超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品中腰果過(guò)敏原

寧亞維，楊 正，馬俊美，劉 茁，陳 佳，李 強(qiáng),*

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050000；3.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北 石家莊 050035）

近年來(lái)，食物過(guò)敏在世界范圍內(nèi)的發(fā)生率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，食物過(guò)敏已成為僅次于微生物污染的第2大食品安全問(wèn)題[1]。據(jù)數(shù)據(jù)研究顯示，食物過(guò)敏在成年人中的患病率約為5%，兒童由于自身的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，患病率約為8%[2]。當(dāng)患者接觸過(guò)敏原時(shí)，典型的過(guò)敏癥狀包括嘔吐、腹瀉、呼吸困難以及皮膚表面出現(xiàn)蕁麻疹等，但也有患者出現(xiàn)比較嚴(yán)重的過(guò)敏性休克等危及生命的癥狀[3]?，F(xiàn)階段對(duì)于食物過(guò)敏尚無(wú)有效的治療手段，避免接觸食物過(guò)敏原是避免消費(fèi)者誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的唯一方法[4]。為了給消費(fèi)者提供更可靠的食品信息，各國(guó)均制定了嚴(yán)格的食品過(guò)敏原標(biāo)注要求[5-7]，但由于各國(guó)對(duì)食品標(biāo)簽要求不盡相同，因此過(guò)敏原信息標(biāo)注存在差異，同時(shí)食品標(biāo)簽難以對(duì)食品在生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯存過(guò)程中由于交叉污染而產(chǎn)生的隱性過(guò)敏原進(jìn)行標(biāo)注，這給過(guò)敏人群造成了潛在的風(fēng)險(xiǎn)[8]。為了幫助過(guò)敏患者規(guī)避食品中的過(guò)敏原，同時(shí)監(jiān)督食品標(biāo)簽準(zhǔn)確性，開(kāi)發(fā)食品過(guò)敏原高靈敏度檢測(cè)方法十分重要。

常見(jiàn)的食品過(guò)敏原主要包括花生、雞蛋、牛奶、大豆、堅(jiān)果、含麩質(zhì)的谷物、魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)八大類(lèi)[9]。腰果與核桃、杏仁和榛子并稱(chēng)為世界四大堅(jiān)果[10]，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而腰果中存在堅(jiān)果過(guò)敏原，可引起體溫下降、腹部疼痛、全身瘙癢及呼吸困難的食物過(guò)敏癥狀[11]。現(xiàn)階段用于腰果過(guò)敏原的檢測(cè)技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法[12-13]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法[14-15]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectromotry，LC-MS）法[16-19]。其中，ELISA為現(xiàn)階段過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)中最為成熟的方法。該方法以致敏蛋白為檢測(cè)依據(jù)，基于抗原和抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。Zhao Yiqing等[12]以Ana o 3為蛋白標(biāo)記物，開(kāi)發(fā)了一種雙抗體夾心ELISA法用于檢測(cè)預(yù)包裝食品中的殘留腰果成分。在餅干基質(zhì)和巧克力基質(zhì)中的定量限（limit of quantitation，LOQ）分別為40 mg/kg和4 mg/kg，在巧克力中回收率為74.0%～87.7%，但在餅干中的回收率僅為40.2%～44.9%，回收率較低。由此可見(jiàn)盡管ELISA技術(shù)檢測(cè)過(guò)敏原存在具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，但針對(duì)經(jīng)過(guò)烹煮、煎炒等高強(qiáng)度加工處理的食品，通常會(huì)因特異性結(jié)合表位的損傷而導(dǎo)致致敏蛋白難以被特異性抗體識(shí)別，因而存在假陰性結(jié)果[20]。PCR法依賴致敏蛋白的DNA進(jìn)行檢測(cè)，避免了加工手段對(duì)致敏蛋白檢測(cè)的影響，但該方法通過(guò)DNA間接檢測(cè)致敏蛋白，且核酸在提取過(guò)程中易于受到污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[21]。而食品在加工過(guò)程中不會(huì)造成蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列的改變，因此基于過(guò)敏原特征肽段的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)可以改善ELISA的假陰性和PCR假陽(yáng)性的問(wèn)題，具有較好地開(kāi)發(fā)潛力。目前使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)腰果過(guò)敏原的文獻(xiàn)已有報(bào)道，Bignardi等[16]選取VFDCGVR為腰果特異性肽段，利用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合快速固相萃取技術(shù)，提高了餅干和巧克力中腰果的檢測(cè)靈敏度，其中在巧克力中腰果的定量限為50 mg/kg；Bignardi等[22]建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法檢測(cè)加工食品中的腰果過(guò)敏原，定量限為10 mg/kg；Lee等[23]采用液相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）技術(shù)顯著提高了檢測(cè)餅干中的腰果過(guò)敏原，定量限為46 mg/kg。近年來(lái)，我國(guó)研究人員也逐漸對(duì)LC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)食品過(guò)敏原引起重視，在2019年頒布了GB/T 38163—2019《常見(jiàn)過(guò)敏蛋白的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了固態(tài)食品中牛奶、雞蛋、花生、榛子、杏仁、大豆和核桃過(guò)敏蛋白的液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法，但目前我國(guó)還沒(méi)有針對(duì)液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)腰果過(guò)敏原的相關(guān)報(bào)道。

基于質(zhì)譜技術(shù)在過(guò)敏原檢測(cè)中準(zhǔn)確、穩(wěn)定且高效的優(yōu)點(diǎn)，本研究采用Easy-nLC 1000納升液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（Easy-nLC 1000-Q-Exactive）篩選腰果過(guò)敏原特異性肽段，并通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，擬建立基于特征肽段的腰果過(guò)敏原MRM模式檢測(cè)方法，用于多種食品基質(zhì)中腰果過(guò)敏原的快速篩查和定量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、碳酸氫銨（均為分析純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；尿素（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正己烷、乙腈（均為質(zhì)譜級(jí)） 美國(guó)Fisher Scientific公司；TPCK-胰蛋白酶（生物級(jí)） 美國(guó)AB SCIEX公司；甲酸（色譜純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水由Millipore純水機(jī)制備；腰果、餅干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力、飲料等食品隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Easy-nLC 1000-Q-Exactive納升液相色譜-串聯(lián)四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜、C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）、超濾離心管（10 kDa）美國(guó)Thermo Scientific公司；Utimate3000-Qtrap5500超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜 美國(guó)AB SCIEX公司C18富集柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）、C18分析柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?） 北京樂(lè)潤(rùn)峰科技有限公司；低蛋白吸附樣品瓶（250 μL） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

稱(chēng)取2 g（精確至0.001 g）生腰果樣品于豆?jié){機(jī)中，加入50 mL水，使用豆?jié){機(jī)磨漿5 min，直至腰果顆粒完全溶解。將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水定容，配制成20 mg/mL的腰果標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

稱(chēng)取1 g（精確至0.001 g）經(jīng)過(guò)研磨機(jī)研磨成粉末的樣品置于50 mL離心管，加入5 mL正己烷除脂，震蕩混勻15 min，4000×g離心15 min，棄去3 mL上清液，重復(fù)脫脂操作2 次。樣品用氮?dú)獯蹈珊?，加? mL提取緩沖液（含2 mol/L尿素的50 mmol/L Tris溶液），旋轉(zhuǎn)振蕩提取1 h，然后6000×g離心20 min。移取500 μL上清液至2 mL離心管中，加入10 μL還原劑（500 mmol/L DTT），混勻后置于60 ℃水浴鍋中振蕩反應(yīng)30 min。將上述樣品混合物冷卻至室溫后，加入30 μL烷基化試劑（500 mmol/L IAA）暗處反應(yīng)30 min，然后加入430 μL的酶解緩沖液（500 mmol/L的碳酸氫銨溶液和1 μmol/L的氯化鈣溶液）和20 μL胰蛋白酶（500 μg/mL），混勻后置于37 ℃水浴鍋孵育過(guò)夜。加入10 μL甲酸停止酶解反應(yīng)后，將混合物于12000×g離心8 min，并將上清液轉(zhuǎn)移至10 kDa超濾離心管，14400×g離心20 min以凈化蛋白。最后，收集濾液進(jìn)行分析（所有試劑均使用Watsons蒸餾水配制）。

1.3.3 Easy-nLC 1000-Q Exactive測(cè)定條件

色譜條件：預(yù)柱：C18色譜柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）；分析柱：C18毛細(xì)色譜柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B 為乙腈；洗脫程序：0～3 min，97%～93% A，3%～7% B；3～38 min，93%～78% A，7%～22% B；38～48 min，78%～65% A，22%～35% B；48～50 min，65%～10% A，35%～90% B；50～60 min，10% A，90% B；流速300 μL/min；進(jìn)樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：Nanospray Flix電離源，正離子模式；掃描模式為Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70000；AGC target為1×106；質(zhì)量掃描范圍m/z350～1800；dd-MS2分辨率17500；AGC target為1×105；隔離窗口為m/z2.0；Fixed first mass為m/z120.0；碰撞能量27 eV。

1.3.4 Utimate 3000-Qtrap 5500測(cè)定條件

色譜條件：C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈；洗脫程序：0～1.3 min，98% A，2% B；1.3～11 min，98%～60% A，2%～40% B；11～12.5 min，60%～2% A，40%～98% B；12.5～14.4 min，2% A，98% B；14.4～14.6 min，2%～98% A，98%～2% B；14.6～20 min，98% A，2% B；流速300 μL/min；進(jìn)樣體積5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（正離子）；MRM；離子化電壓4000 V；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力55 psi；氣簾氣壓力30 psi；離子源溫度450 ℃。

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.5.1 線性關(guān)系、檢出限、定量限

按照1.3.2節(jié)中的前處理步驟得到空白基質(zhì)提取液，隨后使用空白基質(zhì)提取液將腰果標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（20 mg/mL）稀釋至質(zhì)量濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mg/mL的溶液。各質(zhì)量濃度樣品分別取500 μL加入2 mL離心管中，經(jīng)1.3.2節(jié)中的還原、烷基化和酶解后得到酶解液。之后加10 μL的甲酸停止消化，于12000×g離心8 min，取上清液過(guò)0.22 μm MCM濾膜，收集濾液進(jìn)行LC-MS/MS分析。

以特征肽段的色譜峰面積作為縱坐標(biāo)（Y），腰果的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）計(jì)算線性方程，每個(gè)樣品設(shè)置4 個(gè)平行。特征肽段的信噪比為3時(shí)對(duì)應(yīng)的腰果質(zhì)量濃度記為檢出限（limit of detection，LOD）；當(dāng)特征肽段的信噪比為10時(shí)，腰果對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度記為L(zhǎng)OQ。

1.3.5.2 加標(biāo)回收率

向空白基質(zhì)中添加腰果標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液以測(cè)定回收率，添加量為腰果特征肽段的2、10、20 倍LOQ 3 個(gè)水平，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置6 個(gè)平行以計(jì)算方法精密度。

1.3.5.3 基質(zhì)效應(yīng)

篩選配料表中不含腰果以及經(jīng)檢測(cè)后不含腰果的餅干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和飲料樣品作為空白基質(zhì)，精密移取一定量的腰果標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用空白基質(zhì)提取液梯度稀釋配成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液用于計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)按下式計(jì)算：

式中：slopematrix為空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；slopestandard為水溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.3.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

將固體樣品研磨成均勻粉末后稱(chēng)取1 g，液體樣品直接移取500 μL，然后按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行前處理，用所建立方法對(duì)樣品中的腰果含量進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 腰果特征肽段的篩選

利用Q-Exactive高分辨率、高精確度的優(yōu)勢(shì)，在Full MS/dd-MS2掃描模式下對(duì)樣品進(jìn)行全掃描?；赨niprot數(shù)據(jù)庫(kù)中全面的腰果蛋白信息，結(jié)合ProteinPilotTM軟件強(qiáng)大的Paragon算法，綜合考慮生物學(xué)修飾、錯(cuò)切漏切和樣本特異性等因素，對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)行分析處理，在得到大量肽段信息中篩選最佳的腰果特異性肽段。

特征肽段的選擇是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品過(guò)敏原中的關(guān)鍵一步，為了保證檢驗(yàn)方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，篩選到的特征肽段需要滿足以下幾點(diǎn)[24-27]：首先肽段的長(zhǎng)度應(yīng)在8～25 個(gè)氨基酸之間；其次肽段應(yīng)不含錯(cuò)切和漏切的酶切位點(diǎn)，并且不含任何蛋白質(zhì)修飾的位點(diǎn)[28]。同時(shí)，篩選到的肽段要經(jīng)過(guò)BLAST搜索驗(yàn)證肽段特異性，確保其為腰果特有肽段。目前已鑒定的腰果過(guò)敏原蛋白有3 種，分別為Ana o 1[29]、Ana o 2[30]和Ana o 3[31]，其氨基酸序列如圖1所示。為了能夠全面的檢測(cè)食品中的腰果過(guò)敏原，本研究基于上述肽段篩選原則，針對(duì)每種腰果過(guò)敏原均篩選了2 條肽段，其中，AFSWEILEAALK和YGQLFEAER肽段對(duì)應(yīng)于Ana o 1，這是首次篩選出腰果Ana o 1的肽段；ADIYTPEVGR和GQVQVVDNFGNR肽段對(duì)應(yīng)于Ana o 2；ELYETASELPR和QFEEQQR對(duì)應(yīng)于Ana o 3。篩選到的6 條肽段長(zhǎng)度適中，特異性好，不易于降解；同時(shí)不含蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)，不易于在蒸煮、燒烤和輻照等加工過(guò)程中發(fā)生成環(huán)、氧化和交聯(lián)等副反應(yīng)，影響定性及定量檢測(cè)結(jié)果[28]；此外，所篩選的肽段經(jīng)過(guò)BLAST搜索驗(yàn)證證實(shí)具有高度特異性。同時(shí)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選肽段是否只存在于腰果中，制備了花生、杏仁、核桃、芝麻、葵花籽、開(kāi)心果和榛子等常見(jiàn)堅(jiān)果的酶解樣品驗(yàn)證腰果肽段特異性，結(jié)果顯示，所篩選的6 條腰果肽段均只在腰果酶解樣品中檢測(cè)到，而其他堅(jiān)果酶解樣品均顯示未檢出，進(jìn)一步驗(yàn)證了肽段特異性。

圖1 Ana o 1、Ana o 2和Ana o 3的氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequences of Ana o 1,Ana o 2 and Ana o 3

2.2 質(zhì)譜參數(shù)及液相色譜條件的優(yōu)化

目標(biāo)蛋白的定量檢測(cè)依賴于MRM模式，該模式的顯著優(yōu)點(diǎn)是具有較高靈敏度和特異性，能夠?qū)?fù)雜基質(zhì)中的微量靶向蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。為了提高特征肽段的檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性，本研究對(duì)液相色譜條件和MRM質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。首先以全掃描模式確定各特征肽段的準(zhǔn)確母離子數(shù)，分別對(duì)其母離子進(jìn)行二級(jí)掃描，篩選響應(yīng)值較高的子離子，每個(gè)肽段選擇了3 個(gè)子離子，響應(yīng)值高且更加穩(wěn)定的子離子作為定量離子，另外2 個(gè)子離子用于輔助定性。進(jìn)一步優(yōu)化每個(gè)子離子的碰撞能量、碎裂電壓等參數(shù)，得到的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果如表1所示。

表1 腰果特征肽段的MRM參數(shù)Table 1 MRM mass spectrometric parameters for cashew specific peptides

比較乙腈-水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸分別作為流動(dòng)相時(shí)肽段的峰形，以AFSWEILEAALK肽段為例，當(dāng)使用乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，有明顯拖尾（圖2A）；當(dāng)流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸時(shí)肽段的峰形更佳，拖尾現(xiàn)象明顯改善（圖2B）。優(yōu)化后6 條特征肽段的提取離子流圖如圖3所示。在相同濃度下的腰果酶解樣品中，ADIYTPEVGR肽段的響應(yīng)值最高。綜合肽段的靈敏度以及穩(wěn)定性，將ADIYTPEVGR作為腰果的定量肽段。

圖2 AFSWEILEAALK肽段流動(dòng)相優(yōu)化圖Fig.2 Optimization of mobile phase for separation of peptide AFSWEILEAALK

圖3 腰果6 條特征肽段提取離子流圖Fig.3 Extracted ion current chromatograms of six cashew specific peptides

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍、LOD和LOQ結(jié)果

為了評(píng)估方法的靈敏度，對(duì)方法的線性范圍、LOD和LOQ進(jìn)行測(cè)定。如表2所示，所篩選的6 條特異性肽段中，AFSWEILEAALK、ADIYTPEVGR和ELYETASELPR三條肽段的靈敏度較高，在固體基質(zhì)中的LOD和LOQ分別為1 mg/kg和2.5 mg/kg；飲料基質(zhì)中的LOD和LOQ分別為0.002 mg/mL和0.005 mg/mL。YGQLFEAER、GQVQVVDNFGNR和QFEEQQR三條肽段靈敏度較低，在固體基質(zhì)中的LOD和LOQ分別為2 mg/kg和5 mg/kg；在飲料基質(zhì)中的LOD和LOQ為0.005 mg/mL和0.01 mg/mL。篩選的6 條腰果肽段在餅干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和飲料6 種基質(zhì)中的線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性系數(shù)均大于0.99。腰果的LOQ為2.5 mg/kg，說(shuō)明本研究方法具有較高的靈敏度。另外本方法選取ADIYTPEVGR肽段作為定量肽段，AFSWEILEAALK、YGQLFEAER、GQVQVVDNFGNR、ELYETASELPR、QFEEQQR肽段用于輔助定性，能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中腰果過(guò)敏原，避免腰果成分誤檢和漏檢。

表2 腰果特征肽段不同基質(zhì)中的線性關(guān)系Table 2 Linear calibration equations for determination of cashew specific peptides in different matrices

2.3.2 加標(biāo)回收率結(jié)果

為了對(duì)方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，向空白基質(zhì)中添加腰果標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行回收率的測(cè)定，結(jié)果如表3、4所示，6 條腰果特征肽段在餅干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和飲料6 種食品基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為82.5%～109.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.9%～8.9%，均小于12%。證明此方法具有較高的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，可以用于不同食品基質(zhì)中腰果過(guò)敏原成分測(cè)定。

表3 腰果肽段在飲料基質(zhì)中的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of added cashew peptides in beverage matrix

表4 腰果肽段不同固體基質(zhì)中的加標(biāo)回收率Table 4 Recoveries of added cashew peptides in different solid matrices

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

食品基質(zhì)可能對(duì)肽段檢測(cè)產(chǎn)生干擾影響檢測(cè)準(zhǔn)確性，因此測(cè)定3 個(gè)肽段在6 種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示（表5）：餅干、面包、蛋糕、桃酥和飲料5 種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)均大于100%，說(shuō)明這5 種基質(zhì)對(duì)腰果肽段的檢測(cè)具有增益作用，巧克力基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)小于100%，說(shuō)明巧克力對(duì)腰果肽段的檢測(cè)具有抑制作用，原因可能為巧克力中較為復(fù)雜的單寧和鞣酸等成分對(duì)肽段的離子化產(chǎn)生了影響。因此，本方法采用基質(zhì)配標(biāo)以補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。

表5 腰果肽段在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)Table 5 Matrix effects of cashew specific peptides in different matrices

2.3.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用建立的檢測(cè)方法對(duì)市售餅干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和飲料6 種食品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明（表6），36 個(gè)樣品中共7 個(gè)樣品檢出腰果過(guò)敏原，檢出率為19.4%，樣品包括1 個(gè)面包樣品、1 個(gè)蛋糕樣品、1 個(gè)桃酥樣品和4 個(gè)飲料樣品。此外，將檢測(cè)結(jié)果與食品標(biāo)簽的標(biāo)注信息進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)：23 個(gè)標(biāo)注不含堅(jiān)果成分的食品，檢測(cè)結(jié)果全部為未檢出；而11 個(gè)標(biāo)注可能含堅(jiān)果成分的樣品中，有5 個(gè)樣品檢出了腰果成分；另外，配料表中標(biāo)注含有腰果，但未以過(guò)敏原形式標(biāo)注的2 個(gè)飲料樣品，也檢出了腰果成分。上述結(jié)果表明該方法不僅可用于食品標(biāo)簽中腰果成分標(biāo)注情況的檢驗(yàn)，還可用于食品中隱性腰果過(guò)敏原的篩查。

表6 市售樣品中腰果含量檢測(cè)結(jié)果Table 6 Results of detection of cashew contents in commercial food samples

續(xù)表6

3 結(jié)論

建立食品中腰果過(guò)敏原的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)方法。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)與高分辨質(zhì)譜相結(jié)合，篩選到了6 條腰果特異性肽段，并采用三重四極桿質(zhì)譜的MRM模式對(duì)食品中腰果過(guò)敏原進(jìn)行定量，從而實(shí)現(xiàn)腰果過(guò)敏原的快速檢測(cè)。該方法可以為我國(guó)食品標(biāo)簽真實(shí)性檢驗(yàn)以及食品中隱性過(guò)敏原檢驗(yàn)提供技術(shù)支持。