基于多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)的食品中六重過敏原成分檢測

王鳴秋，劉 艷，李詩瑤，董婉婷，張 濤，林 津，朱必婷，張 莉,*

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 動物源性食品中重點(diǎn)化學(xué)危害物檢測技術(shù)國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075；2.武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院，湖北 武漢 430205）

食品過敏被世界衛(wèi)生組織納入5 個最重要的公共健康問題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在西方工業(yè)化國家高達(dá)10%的人群受其影響[1]，中國人群橫斷面調(diào)查顯示自述/父母報(bào)告食物過敏發(fā)病率為4.8%～21.13%[2]。過敏癥患者攝入過敏原可引發(fā)多種免疫反應(yīng)，包括蕁麻疹、瘙癢、水腫、支氣管痙攣、鼻炎、嘔吐腹瀉，甚至呼吸困難、過敏性休克等致命癥狀[3-5]。一般情況下，過敏原的暴露量為1～100 mg/kg時會引發(fā)過敏反應(yīng)，但有時微量攝入也可致敏。

目前，針對食物過敏尚無有效的治療手段，唯一可行的辦法是避免食入可能導(dǎo)致過敏的食物成分，而消費(fèi)者預(yù)防過敏的途徑就是通過食品標(biāo)簽明示信息選擇不含過敏原的食物[6]。因此，實(shí)施過敏原標(biāo)簽管理是避免食物過敏的重要手段之一。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，90%以上的食物過敏反應(yīng)由麩質(zhì)、甲殼類、魚、雞蛋、花生、大豆、牛乳和樹堅(jiān)果類八大類過敏原引起[7]。在此基礎(chǔ)上，國際法典委員會、歐盟、美國、日韓、澳大利亞等各國根據(jù)本地區(qū)過敏原流行病學(xué)分析制定了各國食品過敏原清單并出臺法規(guī)條例進(jìn)行標(biāo)識管理[8-10]。我國在GB/T 23779—2011《預(yù)包裝食品中的致敏原成分》和GB 7718—2009《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》等標(biāo)準(zhǔn)中對八大類過敏原的種類和標(biāo)簽標(biāo)識也作出了明確規(guī)定[11-12]，但在標(biāo)識風(fēng)險(xiǎn)評估方面仍處于初步研究階段。因此，開發(fā)能夠監(jiān)測和識別食品中常見過敏原的靈敏可靠的分析方法，無論對于過敏原評估、標(biāo)簽管理和風(fēng)險(xiǎn)控制都至關(guān)重要。

對于種類復(fù)雜且高度加工的食品，一方面其配料本身含有過敏原成分，另一方面存在微量的無意帶入，這導(dǎo)致同一食品中可能同時存在多種過敏原成分，且某些過敏原含量甚微[13]。傳統(tǒng)檢測過敏原的方法多基于免疫學(xué)分析，但蛋白質(zhì)容易受加工條件和復(fù)雜基質(zhì)影響難以滿足食品中微量過敏原成分的檢測[14]。而DNA分子在工業(yè)加工食品中表現(xiàn)出比蛋白質(zhì)更高的穩(wěn)定性，且不會被食品基質(zhì)掩蓋，因而在過敏原檢測中能夠發(fā)揮獨(dú)特分析優(yōu)勢[15-17]。近年來在食品檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)能夠通過在一次反應(yīng)中設(shè)置多個靶標(biāo)實(shí)現(xiàn)過敏原的多重檢測[18-19]。但多重real-time PCR體系存在一些不可忽視的缺陷，包括靶標(biāo)擴(kuò)增的偏好性，不同引物間的自我抑制等[20]。

多重連接探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種針對待檢DNA序列進(jìn)行多重定性和半定量分析的新技術(shù)，可以通過單一引物進(jìn)行多達(dá)20～50 重靶標(biāo)的擴(kuò)增，并通過添加雜交探針靈活擴(kuò)展檢測體系的容量，實(shí)現(xiàn)比PCR更高的多重水平，具備高特異性和再現(xiàn)性[21]。目前，MLPA技術(shù)已成功應(yīng)用于人類疾病分子診斷[22]、食品藥品真實(shí)性鑒定[23]、食源性致病菌檢測[24]等領(lǐng)域的研究。

本研究開發(fā)一種基于MLPA技術(shù)的多重檢測體系，成功用于不同食品中常見的6 種過敏原成分（大豆、芝麻、核桃、杏仁、榛子、花生）的同時篩查，具備高效、靈活、特異的優(yōu)勢，旨在為生產(chǎn)企業(yè)過敏原污染控制和食品過敏原監(jiān)管提供技術(shù)支撐，保護(hù)消費(fèi)者的食品安全和生命健康。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 種過敏原材料（大豆、芝麻、核桃、杏仁、榛子、花生）、特異性驗(yàn)證材料（小麥、大麥、燕麥、青椒、大米、玉米、南瓜、土豆、紅豆、芒果、橙、桃、杏、牛、豬、沙蝦、黑魚）、自制模擬樣本材料（小麥粉、黃油、糖粉）及商品化食品樣品均購于大型商超，特異性驗(yàn)證材料大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922來自本實(shí)驗(yàn)室儲藏菌株。

DNeasy?meicon Food Kit 德國Qiagen公司；Premix ExTaq（Probe qPCR） 大連寶生物公司；SALSA MLPA EK5 reagent kit 荷蘭MRC-Holland公司；MLPA探針由武漢擎科合成；毛細(xì)管電泳緩沖液、POP-7膠、GeneScan 500 LIZ 美國ABI公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3500毛細(xì)管基因分析儀 美國ABI公司；T200 PCR擴(kuò)增儀、CFX-96熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Tissue LyserII組織研磨儀、QIAxpert核酸濃度測定儀 德國Qiagen公司；5424R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；A11 basic研磨儀 德國IKA公司；GM 300均質(zhì)器 德國Retsch GmbH公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬參考樣本的制備

將6 種過敏原材料用研磨儀磨碎，并過篩（20 目）成細(xì)粉末待用。制備面團(tuán)140 g（70 g小麥粉、56 g黃油、14 g糖粉）；稱取粉末各10 g與面團(tuán)混合，均質(zhì)15 min直至混合均勻。180 ℃烘焙20 min，制成5%的模擬餅干。同時制備不加過敏原的面團(tuán)相同處理制成0%模擬餅干。將過敏原含量為5%與0%模擬餅干磨碎，以不同質(zhì)量比混合，均質(zhì)15 min，分別制成過敏原含量為10000、1000、100、10、5、1、0.1 mg/kg的模擬餅干參考樣品。

1.3.2 DNA提取

液體樣品取40 mL于離心管中12000 r/min離心15 min，取沉淀作為DNA提取起始樣本；固體樣品直接稱取2 g樣本，按照試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA提取。使用QIAxpert測定DNA含量和評估DNA純度。提取后的DNA稀釋至20 ng/μL存放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 MLPA探針的設(shè)計(jì)與合成

NCBI獲取大豆、芝麻、核桃、杏仁、榛子、花生6 種源性成分的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列作為探針設(shè)計(jì)靶標(biāo)，根據(jù)MRCHolland公司提供的探針設(shè)計(jì)要點(diǎn)，使用Geneious 10.2.2設(shè)計(jì)對應(yīng)MLPA探針對，BLAST驗(yàn)證其特異性。探針采用高效液相色譜純化，右側(cè)探針5’端采用磷酸化處理。PCR擴(kuò)增引物采用試劑盒自帶引物。左探針（left probe oligonucleotide，LPO）和右探針（right probe oligonucleotide，RPO）及引物序列見表1。

表1 MLPA檢測探針及引物序列Table 1 Probes and primers used for MLPA

1.3.4 MLPA檢測

參照MLPA試劑盒說明書進(jìn)行MLPA檢測：取5 μL DNA模板（20 ng/μL）95 ℃變性5 min，冷卻至25 ℃，加入3 μL雜交混合液（1.5 μL探針混合液和1.5 μL SALSA緩沖液），60 ℃雜交16 h。探針混合液中各探針終含量為2 fmol。加入連接酶反應(yīng)液32 μL（3 μL緩沖液A、3 μL緩沖液B、25 μL H2O、1 μL Ligase-65），54 ℃、15 min，98 ℃、5 min。冷卻至25 ℃后加入PCR反應(yīng)混合液10 μL（7.5 μL H2O，2 μL PCR primer mix，0.5 μL SALSA聚合酶），95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35 次，72 ℃、20 min。每個反應(yīng)設(shè)置2 個平行。

取1 μL PCR產(chǎn)物（稀釋10～100 倍），加入9 μL HiDi和0.5 μL Genescan 500 LIZ混合，用3500毛細(xì)管基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳片段分析。電泳條件為運(yùn)行溫度60 ℃、進(jìn)樣時間5 s、進(jìn)樣電壓1.6 kV、運(yùn)行時間1800 s、運(yùn)行電壓15 kV。數(shù)據(jù)由GeneMapper 4.0軟件進(jìn)行分析。

1.3.5 PCR產(chǎn)物測序

將6 種過敏原單重檢測中PCR產(chǎn)物純化送至武漢擎科生物有限公司進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)Geneious 10.2.2軟件拼接后在NCBI GenBank進(jìn)行BLAST比對驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測靶標(biāo)的選擇和探針的設(shè)計(jì)

ITS是核糖體基因18S-5.8S-26S之間內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列，核糖體編碼基因在植物中高度保守，但I(xiàn)TS具有物種特異性，能夠區(qū)分親緣性較高的物種，是植物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)最受關(guān)注的工具之一[25]。同時，由于ITS序列的多拷貝特性，更適合經(jīng)過復(fù)雜加工的食品樣品的DNA擴(kuò)增，能夠提高檢測的靈敏度[26]。因此，本研究選取核糖體DNA ITS區(qū)域作為靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)大豆、芝麻、核桃、杏仁、榛子和花生6 種過敏原探針。

MLPA檢測每個靶標(biāo)需要設(shè)計(jì)兩個相鄰的半探針LPO和RPO，包含各自特異性雜交位點(diǎn)（hybridizing site，HS）以及通用引物結(jié)合位點(diǎn)（primer binding site，PBS）。為便于片段分析，每個靶標(biāo)LPO和RPO連接片段長度應(yīng)相差4 bp以上，本研究在PBS和HS間加入了填充序列調(diào)整產(chǎn)物長度以區(qū)分不同靶標(biāo)。當(dāng)相鄰的半探針與目標(biāo)結(jié)合并連接后，會產(chǎn)生特定大小的目標(biāo)DNA產(chǎn)物，經(jīng)通用引物PCR擴(kuò)增后即可由毛細(xì)管電泳分離檢測。

2.2 特異性分析

探針序列在NCBI GenBank中經(jīng)BLAST比對驗(yàn)證，顯示6 對探針特異性良好。每種探針與其靶標(biāo)物種DNA模板進(jìn)行MLPA測試，均產(chǎn)生單一擴(kuò)增峰，其大小分別為芝麻103.16 bp、榛子110.98 bp、大豆115.67 bp、花生119.61 bp、核桃123.75 bp、杏仁130.78 bp，結(jié)果見圖1。將PCR產(chǎn)物測序序列經(jīng)BLAST比對確證為對應(yīng)物種ITS序列，同源性均為100%。利用6 種探針組合進(jìn)行隨機(jī)多重檢測，均可產(chǎn)生與預(yù)期大小一致的擴(kuò)增峰，這說明該MLPA體系能夠進(jìn)行六重過敏原的同時檢測?；旌咸结槍?shí)際片段大小與理論值有2 bp左右偏差，其原因可能為1）Genescan 500LIZ與待測片段熒光標(biāo)記不同導(dǎo)致的電泳遷移率不同；2）不同片段DNA結(jié)構(gòu)和堿基組成的不同導(dǎo)致遷移率不同[27]。

圖1 6 種過敏原混合MLPA毛細(xì)管電泳檢測圖Fig.1 Capillary electrophoresis of the MLPA system using a mixture of sesame,hazelnut,soybean,peanut,walnut and almond DNAs

鑒于食品成分的復(fù)雜性，有必要將含過敏原食品中可能出現(xiàn)的物種作為特異性篩查對象進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明（表2），除杏仁外，其他探針與待測物種均無交叉反應(yīng)。而杏仁探針與杏、桃均有交叉反應(yīng)，這與其物種親緣關(guān)系較近有關(guān)，這提示當(dāng)食品中同時含有杏仁與這幾種成分時陽性結(jié)果需通過測序或其他技術(shù)手段進(jìn)一步區(qū)分。

表2 過敏原MLPA體系特異性驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Specificity of allergen-MLPA system

2.3 靈敏度分析結(jié)果

由于缺乏多重過敏原成分檢測的標(biāo)準(zhǔn)樣品，課題組自制模擬參考樣品測定MLPA體系的靈敏度?？紤]到大豆、芝麻、核桃、杏仁、榛子和花生以配料形式廣泛存在于各類食品中，本研究選取了餅干作為模擬樣品制備的基質(zhì)，同時添加6 種過敏原，其中各過敏原含量0.1～10000 mg/kg不等，充分模擬了食品加工過程中過敏原的無意污染和有意添加的情況。所有原材料均預(yù)先進(jìn)行了MLPA測定，證實(shí)不含有靶標(biāo)物質(zhì)。

該方法靈敏度定義為在該含量下，所有平行實(shí)驗(yàn)均為陽性結(jié)果。圖2顯示了模擬參考樣品在過敏原含量為100、10、5、1 mg/kg時MLPA毛細(xì)管電泳測定圖譜，可見隨著過敏原含量逐漸降低，擴(kuò)增峰信號值也隨之降低，直至含量為1 mg/kg時平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分為陰性。因此，經(jīng)測定本方法總靈敏度為5 mg/kg。6 種過敏原中，核桃信號峰較其他成分始終較低，含量為5 mg/kg時信號值已降至接近1000 RFU，而在各模板濃度相同的混合樣本測定時并非如此（圖1），推測與該成分DNA提取效率較低有關(guān)。起始材料取樣量相同的情況下進(jìn)行DNA提取時，其他5 種過敏原材料最終提取質(zhì)量濃度可達(dá)50～100 ng/μL之間，而核桃質(zhì)量濃度只有20 ng/μL左右。主信號峰左側(cè)（n-1）處出現(xiàn)的低信號峰與進(jìn)樣速度和寡核苷酸雜質(zhì)有關(guān)。為避免導(dǎo)致嚴(yán)重過敏反應(yīng)，理想的過敏原檢出限應(yīng)為1～100 mg/kg過敏原成分或1～10 mg/kg蛋白組分[28]，而本方法達(dá)到的檢出限5 mg/kg能夠滿足該要求，且低于López-Calleja[20]、Mustorp[29]以及García-García[30]等報(bào)道的10～50 mg/kg的檢出限。與現(xiàn)有過敏原標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1961—2013《出口食品過敏原成分檢測》[31]對比，利用單重real-time PCR檢測大豆、杏仁、芝麻、核桃、榛子時其檢出限為100 mg/kg，遠(yuǎn)高于本方法檢出限。

圖2 添加6 種過敏原模擬樣品MLPA毛細(xì)管電泳檢測圖Fig.2 Capillary electrophoresis patterns for MLPA analysis of model cookie spiked with six allergens at different concentrations

2.4 實(shí)際樣品分析結(jié)果

為評估過敏原MLPA體系對于實(shí)際樣本的檢測能力，對市售30 份食品樣品進(jìn)行過敏原MLPA測定，包括糖果、巧克力、調(diào)味醬、麥片、冰淇淋、糕點(diǎn)、飲料、嬰幼兒輔食等。根據(jù)各國過敏原標(biāo)識規(guī)定，商品的過敏原標(biāo)簽應(yīng)包括強(qiáng)制標(biāo)識含有的過敏原成分及交叉接觸導(dǎo)致可能含有的過敏原標(biāo)識。本研究采集的30 份樣品中，通過標(biāo)識“該產(chǎn)品含有××”、“可能含有××”或“該生產(chǎn)線同時生產(chǎn)××”等提示添加或可能含有的過敏原成分。表3顯示了各樣品過敏原標(biāo)識情況及最終檢測結(jié)果，圖3顯示了典型樣品的MLPA檢測結(jié)果。

表3 市售食品過敏原MLPA檢測結(jié)果Table 3 Results of MLPA analysis of commercial food products

圖3 實(shí)際樣品MLPA毛細(xì)管電泳檢測圖Fig.3 Capillary electrophoresis patterns for MLPA analysis of commercial food products

從表3可見，50%的樣品檢測結(jié)果與過敏原標(biāo)稱不一致（樣品3、4、5、9、10、13、15、18、19、22、23、24、25、29、30），其中樣品3、4、5、9、13、22、23、25、29、30檢出未標(biāo)稱的過敏原成分，而樣品3、10、15、18、19、24部分標(biāo)稱過敏原未檢出。這可能是由于同一生產(chǎn)線生產(chǎn)不同產(chǎn)品中途未清洗徹底或原料儲存時的交叉污染導(dǎo)致，也有部分結(jié)果可能是以低價(jià)原料冒充高價(jià)原料的故意摻假行為所致。但無論是何種原因，這種與標(biāo)稱過敏原不一致的情況很可能會導(dǎo)致過敏人群的誤食行為，帶來安全隱患。

由于微量過敏成分便有可能引發(fā)過敏反應(yīng)，市售商品一般會在食品包裝上以“可能含有”字樣進(jìn)行免責(zé)申明。以上檢測結(jié)果中，樣品4、5、9、23、25所檢出的與聲稱不一致的成分均在可能含有提示中出現(xiàn)，從一定程度上能夠提醒消費(fèi)者避免食用風(fēng)險(xiǎn)。然而，大部分可能含有的提示成分也并未在最終檢出結(jié)果中呈現(xiàn)，這也提示在過敏原標(biāo)簽管理上應(yīng)該更加嚴(yán)格和謹(jǐn)慎，避免因?yàn)檫^度標(biāo)注而提升過敏癥人群選購食品的難度。

3 結(jié)論

與其他過敏原檢測方法相比，MLPA檢測具備以下優(yōu)勢：探針標(biāo)記簡單、用量少、成本低；探針之間相互影響小，能夠在體系中靈活添加或減少，多重檢測靶標(biāo)數(shù)量多等。但食品中過敏原核酸檢測受限于食品基質(zhì)和加工的影響，對方法的檢出限和抗抑制能力要求較高。本研究建立的六重過敏原MLPA檢測體系能夠同時對芝麻、花生、大豆、杏仁、榛子和核桃進(jìn)行檢測，檢出限為5 mg/kg，特異性較好、靈敏度高，性能滿足市售樣品檢測需求，有望成為過敏原標(biāo)簽監(jiān)管的有力技術(shù)支撐。而杏仁源性探針的特異性有待進(jìn)一步提升，以區(qū)分親緣關(guān)系較近物種。