GABA、Ala對甲醛和乙二醛的消除作用及其機理，消除效果如表2所示。結(jié)果表明，在混合醛體系中，GABA對乙二醛的消除效果從55.84%上升至70.64%，Ala對甲醛的消除效果從2.68%上升至41.33%。此外，GABA對甲醛具有較好的清除效果，可以達到84.31%。Ala對乙二醛的消除效果略低于GABA，只有45.90%。這說明，在混合醛體系中，GABA或Ala能夠與一部分的甲醛和乙二醛反應從而達到同時消除甲醛和乙二醛的目的。

表2 GABA和Ala對甲醛和乙二醛的消除率（95℃、4 h）Table 2 Removal rates of formaldehyde and glyoxal by reaction with GABA or Ala at 95℃ for 4 h

2.2 消減產(chǎn)物的分離純化

95 ℃水浴反應4 h后，GABA-甲醛-乙二醛和Ala-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的高效液相色譜圖如圖1所示。產(chǎn)物中除了氨基酸之外，還出現(xiàn)了一個峰面積較大的新產(chǎn)物。GABA與甲醛、乙二醛的消減產(chǎn)物的出峰時間為7.950 min；Ala與甲醛、乙二醛的消減產(chǎn)物的出峰時間為6.909 min。

圖1 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消減產(chǎn)物的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the reaction products from GABAformaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal systems (B)

根據(jù)前期研究，反相硅膠能較好分離氨基酸消除丙烯醛、丙酮醛和甲醛后形成的產(chǎn)物（胡嘉漫[27]、鄒照佳[28]）。因此，本研究采用反相硅膠分離、甲醇洗脫、茚三酮（與氨基酸反應顯色）監(jiān)測，判斷消減產(chǎn)物流出時間，并采用高效液相色譜測定其純度，收集純度大于95%的餾分，如圖2所示。

圖2 GABA-甲醛-乙二醛（A）與Ala-甲醛-乙二醛（B）純化消減產(chǎn)物的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the purified reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

經(jīng)紫外全波長掃描后，GABA與甲醛、乙二醛的消減產(chǎn)物最大吸收波長為200 nm；Ala與甲醛、乙二醛的消減產(chǎn)物最大吸收波長為209 nm，如圖3所示。

圖3 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消減產(chǎn)物的全波長掃描圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of the reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

2.3 消減產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

純化后的消減產(chǎn)物經(jīng)高分辨質(zhì)譜儀檢測后，GABA-甲醛-乙二醛和Ala-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分別為240.1183和212.0870，分子式分別為C11H16N2O4和C9H12N2O4，如圖4所示。

圖4 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消減產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜圖Fig.4 High-resolution mass spectra of the reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

GABA-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的NMR歸屬如表3所示。結(jié)果表明，該消減產(chǎn)物為1,3-雙(3-羧丙基)咪唑。

表3 GABA-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的NMR歸屬Table 3 NMR spectral assignments of the reaction product from GABA-formaldehyde-glyoxal system

Ala-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的NMR歸屬如表4所示。結(jié)果表明，該消減產(chǎn)物為1,3-雙(1-羧乙基)咪唑。

表4 GABA-甲醛-乙二醛消減產(chǎn)物的NMR歸屬Table 4 NMR spectral assignments of the reaction product from Ala-formaldehyde-glyoxal system

根據(jù)以上研究結(jié)果，推測其反應機理如圖5所示，與氨基酸-甲醛-丙酮醛互作機理[27]相似：GABA或Ala與甲醛生成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物Mannich堿，由于N原子的吸電子效應，導致α-C上正電荷堆積，另一分子的GABA或Ala易與之發(fā)生親核加成反應形成一個中間產(chǎn)物。中間產(chǎn)物上的兩個亞氨基與乙二醛的兩個羰基發(fā)生親核加成后生成一個五元環(huán)結(jié)構(gòu)，再脫去兩分子的水，形成咪唑鹽。

圖5 GABA-甲醛-乙二醛（A）和Ala-甲醛-乙二醛（B）消減產(chǎn)物的形成機理Fig.5 Formation mechanism of the reaction products from GABA-formaldehyde-glyoxal (A) and Ala-formaldehyde-glyoxal (B) systems

2.4 食品樣品中消減產(chǎn)物的含量

GABA廣泛存在于動植物體內(nèi)，馬鈴薯粉中含有豐富的游離氨基酸，Elmore等[31]測得馬鈴薯粉中GABA含量僅次于天冬酰胺，高達665 mg/kg。張志清等[32]通過高效液相色譜法測得不同的小麥品種中GABA含量為2.38～52.59 mg/kg。丙氨酸在馬鈴薯粉中的含量高達259 mg/kg[31]，同時也是小麥中的一種主要氨基酸[33]。為此，采用制備的咪唑鹽標準樣品，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了兩種市售油炸薯片（復合薯片）和餅干中咪唑鹽含量，其中油炸薯片中GABA、Ala咪唑鹽含量分別為（188±8）μg/kg和（156±1）μg/kg，餅干分別為（149±23）μg/kg和（27±4）μg/kg。

同時，實驗檢測自制的鮮切油炸薯片和餅干中的咪唑鹽含量，結(jié)果表明，鮮切油炸薯片中GABA、Ala咪唑鹽含量分別為（2666±218）、（855±91）μg/kg，均高于自制餅干中的GABA、Ala咪唑鹽含量，說明薯片中有更多的GABA和Ala與甲醛和乙二醛結(jié)合生成了咪唑鹽，推測可能與原材料中氨基酸的含量有關(guān)。為此，在制作餅干時分別添加了1.5 mg/kg的GABA和Ala（即16.9 μmol/kg和14.6 μmol/kg），發(fā)現(xiàn)GABA和Ala的添加使兩者的咪唑鹽含量分別從（705±66）μg/kg和（67±3）μg/kg增加到（1883±16）μg/kg和（616±38）μg/kg。GABA、Ala咪唑鹽的相對分子質(zhì)量分別為240和212，氨基酸添加后，咪唑鹽含量分別增加了4.9 μmol/kg和2.6 μmol/kg，即兩種氨基酸對甲醛和乙二醛的消除率分別達到34%和15%。在乙二醛和甲醛（與氨基酸物質(zhì)的量比為1∶1∶5）同時存在的模擬體系中（表2），GABA對甲醛和乙二醛的消除率分別為16.7%和14%，Ala對甲醛和乙二醛的消除率分別為8.3%和9.2%（物質(zhì)的量比）。說明在焙烤溫度更高的餅干（165 ℃）中，兩種氨基酸對甲醛和乙二醛的消除率高于模擬體系。

2.5 消減產(chǎn)物的細胞毒性

上述研究表明，食品中GABA與Ala可通過與甲醛、乙二醛反應形成咪唑鹽而消除甲醛和乙二醛，但咪唑鹽的毒性未知。胃是人體主要的消化道器官，食物經(jīng)口腔、食管傳遞后進入胃進行儲藏和消化，并存在部分吸收。本研究采用人正常胃上皮細胞探索甲醛、乙二醛和消減產(chǎn)物的細胞毒性。結(jié)果表明，甲醛、乙二醛和消減產(chǎn)物的細胞毒性存在顯著差異，如圖6所示。GES-1細胞活力隨著甲醛濃度的增加急劇降低，在甲醛濃度為0.20 mmol/L時細胞活力僅剩下19.0%。較甲醛而言，乙二醛對GES-1細胞的毒性較低，在乙二醛濃度達到2.0 mmol/L時，細胞活力為55%。在甲醛-乙二醛混合醛體系中，GES-1細胞活力隨著混合醛濃度的增加急劇降低，在混合醛濃度為0.20 mmol/L時，細胞活力僅剩下14.0%，較0.20 mmol/L甲醛處理的細胞活力更低，說明混合醛對細胞存在協(xié)同致毒效應。氨基酸與兩者形成咪唑鹽后，細胞毒性顯著降低。Ala和GABA咪唑鹽濃度為4 mmol/L時，GES-1細胞活力仍保持在97%和113%，說明在4 mmol/L下，消減產(chǎn)物對GES-1細胞的生長沒有抑制作用。

圖6 甲醛、甲醛-乙二醛混合醛（A）和乙二醛、GABA咪唑鹽和Ala咪唑鹽（B）對GES-1細胞活力的影響Fig.6 Effect of formaldehyde and its mixture with glyoxal (A),and glyoxal and imidazole salts formed with GABA and Ala on the cell viability of GES-1 cells (B)

3 結(jié)論

甲醛、乙二醛和游離氨基酸共存于熱加工食品中。本研究表明，GABA和Ala可同時消除甲醛和乙二醛，且兩種有害醛共存時對氨基酸消除它們產(chǎn)生一定的協(xié)同效果。氨基酸消除混合醛的機理不同于單一醛，它是兩分子氨基酸分別與一分子甲醛和乙二醛反應、脫去3分子水后形成咪唑鹽。咪唑鹽的形成顯著降低了甲醛和乙二醛的細胞毒性。鑒于咪唑鹽在油炸和焙烤條件下都可形成，且添加GABA和Ala會增加餅干和油炸薯片中咪唑鹽含量，說明采用氨基酸同時減控熱加工食品中甲醛和乙二醛具有很好的應用前景。