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    基于Cu,Fe-N-C氧化酶活性構(gòu)建鄰苯二甲酸酯熒光檢測探針

    2023-03-06 12:49:34陳駿飛王馨蕊湯回花李秋蘭楊德志楊亞玲
    食品科學(xué) 2023年4期
    關(guān)鍵詞:鄰苯二甲酸氧化酶探針

    李 宏,史 巧,陳駿飛,王馨蕊,湯回花,李秋蘭,楊德志,楊亞玲,*

    (1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,云南 昆明 650221;2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650500)

    鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是一個(gè)化合物系列,主要用于生產(chǎn)柔性聚氯乙烯或乙烯基產(chǎn)品,是最常用的塑化劑之一。PAEs與塑料主體以分子間相互作用力的形式結(jié)合,較易轉(zhuǎn)移到各種環(huán)境中,對(duì)空氣、土壤、水源甚至食品造成污染[1-3]。PAEs是一種環(huán)境激素類物質(zhì),可在生物體內(nèi)富集而產(chǎn)生毒性作用,引起肝臟、免疫、生殖內(nèi)分泌和胚胎發(fā)育毒性等,嚴(yán)重威脅人們的身體健康[4-6]。我國在2016年發(fā)布了關(guān)于PAEs的食品國家標(biāo)準(zhǔn),對(duì)食品中PAEs含量限制范圍作出明確規(guī)定[7-8]。目前,PAEs檢測主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、近紅外光譜分析技術(shù)、熒光光譜法以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)等[9-15]。熒光光譜法具有檢測便捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好、強(qiáng)選擇性等優(yōu)勢(shì)[16],但由于PAEs分子本身不能發(fā)出熒光[17-18],各種PAEs的熒光檢測主要集中在對(duì)PAEs進(jìn)行衍生,通過間接熒光法檢測PAEs[19-20]。

    自2007年我國科學(xué)家閻錫蘊(yùn)發(fā)現(xiàn)四氧化三鐵磁性納米顆粒本身具有類過氧化物酶的催化活性以來[21],納米酶的研究得到快速發(fā)展,由于其穩(wěn)定性高、易于生產(chǎn)及成本低,可作為天然酶的替代品等優(yōu)勢(shì),成為研究熱點(diǎn)[22-23]。其中單原子納米酶由于與天然金屬酶的M-Nx位點(diǎn)相似,表現(xiàn)出優(yōu)異的催化活性及選擇性,受到廣泛關(guān)注[24],在單原子納米酶中引入第2個(gè)過渡金屬原子,可以改善酶活性,提高對(duì)底催化的選擇性[25-27]。本研究利用熱解法合成了銅、鐵雙原子納米酶(Cu,Fe-N-C),基于PAEs調(diào)節(jié)Cu,Fe-N-C氧化物模擬酶活性,建立熒光檢測新方法。如圖1所示,Cu,Fe-N-C能催化鄰苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)生成黃色熒光產(chǎn)物2,3-二氨基吩嗪(2,3-diaminophenazine,DAP)。而PAEs的加入會(huì)增強(qiáng)催化體系的熒光強(qiáng)度,由此建立痕量PAEs的熒光探針檢測方法。鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(dioctyl phthalate,DOP)、鄰苯二甲酸二壬酯(dinonyl phthalate,DINP)5 種PAEs類物質(zhì)有此現(xiàn)象,該方法檢測這5 種PAEs的總量。

    圖1 PAEs檢測示意圖Fig.1 Schematic diagram of PAE detection

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    醬腌菜樣品,購自云南昆明市呈貢區(qū)超市。

    DMP、DEP、DBP、DOP、DINP、(分析純,純度≥99%) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;氯化銅(CuCl2)、氯化鐵(FeCl3)、中-四(4-羧基苯基)卟吩、甲醇、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)、OPD、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    GS800A分子熒光光譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;UV-2600紫外-可見分光光度計(jì) 島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司;Tecnai G2 TF30場發(fā)射透射電子顯微鏡 荷蘭FEI公司;X射線衍射儀、TENsoR27型傅里葉紅外光譜分析儀 德國Bruker公司;XW-800快速混勻器 上海汗諾儀器有限公司;HC-3018R型高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;高溫管式爐 上海貝克有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;pH S-3 B精密酸度計(jì)賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司;78-1型磁力加熱攪拌器 上海南匯電訊器材廠;AB204-S電子分析天平 梅特勒-托利多科技(中國)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 Cu,Fe-N-C材料的制備

    參照Lin Zhen[28]和Huang Xuemin[29]等的研究進(jìn)行改進(jìn)。對(duì)配體分子的篩選,材料制備方法如下:10 mL甲醇中含有2.636 g CuCl2作為溶液A,20 mL甲醇中含有5 g中-四(4-羧基苯基)卟吩和2.376 g FeCl3(按Cu、Fe物質(zhì)的量比1∶1計(jì)算得到)作為溶液B,將A和B兩種溶液均勻混合并80 ℃烘箱干燥老化2 h。得到的墨綠色干燥粉末稱取5 g于石英舟中,管式爐750 ℃在N2保護(hù)下煅燒2 h得到黑色粉末。粉末于硫酸溶液(H2SO4∶H2O=1∶9,V/V)中12 h浸泡后用水反復(fù)沖洗。干燥后,后續(xù)用實(shí)驗(yàn)用水配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的懸浮液使用。

    1.3.2 PAEs的檢測

    以DMP為PAEs的模式物,在EP管中依次加入100 μL Cu,Fe-N-C和50 μL 100 mmol/L OPD,一定質(zhì)量濃度的DMP標(biāo)準(zhǔn)溶液,2 mL pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液,充分混勻,室溫孵育10 min后,于8000 r/min離心3 min,取上層清液在421 nm激發(fā)波長下,564 nm發(fā)射波長處測定熒光強(qiáng)度。設(shè)定ΔI=I-I0,I表示加入DMP后溶液的熒光強(qiáng)度;I0表示未加入DMP作空白時(shí)溶液的熒光強(qiáng)度。

    1.3.3 Cu,Fe-N-C材料酶活性的測定

    采用TMB及ABTS顯色反應(yīng)測定Cu,Fe-N-C納米酶的活性。首先,將100 μL Cu,Fe-N-C、100 mmol/L的TMB及ABTS各50 μL,加入到2 mL pH 4.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液,充分混勻,室溫孵育10 min后,于8000 r/min離心3 min,取上層清液用紫外-可見分光光度計(jì)在652 nm及415 nm波長處測定吸光度,每個(gè)樣品測定2~3 次,取平均值。

    Cu,Fe-N-C氧化物模擬酶的酶活性動(dòng)力學(xué)研究,在100 μL Cu,Fe-N-C(0.5 mg/mL)和2 mL 8.0磷酸鹽緩沖溶液中,加入不同濃度的OPD。充分混勻,室溫孵育10 min后,在564 nm發(fā)射波長處測定熒光強(qiáng)度。典型的米氏方程模型:

    式中:V為反應(yīng)速率;Km為米氏常數(shù);Vmax為最大反應(yīng)速率;[S]為底物OPD濃度。

    1.3.4 食品中PAEs的測定

    稱取經(jīng)粉碎混勻的樣品10.00 g于玻璃錐形瓶中,加入50 mL正己烷,于50 ℃水浴溫度下,超聲提取30 min,過濾不溶物,取濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,水浴70 ℃濃縮至溶液體積在1 mL以下,用乙腈定容至5 mL,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,得樣品測定液。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    除反應(yīng)式用Chemdraw Professional 16.0處理外,所有圖片均用Origin 2019b進(jìn)行加工處理。三線表利用Microsoft Office Word 2019繪制。

    檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線采用線性回歸分析方法,以R2評(píng)估方法準(zhǔn)確度。此外在樣本中進(jìn)行加標(biāo),取6 次測定值計(jì)算加標(biāo)回收率驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精密度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Cu,Fe-N-C模擬酶的表征

    從Cu,Fe-N-C的透射電子顯微鏡圖(圖2a)可以看出,所制備的Cu,Fe-N-C呈現(xiàn)類球形,分散性較好,且尺寸大概在3~5 nm范圍內(nèi),此外,高分辨透射電子顯微鏡圖像顯示了0.42 nm的晶面間距(圖2b),對(duì)應(yīng)石墨碳的(002)面(圖2b)[30]。圖2c為EDS元素分布圖,圖像顯示C、N、O、Fe和Cu均勻分布于Cu,Fe-N-C納米材料中。

    從圖2d~g可以看到5 個(gè)不同的特征峰,分別為C1s、N1s、O1s、Cu2p和Fe2p,表明該材料存在C、N、O、Cu和Fe元素;與Fe-N-C及Cu-N-C相比,Cu,Fe-N-C的Fe2p及Cu2p峰向更高的結(jié)合能方向移動(dòng),這歸因于Fe及Cu與碳材料之間的電子離域[30],電子離域也改變了金屬的電子結(jié)構(gòu),使Fe和Cu物種均勻分布;N1s譜分解為位于(398±0.4)、(399.4±0.4)、(400.8±0.4)eV和(402.0±0.4)eV的4 個(gè)峰,分別歸屬于吡啶N、FeN、吡咯N和石墨N的峰。在N1s的精細(xì)X射線光電子能譜(圖2g)中,Cu,Fe-N-C納米酶的吡啶氮含量最高,石墨N及吡咯N含量相近,氧化N和Fe/Cu-N含量相近。

    圖2 Cu,Fe-N-C的透射電子顯微鏡(a)、高分辨透射電子顯微鏡(b)、EDS元素分布(c)和X射線光電子能譜(d~g)圖Fig.2 TEM image (a),HRTEM image (b),elemental distribution map (c) and XPS spectrum (d-g) of Cu,Fe-N-C

    2.2 Cu,Fe-N-C擬氧化酶活性

    Cu,Fe-N-C擬氧化酶活性用典型的TMB、ABTS及OPD作底物,如圖3所示。在沒有H2O2存在的條件下,TMB和ABTS產(chǎn)物在波長652 nm及415 nm處有紫外特征吸收峰,同時(shí)呈現(xiàn)深藍(lán)色、綠色(圖3a)。而OPD的氧化產(chǎn)物在421 nm的光激發(fā)下,發(fā)射出峰位于564 nm的黃色熒光(圖3b)。這些證據(jù)表明Cu,Fe-N-C具有模擬氧化酶活性。

    圖3 Cu,Fe-N-C催化TMB和ABTS的紫外吸收?qǐng)D(a)和OPD的發(fā)射譜圖(b)Fig.3 UV-vis absorption spectra with substrates of ABTS and TMB (a) and fluorescence emission spectra with substrate of OPD (b) in the catalysis of Cu,Fe-N-C

    為了更深入地了解Cu,Fe-N-C的擬氧化酶活性,以O(shè)PD為底物,分析其穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué),記錄不同OPD濃度和反應(yīng)時(shí)間下的熒光強(qiáng)度,由Lineweaver-Burk方程(圖4)得到了米氏常數(shù)Km和最大初始速率Vmax。Vmax指最大反應(yīng)速率,即當(dāng)酶的活性位點(diǎn)完全被底物占據(jù)時(shí)的反應(yīng)速率;Km指反應(yīng)速率達(dá)Vmax值一半時(shí)所需的底物濃度,表示酶對(duì)底物的親和力,Km可以用來評(píng)價(jià)納米酶的催化活性,反映了納米酶對(duì)相應(yīng)底物的親和力[31-32]。雖然Cu,Fe-N-C沒有表現(xiàn)出顯著的Vmax(2.90×10-8mol/(L?s)),但其Km值(0.456 mmol/L)低于大多數(shù)已報(bào)道的模擬氧化酶,表明Cu,Fe-N-C對(duì)OPD具有很高的親和力和模擬氧化酶的活性。

    圖4 OPD擬合米氏方程曲線(a)和OPD線性方程(b)Fig.4 Michaelis-Menten curve (a) and Lineweaver-Burk plot (b) for OPD

    2.3 PAEs測定機(jī)制分析

    為了驗(yàn)證研究體系中自由基的產(chǎn)生,研究分別使用Fe(II)-EDTA、異丙醇(isopropyl alcohol,IPA)和四甲基哌啶(tetramethylpiperidine,Tempol)分別為H2O2、羥自由基和超氧陰離子自由基的捕獲劑。如圖5a所示,IPA的加入,使得Cu,Fe-N-C/OPD體系熒光顯著降低,而Fe(II)-EDTA和Tempol的加入相對(duì)而言變化較小,所以推斷在Cu,Fe-N-C催化OPD氧化為DAP過程中羥自由基為主要的活性物。此外,在加入DAP到體系中之后,羥自由基含量明顯增加。上述研究結(jié)果表明,在Cu,Fe-N-C/OPD體系中加入DMP可有效促進(jìn)熒光DAP的生成。

    PAEs 在堿性條件下水解為鄰苯二甲酸,而在Cu,Fe-N-C/OPD體系中羥自由基的產(chǎn)生,會(huì)引起鄰苯二甲酸羥基化產(chǎn)生羥基苯甲酸,羥基苯甲酸具有熒光,且其最大發(fā)射波長(440 nm)與DAP的激發(fā)波長(421 nm)相接近。故而推斷其增敏機(jī)制可能是由于羥基苯甲酸和DAP之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移,即DMP水解產(chǎn)物發(fā)射峰和DAP熒光激發(fā)峰的疊加(圖5b、c)。

    圖5 自由基的捕獲圖(a)、DMP和DAP的熒光激發(fā)和發(fā)射(b)、反應(yīng)機(jī)制(c)Fig.5 Fluorescence intensity versus wavelength plots showing free radical capture (a) and fluorescence excitation and emission of DMP and DAP (b),and reaction mechanism (c)

    2.4 熒光探針測定PAEs的條件優(yōu)化

    2.4.1 溶液pH值對(duì)體系的影響

    天然納米酶在酸性環(huán)境下會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化活性。為獲得熒光探針高靈敏測定PAEs的最優(yōu)pH值,實(shí)驗(yàn)選用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液作為緩沖體系,考察緩沖溶液pH值的影響。如圖6a所示,緩沖溶液pH 6~9范圍內(nèi),DMP對(duì)Cu,Fe-N-C氧化物模擬酶活性有明顯增強(qiáng)作用,在pH 8.0時(shí)催化氧化OPD效果最佳。因此,研究選用pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液。

    圖6 溶液pH值(a)和反應(yīng)溫度(b)對(duì)Cu,Fe-N-C+OPD檢測體系的影響Fig.6 Effect of reaction solution pH (a) and temperature (b) on Cu,Fe-N-C+OPD detection system

    2.4.2 反應(yīng)溫度及時(shí)間的影響

    如圖6b所示,在室溫(25 ℃)下,反應(yīng)10 min,熒光強(qiáng)度即基本保持穩(wěn)定。雖然后續(xù)溫度升高,體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),但考慮到能耗問題,因此本實(shí)驗(yàn)選擇室溫(25 ℃)下反應(yīng)10 min。

    2.5 熒光探針測定PAEs

    如圖7a所示,當(dāng)Cu,Fe-N-C與DMP同時(shí)加入OPD溶液時(shí),體系的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步升高,在564 nm波長處,溶液的熒光強(qiáng)度隨著DMP質(zhì)量濃度增加而增加。如圖7b所示,在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,DMP質(zhì)量濃度在1.25~50 μg/L范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9900,檢出限(limit of detection,LOD)為0.76 μg/L。

    圖7 不同DMP質(zhì)量濃度對(duì)體系熒光光譜(a)和DMP線性關(guān)系(b)圖Fig.7 Fluorescence spectra of the system in the presence of different concentrations of DMP (a),and linear relationship between fluorescence intensity and DMP concentration (b)

    2.6 熒光探針對(duì)PAEs測定的選擇性

    篩選16 種PAEs對(duì)熒光探針體系的影響,結(jié)果表明,有5 種PAEs對(duì)體系有響應(yīng),說明所構(gòu)建的探針具有很強(qiáng)的抗干擾性,如圖8a所示。同時(shí),考察溶劑對(duì)探針體系的影響,結(jié)果表明,不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)Cu,Fe-N-C/OPD體系有輕微影響,但可忽略不計(jì)(圖8b)。且N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)、正己烷(Hexane)、乙酸(acetic acid,HAc)、丙酮(propanone,PA)、三乙胺(triethylamine,TEA)、乙腈(acetonitrile,ACN)、苯胺(Aniline)等潛在干擾成分對(duì)探針體系的影響均可忽略不計(jì),(實(shí)驗(yàn)中干擾成分質(zhì)量濃度為DMP的50 倍),結(jié)果見圖8c。

    圖8 PAEs對(duì)熒光探針體系的影響(a)、溶劑對(duì)探針體系的影響(b)和干擾成分對(duì)探針體系的影響(c)Fig.8 Influence of PAEs (a),solvents (b),and interfering substances (c) on the probe system

    2.7 發(fā)酵食品中PAEs測定

    按1.3.4節(jié)進(jìn)行樣品處理,檢測3 種發(fā)酵食品、發(fā)酵食品熟料包裝袋及加標(biāo)后樣品中PAEs含量。在最優(yōu)條件下,所測得樣品的結(jié)果見表1、2。結(jié)果表明,3 種發(fā)酵食品及發(fā)酵食品熟料包裝袋樣品中均檢出PAEs,其中3 種發(fā)酵食品PAEs含量在0.16~0.53 μg/kg之間,3 種發(fā)酵食品熟料包裝袋PAEs含量在2.25~3.74 μg/kg之間,樣品的加標(biāo)回收率在88.0%~104.6%范圍內(nèi)。該研究結(jié)果符合GB 5009.12—2017《食品中鉛的測定》要求的精密度,本研究測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于3.1%,表明用本法測定發(fā)酵食品中DMP結(jié)果精密度高、穩(wěn)定性好。

    表1 小米辣、榨菜和醬腌菜樣品中PAEs含量的測定(n=6)Table 1 Results of determination of PAE contents in real samples (n=6)

    表2 小米辣、榨菜和醬腌菜等實(shí)際樣品熟料包裝袋中PAEs的檢測(n=6)Table 2 Recoveries of added PAEs from pickle packaging bags (n =6)

    3 結(jié)論

    建立了一種基于Cu,Fe-N-C納米酶氧化物模擬酶熒光探針檢測發(fā)酵食品中PAEs新方法。研究先以熱解法制備雙原子Cu,Fe-N-C納米材料,該納米材料具有模擬酶氧化酶特性,催化氧化底物OPD,使生成有熒光的DAP。PAEs可以使Cu,Fe-N-C/OPD催化體系熒光線性增強(qiáng)。從而建立了DMP的檢測方法,方法的LOD可達(dá)到0.76 μg/L,完全滿足實(shí)際需求。結(jié)果表明,該反應(yīng)體系對(duì)5 種PAEs有響應(yīng),研究以DMP為代表物。并且將建立方法用于發(fā)酵食品及發(fā)酵食品熟料包裝袋中PAEs的測定,得到滿意結(jié)果,表明方法對(duì)實(shí)際檢測具有一定的應(yīng)用意義和可行性。然而該方法不能實(shí)現(xiàn)對(duì)所有PAEs類物質(zhì)進(jìn)行檢測。

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