L-絲氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵及合成過(guò)程優(yōu)化研究

鄭桂花，鄒文安，趙 倩

（1.成都工業(yè)學(xué)院材環(huán)學(xué)院，成都 611730；2.華中科技大學(xué)分子生物物理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074）

L-絲氨酸是一種不帶電、非極性及非必需氨基酸，在食品行業(yè)具有十分重要的作用。在100℃下條件下加熱食品，加熱的過(guò)程能夠散發(fā)出香味，主要是由于氨基酸和糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)和斯特勒克降解反應(yīng)，生成產(chǎn)物2-羥基乙醛，使得混合物具有楓糖漿香味，能夠增加食物的風(fēng)味[1]。

L-絲氨酸位于代謝過(guò)程的中間位置，轉(zhuǎn)化較快，不易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。目前，主要采用發(fā)酵法、生物酶法、水解及化學(xué)合成法生產(chǎn)L-絲氨酸[2-4]。生物酶法具有較強(qiáng)的催化專(zhuān)一性、溫和的反應(yīng)條件等優(yōu)點(diǎn)[5]。本文采用基因工程菌E.coli-SRZ018產(chǎn)生的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化甘氨酸（glycine，Gly）轉(zhuǎn)化合成L-絲氨酸，催化該步反應(yīng)的酶是絲氨酸經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxymethyltransferase，SHMT），該酶以5-磷酸毗哆醛（5-pyridoxalphosphate，PLP)作為其輔酶。Gly和絲氨酸之間是互相轉(zhuǎn)換，反應(yīng)的生理方向是L-絲氨酸斷裂成為甘氨酸和N5，N10-亞甲基四氫葉酸，輔酶四氫葉酸（tetrahydrofolic acid，THFA）作為C1基團(tuán)的載體，所以，在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和PLP、THFA兩種輔酶因子共同作用下，甘氨酸和甲醛(formaldehyde，HCHO)反應(yīng)生成L-絲氨酸。在體外，當(dāng)有一定濃度的THFA時(shí)，SHMT也可催化HCHO與Gly可逆地合成L-絲氨酸。

隨著酶和細(xì)胞固定化技術(shù)在氨基酸工業(yè)的應(yīng)用，生物酶法合成L-絲氨酸成為研究熱點(diǎn)[6-8]。但生物酶法合成L-絲氨酸存在轉(zhuǎn)化率不高、L-絲氨酸產(chǎn)量不理想等問(wèn)題，而底物甘氨酸的轉(zhuǎn)化率及L-絲氨酸產(chǎn)量受HCHO濃度影響較大。如果HCHO供應(yīng)量超過(guò)L-絲氨酸消耗量，體系中的HCHO逐漸積累，過(guò)量的HCHO和氨基酸的氨基反應(yīng)生成席夫堿和質(zhì)子，溶液pH降低，導(dǎo)致反應(yīng)終止，可能導(dǎo)致底物甘氨酸的轉(zhuǎn)化率不高。因此，本研究旨在從HCHO的供應(yīng)方式入手，針對(duì)酶促轉(zhuǎn)化過(guò)程高濃度HCHO導(dǎo)致的反應(yīng)體系pH下降、抑制底物轉(zhuǎn)化的問(wèn)題，提出了滴加HCHO策略，同步分析其它因素對(duì)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)酸量的影響，為工業(yè)化生產(chǎn)L-絲氨酸提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 L-絲氨酸發(fā)酵條件優(yōu)化

1.1.1 試驗(yàn)材料

菌株E.coli-SRZ018為基因工程菌，系本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。種子培養(yǎng)基：玉米漿、硫酸鎂、谷氨酸鈉；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘油、硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、玉米漿、磷酸氫二鉀、氯化鐵；玉米漿是由本實(shí)驗(yàn)室自有玉米粉經(jīng)過(guò)高溫煮沸配置而成。

1.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)與生物量測(cè)定

配置種子培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)滅菌處理、冷卻，按照5%的體積比接種，37℃條件下，放置于200 rpm/min的搖床培養(yǎng)，間隔1 h取樣一次，測(cè)定菌體生物量。分析不同的碳氮源、金屬離子和氨基酸等不同成分的培養(yǎng)基，在37℃，pH 6.8，裝液量為30 mL/250 mL的條件下，對(duì)微生物SRZ018生長(zhǎng)和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響。其中，生物量的測(cè)定采用蒸餾水稀釋發(fā)酵液至適當(dāng)倍數(shù)，然后利用紫外分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)定OD600作為菌體量[9]。

1.2 生物酶法合成L-絲氨酸過(guò)程優(yōu)化

1.2.1 試驗(yàn)器材

Gly由美國(guó)BIOSHARP公司生產(chǎn)；磷酸吡哆醛、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、十六烷基三甲基溴化銨和HCHO等由國(guó)藥集團(tuán)提供；THFA是由美國(guó)Sigma公司銷(xiāo)售提供；高純度>96%甲酸由天津光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)提供；以上試劑均為分析純級(jí)別。

Thermo SCIENTIFIC離心機(jī)，美國(guó)賽默飛公司；ZHWY-2102培養(yǎng)箱，上海智城；YM-50高壓蒸汽滅菌鍋，上海三申；IMS-50制冰機(jī)，常熟市雪科；JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝；DK-S22電熱恒溫水浴鍋、真空干燥箱，上海精宏。

1.2.2 SRZ018酶活檢測(cè)

SHMT是L-絲氨酸合成中的關(guān)鍵酶，催化甘氨酸和L-絲氨酸的相互轉(zhuǎn)化[10]。細(xì)胞濕重即取一定量的發(fā)酵液，6 000 rpm離心10 min收集菌體；以蒸餾水充分洗滌菌體沉淀后，使用分析天平稱(chēng)取菌體重量。發(fā)酵液中SHMT單位重量菌體酶活力大小的酶比活SA(specific activity，SA)計(jì)算公式如下所示，比活SA單位U/mg。

比活SA=0.971×A279/菌體重量

1.2.3 菌體處理及酶促轉(zhuǎn)化

催化Gly合成L-絲氨酸的SHMT屬于胞內(nèi)酶，培養(yǎng)發(fā)酵一定時(shí)間后，離心收集菌體，對(duì)菌體進(jìn)行破壁處理，于5 000 rpm離心10 min，保留上清液，取一定量，依次加入不同濃度的底物甘氨酸、四氫葉酸和磷酸吡哆醛等物質(zhì)，按照一定速度，滴加甲醛，調(diào)整酶促轉(zhuǎn)化混合溶液pH，30℃條件下開(kāi)始酶促轉(zhuǎn)化，每隔一定時(shí)間取樣，采用HPLC-ESI/MS確定甘氨酸、L-絲氨酸的含量[5]，并計(jì)算底物甘氨酸的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率是反應(yīng)物反應(yīng)程度的重要表征指標(biāo)[11-12]，是參與反應(yīng)的某種物質(zhì)的量占總加入量的百分率，也表示可逆反應(yīng)到達(dá)平衡時(shí)，某反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率等于某反應(yīng)物甘氨酸的初始濃度和平衡濃度的差與該反應(yīng)物的起始濃度比值的百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-絲氨酸高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 不同碳源對(duì)SRZ018發(fā)酵的影響

碳源是培養(yǎng)基的重要組成，作為生命過(guò)程中的能源物質(zhì)參與菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成。本研究重點(diǎn)分析葡萄糖、果糖、麥芽糖和甘油4種不同碳源對(duì)于工程菌SRZ018的影響如圖1所示，發(fā)現(xiàn)不同糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)應(yīng)微生物SRZ018生長(zhǎng)量為：果糖（5.17）>麥芽糖（4.01）>甘油（3.50）>葡萄糖（3.20），由葡萄糖為碳源構(gòu)成的培養(yǎng)基，SRZ018生物量顯著低于其它糖類(lèi)為主的培養(yǎng)基?？赡苁怯捎谄咸烟且种莆⑸锷L(zhǎng)可能是由于培養(yǎng)基的高滲透壓和發(fā)酵過(guò)程中分解產(chǎn)生乙酸的抑制作用所致。進(jìn)一步分析不同濃度的果糖、麥芽糖、葡萄糖和甘油對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成的影響（圖1），可知果糖對(duì)微生物生長(zhǎng)的促進(jìn)效果并不明顯，果糖濃度為15.0 g/L的時(shí)候，生物量增幅較小，提高了5.6%；麥芽糖為5.0 g/L的時(shí)候，菌體OD600由6.51提高到8.61，提高了32.2%，說(shuō)明麥芽糖能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，可用作種子培養(yǎng)基或者發(fā)酵培養(yǎng)基中的速效碳源；向培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖后，無(wú)論是微生物的生長(zhǎng)還是酶活力均受到明顯抑制；甘油為8.0 g/L時(shí)，OD600為7.042，以甘油為碳源對(duì)應(yīng)菌株SRZ018生物量大于葡萄糖的，酶活差異不明顯。隨著甘油濃度持續(xù)增加至15.0 g/L，表現(xiàn)出抑制作用，超過(guò)細(xì)胞氧化能力，造成“Crabtree”效應(yīng)，同時(shí)報(bào)道發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基組分種用甘油代替葡萄糖，有助于減少乙酸物質(zhì)的合成[13]，由此確定采用8.0 g/L的甘油作為唯一碳源。

圖1 不同濃度麥芽糖、葡萄糖、果糖和甘油對(duì)SRZ018發(fā)酵影響Figure 1 Different concentrations of fructose，maltose，glucose and glycerinum have effect on SRZ018 fermentation

2.1.2 不同氮源對(duì)SRZ018發(fā)酵的影響

氮源是微生物生長(zhǎng)繁殖所需的一類(lèi)重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用于構(gòu)成微生物細(xì)胞并參與生理代謝活動(dòng)，常用的氮源物質(zhì)中，通常無(wú)機(jī)化合物被微生物吸收利用較快，有時(shí)也被稱(chēng)為速效氮源，其被利用后會(huì)引起體系酸堿度的變化，可起到調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程的作用。由結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)基中加入蛋白胨后，微生物SRZ018的生長(zhǎng)和酶活均顯著增加。蛋白胨濃度為5 g/L時(shí)，菌株OD600達(dá)到8.387，增加28.7%，此時(shí)酶活達(dá)到0.361 U/mg。蛋白胨含有豐富的氨基酸和維生素成分，能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)代謝。向培養(yǎng)基中添加玉米漿濃度為20.0 g/L時(shí)，SRZ018微生物OD600為11.215，增幅超70%。培養(yǎng)基中玉米漿濃度保持增加，生物量持續(xù)上升，因此，培養(yǎng)基中添加玉米漿后，無(wú)論是微生物的生長(zhǎng)還是酶活均顯著增加。玉米漿含有豐富的氨基酸和維生素成分，能夠促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)代謝[14]，而硫酸銨濃度為10.0 g/L時(shí)，對(duì)應(yīng)酶活最高為0.4，硫酸銨濃度為15.0 g/L時(shí)，菌體OD600超過(guò)7.5，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)作用顯著。硝酸鈉對(duì)微生物SRZ018生長(zhǎng)和SHMT產(chǎn)酶的作用，濃度范圍為5～10 g/L時(shí)變化顯著，在其他濃度范圍內(nèi)變化不顯著。結(jié)合已有研究，某大腸桿菌在分批次補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中，添加多種氮源，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)作用顯著[15]。綜上，蛋白胨、玉米漿對(duì)SRZ018作用較為顯著，選擇5 g/L蛋白胨和35.0 g/L玉米漿作為氮源。

圖2 不同濃度的硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、玉米漿對(duì)SRZ018發(fā)酵影響Figure 2 Different concentrations of fructose，maltose，glucose and glycerinum have effect on SRZ018 fermentation

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)SRZ018發(fā)酵影響

金屬離子對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和酶的活性具有重要的影響，在微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶的過(guò)程中也經(jīng)常會(huì)在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的金屬離子。一般在配培養(yǎng)基時(shí)，鈉、鉀、鈣、鎂、硫和磷等元素常以其鹽類(lèi)的形式進(jìn)行添加，K+是許多酶的激活劑，能夠促進(jìn)糖代謝，適宜的K+濃度，既能夠保證菌體增殖，也能保證菌體酶活。鐵是過(guò)渡元素，存在于細(xì)胞色素、鐵氧還原蛋白和其他鐵硫蛋白、酶的輔助因子中，作為輔酶或活化劑參與許多酶反應(yīng)，是大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)的必要因素。磷是核酸、蛋白質(zhì)尤其是三隣酸腺苷（ATP）的必需構(gòu)成元素，參與多種代謝途徑的調(diào)節(jié)。鋅、鈷、錳、銅、鐵和鉑等元素大多作為酶的輔基和激活劑，需求量相對(duì)較小，往往一些有機(jī)氮源中含有，因而無(wú)需額外加入。依據(jù)前述結(jié)果，向含有玉米漿35 g/L、甘油13.60 g/L、MgSO41 g/L以及蛋白胨10 g/L的培養(yǎng)基中，加入不同濃度的磷酸氫二鉀等物質(zhì)，結(jié)果（圖3）顯示K2HPO4濃度為0.8 g/L時(shí)，發(fā)酵液酶活達(dá)到最大，此時(shí)發(fā)酵液濁度OD600約為10。K2HPO4濃度繼續(xù)升高為2 g/L時(shí)，SRZ018的OD600達(dá)最大10.176，提高了13%。而當(dāng)K+濃度繼續(xù)上升，將抑制微生物的生長(zhǎng)，因此，選擇培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀濃度為0.8 g/L。

圖3 不同濃度的磷酸氫二鉀、氯化鐵對(duì)菌株SRZ018發(fā)酵的影響Figure 3 Different concentration of K2HPO4and FeCL3effects on SRZ018 fermentation

Fe3+促進(jìn)微生物生長(zhǎng)，當(dāng)Fe3+濃度為2.5 g/L時(shí)，SRZ018的OD600達(dá)到最大值14.53，相比提高123%，比活0.38 U/mg，相比提高11.6%。與此相反Fe3+對(duì)發(fā)酵液中SHMT的合成影響不顯著，當(dāng)濃度超過(guò)2.5 g/L時(shí)，抑制發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的合成。有研究表明大腸桿菌對(duì)Fe3+耐受濃度約為0.5 mmol/L[16]，試驗(yàn)所得最適濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)該數(shù)值，推測(cè)可能Fe3+與培養(yǎng)基中其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)變化，生成沉淀。

2.2 酶法合成L-絲氨酸工藝過(guò)程優(yōu)化

2.2.1 不同濃度甘氨酸對(duì)產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)溫度對(duì)底物甘氨酸的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物產(chǎn)量的影響（圖4），發(fā)現(xiàn)隨著甘氨酸濃度的增大，最終反應(yīng)液中L-絲氨酸的濃度也不斷增大，甘氨酸為15 mmol/L時(shí)，單位時(shí)間生成L-絲氨酸的量為6.02 g/L，此時(shí)轉(zhuǎn)化率為90.6%，甘氨酸的氨基與HCHO發(fā)生反應(yīng)，生成席夫堿，理論上起降低反應(yīng)體系中HCHO濃度的作用，隨著甘氨酸濃度增加，甘氨酸抑制產(chǎn)物的合成，導(dǎo)致產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率下降[17-19]。

圖4 甘氨酸對(duì)轉(zhuǎn)化率及L-絲氨酸的產(chǎn)量影響Figure 4 The effect of glycine on conversion rate and the yield of L-serine

2.2.2 磷酸吡哆醛對(duì)產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)化率的影響

由磷酸吡哆醛對(duì)轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物產(chǎn)量的影響結(jié)果（圖5），發(fā)現(xiàn)磷酸吡哆醛濃度由0.2 mmol/L增加到0.4 mmol/L時(shí)，產(chǎn)酸量、轉(zhuǎn)化率均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，磷酸吡哆醛濃度為0.4 mmol/L時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酸量達(dá)到峰值7.94 g/L，相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高88.4%。磷酸吡哆醛濃度由0.4～1.0 mmol/L，單位時(shí)間內(nèi)L-絲氨酸產(chǎn)量依遞減，由6.73 g/L減至5.68 g/L。

圖5 磷酸吡哆醛對(duì)轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物產(chǎn)量的影響Figure 5 The impact of different phosphopyridoxal concentration on conversion rate and the yield of L-serine

2.2.3 不同濃度四氫葉酸對(duì)產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)化率的影響

四氫葉酸對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響如圖6所示?？芍臍淙~酸濃度為5 mmol/L時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)合成的L-絲氨酸量為2.57 g/L，四氫葉酸濃度增加至7 mmol/L，合成L-絲氨酸為8.24 g/L。四氫葉酸濃度7 mmol/L時(shí)，產(chǎn)酸量、轉(zhuǎn)化率達(dá)到峰值，四氫葉酸濃度大于7 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)酸量均快速減小，如果體系中不添加四氫葉酸，同樣Gly、HCHO可以反應(yīng)生成L-絲氨酸，但前者反應(yīng)速度是后者的1 000倍。

圖6 四氫葉酸對(duì)轉(zhuǎn)化率及L-絲氨酸產(chǎn)量的影響Figure 6 The impact of THFA on conversion rate and the yield of L-serine

2.2.4 HCHO添加對(duì)產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)化率的影響

酶促轉(zhuǎn)化混合溶液中含甘氨酸15 mmol/L、磷酸吡哆醛0.4 mmol/L和THFA 7 mmol/L，通入一定量氮?dú)猓尤爰兹?0°C，150 rpm條件下，連續(xù)酶促轉(zhuǎn)化，由試驗(yàn)結(jié)果（圖7、圖8），可知酶促轉(zhuǎn)化1～4 h，HCHO與THFA快速反應(yīng)合成N5-N10亞甲基四氫葉酸，體系中HCHO被消耗，同時(shí)，在SHMT作用下，N5-N10亞甲基四氫葉酸與甘氨酸生成L-絲氨酸，N5-N10亞甲基四氫葉酸上亞甲基轉(zhuǎn)移到甘氨酸結(jié)構(gòu)上生成新的THFA[20]，生成的THFA也可與反應(yīng)體系中的HCHO反應(yīng)，因此，根據(jù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系始終維持在7.5左右上下略微浮動(dòng)，此處結(jié)果未提供）；5～8 h時(shí)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，由于可逆反應(yīng)及產(chǎn)物逐漸積累產(chǎn)生抑制作用，L-絲氨酸合成速率逐漸下降，THFA更新速率逐漸下降，體系中THFA濃度減少，體系中HCHO有所剩余，剩余的HCHO與甘氨酸氨基反應(yīng)，導(dǎo)致pH下降，酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)逐漸終止，體系中甘氨酸與L-絲氨酸濃度保持不變，此時(shí)轉(zhuǎn)化率最高為85.1%[20-21]。據(jù)此，推測(cè)需要改變HCHO供應(yīng)方式，嘗試HCHO滴加，如果酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)的體系pH有所下降，即HCHO有所剩余時(shí)，減少HCHO供應(yīng)；如果反應(yīng)體系pH超過(guò)初始pH時(shí)，選擇增加HCHO供應(yīng)量，依據(jù)反應(yīng)信號(hào)阻止由HCHO逐漸累積引起的L-絲氨酸合成反應(yīng)條件的惡化。

圖7 未采取甲醛滴加時(shí)反應(yīng)體系中組分及轉(zhuǎn)化率變化Figure 7 The trend of composition and conversion rate when HCHO titration wasn′t used.

圖8 甲醛滴加時(shí)反應(yīng)體系中組成成分及底物轉(zhuǎn)化率變化Figure 8 The change of reaction system composition and conversion rate with HCHO titration

為此，開(kāi)展了驗(yàn)證甲醛滴加方法的敏感性實(shí)驗(yàn)，將含有1 mol/L甘氨酸的溶液，向溶液中加入不同量的甲醛，由結(jié)果（圖9）發(fā)現(xiàn)初始pH為6.53時(shí)，向溶液中滴加0.1 mL甲醛溶液，終pH為5.90，單位pH變化需要滴加17.2 mmol/L甲醛，溶液初始pH為7.05或7.5時(shí)，調(diào)整溶液終pH為6.70和7.10時(shí)，單位pH變化需要更多的甲醛（27 mmol/L、37 mmol/L）。

圖9 酶促轉(zhuǎn)化溶液中含甘氨酸量為1 mol/L時(shí)滴加甲醛Figure 9 Formol titration when 1 mol/L glycine contained in mixture

酶促轉(zhuǎn)化混合溶液中含有1 mol/L L-絲氨酸和0.75 mol/L甘氨酸，由結(jié)果（圖10），發(fā)現(xiàn)酶促轉(zhuǎn)化溶液初始pH基本一致的情況下，含L-絲氨酸的溶液下降單位pH需要更多（27.8 mmol/L）的甲醛，因此L-絲氨酸對(duì)甲醛滴加方式的敏感性不如甘氨酸。進(jìn)一步驗(yàn)證了酶促轉(zhuǎn)化溶液中溶液含有1 mol/L甘氨酸與5 mmol/LTHFA時(shí)對(duì)甲醛滴加是否敏感的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)首次滴加甲醛至濃度為5 mmol/L，溶液初始pH保持不變，溶液初始pH為7.02與7.50時(shí)，滴加甲醛止?jié)舛葹? mmol/L，pH同樣保持不變，再次滴加甲醛，溶液初始pH略微下降，因此，甲醛滴加是一種檢測(cè)反應(yīng)體系中甲醛含量的敏感的有效方式。

圖10 溶液中含1 mol/L L-絲氨酸和0.75 mol/L甘氨酸時(shí)滴加甲醛Figure 10 Formol titration when 1 mol/L L-serine and 0.75 mol/L glycine were contained

酶促轉(zhuǎn)化混合溶液中含甘氨酸15 mmol/L、磷酸吡哆醛0.4 mmol/L，THFA 7 mmol/L，通入一定量氮?dú)?，滴加HCHO，30°C，150 rpm條件下，連續(xù)酶促轉(zhuǎn)化，由試驗(yàn)結(jié)果（圖7、圖8）可以看出，酶促轉(zhuǎn)化時(shí)間反應(yīng)0～8 h，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系pH變化，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系pH在7.46～7.53之間浮動(dòng)；pH>7.5時(shí)，開(kāi)始滴加HCHO，滴加HCHO終濃度為10 mmol/L，隨著反應(yīng)進(jìn)行，酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中甘氨酸量逐漸降低，HCHO與THFA反應(yīng)合成N5-N10亞甲基四氫葉酸，體系中HCHO被消耗，在SHMT作用下，N5-N10亞甲基四氫葉酸與甘氨酸生成L-絲氨酸，L-絲氨酸量逐漸增加，底物甘氨酸轉(zhuǎn)化率逐漸增加，8 h時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到峰值95.6%。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)L-絲氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵過(guò)程培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)葡萄糖為碳源構(gòu)成的培養(yǎng)基，SRZ018生物量顯著低于其它糖類(lèi)為主的培養(yǎng)基，葡萄糖抑制SRZ018的生長(zhǎng)和SHMT的表達(dá)。而甘油對(duì)SRZ018的發(fā)酵最有利，最佳添加量為8.0 g/L；蛋白胨、玉米漿對(duì)對(duì)SRZ018的發(fā)酵過(guò)程作用顯著。磷酸氫二鉀促進(jìn)SRZ018的發(fā)酵和產(chǎn)酶，最適添加濃度為0.8 g/L。

進(jìn)一步優(yōu)化生物酶法轉(zhuǎn)化合成L-絲氨酸條件，發(fā)現(xiàn)30℃時(shí)，甘氨酸為15 mmol/L，磷酸吡哆醛為0.4 mmol/L，四氫葉酸為7 mmol/L時(shí)，對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高，針對(duì)酶促轉(zhuǎn)化過(guò)程高濃度HCHO導(dǎo)致的反應(yīng)體系pH下降、抑制底物轉(zhuǎn)化的問(wèn)題，提出了滴加HCHO至終濃度為10 mmol/L的方法，維持反應(yīng)體系pH7.5，最終底物甘氨酸轉(zhuǎn)化率為95.6%，比未采取滴加甲醛時(shí)提高了10.5%。