富硒酵母對長期缺硒和正常大鼠體內(nèi)D-絲氨酸和L-絲氨酸水平的影響

余海立 張 彥* 張鳳偉 張海波 程 倩 陳智仙 董運(yùn)海 李婉奕 張雙慶

(1.安琪酵母股份有限公司，酵母功能湖北省重點實驗室，宜昌443003；2.中國疾病預(yù)防控制 中心營養(yǎng)與健康所，北京100050)

硒是人和動物必需的微量元素，機(jī)體攝入硒不足時，腦是最后出現(xiàn)缺硒的器官，硒對維持神經(jīng)系統(tǒng)生理功能發(fā)揮重要作用[1]。Babür等[2]研究發(fā)現(xiàn)，給予21 d缺硒飼糧導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)能力降低。Sharma等[3]研究發(fā)現(xiàn)，缺硒引起小鼠大腦皮質(zhì)中鐵含量升高和認(rèn)知功能下降。人群調(diào)查表明體內(nèi)硒水平隨著年齡的增加顯著降低，硒水平與認(rèn)知功能存在正相關(guān)，缺硒會引起認(rèn)知功能下降，進(jìn)而引起阿爾茲海默癥、帕金森癥等神經(jīng)疾病的發(fā)生[4]。

L-絲氨酸是人體非必需氨基酸，參與核酸和蛋白質(zhì)代謝，可促進(jìn)脂肪酸代謝、肌肉生長與神經(jīng)細(xì)胞鞘合成，在調(diào)節(jié)機(jī)體健康中發(fā)揮重要生物學(xué)功能[5]。L-絲氨酸經(jīng)絲氨酸消旋酶轉(zhuǎn)化合成D-絲氨酸，D-絲氨酸是動物體內(nèi)水平較高的D型氨基酸之一，廣泛存在于血液、視網(wǎng)膜、腦部組織中，作為神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[6]。D-絲氨酸是機(jī)體必需的功能性氨基酸，在氧化應(yīng)激、免疫、神經(jīng)性疾病等過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默癥模型小鼠腦中D-絲氨酸水平顯著升高，阿爾茲海默癥患者腦脊液中D-絲氨酸水平顯著升高，D-絲氨酸被認(rèn)為是阿爾茲海默癥的一種新型生物標(biāo)志物[7]。Mickiewicz等[8]研究發(fā)現(xiàn)，給予C57BL/6小鼠32周的低硒飼糧會引起血清中絲氨酸水平顯著升高。Yim等[9]研究表明，給予C57BL/6J小鼠5周缺硒飼糧會引起肝臟中絲氨酸水平顯著下降，對大腦中絲氨酸水平無顯著影響。上述研究結(jié)果表明缺硒可引起絲氨酸代謝水平的變化，但未明確是D-絲氨酸還是L-絲氨酸。

臨床研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)硒對阿爾茲海默癥、帕金森癥、小腦萎縮癥等神經(jīng)退行性疾病具有良好的預(yù)防和治療作用[10]。硒可以降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少淀粉樣蛋白的聚集，降低Tau蛋白的過度磷酸化并抑制神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，改善小鼠的認(rèn)知功能障礙[11]。目前，長期缺硒對大腦D-絲氨酸、L-絲氨酸水平的影響，以及體內(nèi)缺硒和足硒時補(bǔ)硒對機(jī)體尤其是腦部D-絲氨酸、L-絲氨酸水平影響的研究還未見報道。本試驗在前期研究[12]的基礎(chǔ)上，建立長期缺硒大鼠模型，旨在研究以富硒酵母形式補(bǔ)充不同劑量硒112 d對缺硒和正常大鼠血漿、大腦皮質(zhì)、海馬中D-絲氨酸、L-絲氨酸水平的影響，明確體內(nèi)硒水平與D-絲氨酸、L-絲氨酸水平的關(guān)系，為確證D-絲氨酸是否為硒改善認(rèn)知功能損傷的生物標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗用Sprague-Dawley大鼠購自三峽大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2017-0012。選取3周齡Sprague-Dawley大鼠120只，隨機(jī)分為缺硒組(n=75)和對照組(n=45)。缺硒組飼喂低硒飼糧(含0.02 mg/kg硒)，正常組飼喂正常飼糧(含0.18 mg/kg硒)，飼喂期為420 d。第1～60天使用AIN-93G型飼糧，試驗第61～420天使用AIN-93M型飼糧，飼養(yǎng)期間缺硒組死亡6只，正常組死亡5只。試驗第421天，將缺硒組大鼠分成4組：缺硒空白對照組(SD-B組，n=17)、缺硒富硒酵母低劑量組(SD-LY組，n=16)、缺硒富硒酵母中劑量組(SD-MY組，n=20)、缺硒富硒酵母高劑量組(SD-HY組，n=16)。將正常組大鼠分為2組：正常空白對照組(SS-B組，n=20)、正常富硒酵母中劑量組(SS-MY組，n=20)。SD-B組繼續(xù)飼喂低硒飼糧，SD-LY、SD-MY、SD-HY組分別飼喂含0.18、0.36和0.72 mg/kg硒的富硒酵母飼糧，SS-B組繼續(xù)飼喂正常飼糧，SS-MY組飼喂含0.36 mg/kg硒的富硒酵母飼糧，飼喂期為112 d。大鼠低硒飼糧按照AIN-93標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。正常飼糧和富硒酵母飼糧是在低硒飼糧的基礎(chǔ)上分別添加亞硒酸鈉和富硒酵母，具體試驗設(shè)計見表2。大鼠實行分籠飼養(yǎng)，控制環(huán)境溫度在(20±2) ℃，相對濕度在55%～65%，自由飲食。

表1 低硒飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 試驗設(shè)計

1.2 試驗材料與儀器

主要材料：富硒酵母，硒含量為2 104 mg/kg。

主要儀器：iCAP RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，美國賽默飛世爾科技公司)、Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫安捷倫科技有限公司)。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 樣品采集

試驗第532天后，將大鼠用乙醚麻醉，眼靜脈叢取血，肝素鈉抗凝，1 520×g離心10 min，取血漿，-80 ℃保存，用于血漿硒水平的測定；斷頭后迅速在冰盤上分離皮質(zhì)、海馬、小腦，-80 ℃保存，用于硒以及D-絲氨酸和L-絲氨酸水平的測定；分離心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸等器官，濾紙吸干后稱量并記錄，并計算器官指數(shù)。

1.3.2 生長性能與器官指數(shù)測定

試驗開始和結(jié)束時以及每隔30 d測定各組大鼠體重。器官指數(shù)計算公式如下：

器官指數(shù)(%)=(器官重量/體重)×100。

1.3.3 硒水平測定

用0.5%硝酸將100 μL血漿稀釋至2.0 mL，混勻離心后取上清過濾，得到待測液，參照余海立等[12]的方法測定硒水平。腦組織經(jīng)微波消解，定容至50 mL，即為待測液，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定硒水平。飼糧硒水平參照GB/T 13883—2008《飼料中硒的測定》中的氫化物原子熒光光譜法測定。

1.3.4D-絲氨酸和L-絲氨酸水平測定

血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白，取上清，氮氣吹干，衍生化后得到待測液，參照余海立等[12]方法測定D-絲氨酸、L-絲氨酸水平。稱取一定量的海馬、大腦皮質(zhì)，加入甲醇低溫下研磨，離心后取上清，氮氣吹干，衍生化后得到待測液，采用高效液相色譜法測定D-絲氨酸和L-絲氨酸水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，缺硒組和正常組之間差異顯著性采用t檢驗分析。補(bǔ)硒試驗中的各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05和P<0.01分別為差異顯著和極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重

由圖1可知，低硒飼糧飼喂60 d后，缺硒組大鼠體重顯著低于正常組大鼠(P<0.05)。補(bǔ)硒112 d后，各組大鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，缺硒會使大鼠生長發(fā)育緩慢，體重降低；補(bǔ)硒可使缺硒大鼠體重恢復(fù)正常。

2.2 器官指數(shù)

由表3可知，各組間心臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。與SD-B組相比，SD-LY組肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，SS-MY組肝臟指數(shù)極顯著降低(P<0.01)。

“*”表示與缺硒組相比差異顯著(P<0.05)，“**”表示與缺硒組相比差異極顯著(P<0.05)。

表3 飼糧硒水平對大鼠器官指數(shù)的影響

2.3 硒水平

2.3.1 血漿硒水平

由圖2可知，與SS-B組相比，SD-B組大鼠血漿硒水平顯著降低(P<0.05)。與SD-B組相比，SD-LY、SD-MY和SD-HY組血漿硒水平顯著升高(P<0.05)，與SS-B組相比，SS-MY組血漿硒水平無顯著變化(P>0.05)，說明通過在飼糧中添加富硒酵母補(bǔ)硒，可使缺硒大鼠血漿硒水平恢復(fù)到正常水平。

圖2 飼糧硒水平對大鼠血漿硒水平的影響

2.3.2 大腦皮質(zhì)和小腦硒水平

由圖3可知，SD-B和SS-B組大鼠大腦皮質(zhì)和小腦硒水平無顯著差異(P>0.05)，說明飼喂低硒飼糧對大鼠大腦皮質(zhì)和小腦硒水平無顯著影響(P>0.05)。與SD-B組相比，SD-LY、SD-MY、SD-HY和SS-MY組大腦皮質(zhì)硒水平極顯著升高(P<0.01)，SD-LY組小腦硒水平略有升高(P>0.05)，SD-MY、SD-HY和SS-MY組小腦硒水平顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，說明通過在飼糧中添加富硒酵母補(bǔ)硒，可顯著提高大鼠大腦皮質(zhì)和小腦中硒水平，且呈劑量依賴。

圖3 飼糧硒水平對大鼠大腦皮質(zhì)和小腦硒水平的影響

2.4 D-絲氨酸和L-絲氨酸水平

2.4.1 血漿D-絲氨酸和L-絲氨酸水平

由圖4可知，與SD-B組相比，SD-LY、SD-MY、SD-HY、SS-B和SS-MY組血漿L-絲氨酸水平顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)，血漿D-絲氨酸水平無顯著變化(P>0.05)，說明長期缺硒使大鼠血漿L-絲氨酸水平顯著升高，補(bǔ)硒可以使其恢復(fù)到正常水平。

圖4 飼糧硒水平對大鼠血漿D-絲氨酸和

2.4.2 大腦皮質(zhì)D-絲氨酸和L-絲氨酸水平

由圖5可知，與SD-B組相比，SD-LY組大腦皮質(zhì)L-絲氨酸水平顯著降低(P<0.05)，SD-MY、SD-HY、SS-B和SS-MY組大腦皮質(zhì)L-絲氨酸水平也有所降低，但差異不顯著(P>0.05)。與SD-B組相比，SD-LY和SD-MY組大腦皮質(zhì)D-絲氨酸水平降低，SD-HY、SS-B和SS-MY組大腦皮質(zhì)D-絲氨酸水平升高，但差異均不顯著(P>0.05)。

圖5 飼糧硒水平對大鼠大腦皮質(zhì)D-絲

2.4.3 海馬D-絲氨酸和L-絲氨酸水平

由圖6可知，與SD-B組相比，SD-HY組海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平極顯著升高(P<0.01)，SD-MY組海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平也有所升高，但差異不顯著(P>0.05)，SD-LY、SS-B和SS-MY組海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平無顯著變化(P>0.05)，說明飼糧中添加高劑量富硒酵母可以顯著升高大鼠海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平。

圖6 飼糧硒水平對大鼠海馬D-絲氨酸和

3 討 論

3.1 富硒酵母對大鼠體內(nèi)硒水平和生長發(fā)育的影響

血漿硒水平是反映體內(nèi)硒營養(yǎng)狀態(tài)的指標(biāo)。田俊梅等[13]認(rèn)為血清硒水平降低為270 ng/mL，大鼠處于低硒狀態(tài)。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼喂缺硒飼糧420 d后，大鼠血漿硒水平為159 ng/mL，說明缺硒大鼠造模成功。Sharma等[3]研究發(fā)現(xiàn)，給予BALB/c小鼠低硒、足硒、過量硒飼糧24周，低硒組小鼠大腦皮質(zhì)硒水平顯著下降，小腦硒水平未見顯著變化；過量硒組小鼠大腦皮質(zhì)和小腦硒水平未見顯著變化。Akahoshi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，給予C57BL/6J小鼠為期6周的低硒飼糧(含硒0.026 mg/kg)，1周后小鼠心臟、肝臟、腎臟等臟器硒水平顯著下降，4周后大腦硒水平顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)，給予大鼠缺硒飼糧532 d，缺硒大鼠大腦皮質(zhì)和小腦硒水平未出現(xiàn)顯著變化，這與上述缺硒小鼠的研究結(jié)果不一致，可能與種屬不一致有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。硒通過硒蛋白發(fā)揮重要生理功能，硒蛋白脫碘酶調(diào)節(jié)三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)水平，T3、T4調(diào)節(jié)甲狀腺激素的分泌，因此長期缺硒可能通過影響脫碘酶活性引起動物生長發(fā)育緩慢[15]，本研究發(fā)現(xiàn)缺硒60 d后缺硒組大鼠體重增長顯著放緩，Amer等[16]發(fā)現(xiàn)通過補(bǔ)硒可以得到改善。

3.2 富硒酵母對大鼠體內(nèi)D-絲氨酸和L-絲氨酸水平的影響

L-絲氨酸是機(jī)體所需的一種氨基酸，在不同階段發(fā)揮不同的生理功能，主要參與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核苷酸、神經(jīng)遞質(zhì)等的合成，同時也是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可轉(zhuǎn)化為D-絲氨酸和甘氨酸，兩者均為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸傳遞、突觸可塑性和興奮性毒性的調(diào)節(jié)，并且D-絲氨酸還在大腦發(fā)育、學(xué)習(xí)和記憶等生理過程中發(fā)揮重要作用[17]。現(xiàn)有研究表明長期缺硒使小鼠血清絲氨酸水平增加[8]，肝臟絲氨酸水平降低，對大腦絲氨酸水平無顯著影響[9]，但未明確是D-絲氨酸還是L-絲氨酸。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，長期缺硒對大鼠血漿、小腦D-絲氨酸、L-絲氨酸水平無顯著影響[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，長期缺硒大鼠血漿L-絲氨酸水平顯著升高，大腦皮質(zhì)L-絲氨酸水平升高，海馬L-絲氨酸水平無顯著變化，血漿、大腦皮質(zhì)和海馬D-絲氨酸水平無顯著變化。與前期研究[13]相比，本研究延長了缺硒時間，發(fā)現(xiàn)大鼠血漿L-絲氨酸水平顯著升高，可能是長期飼喂缺硒飼糧引起體內(nèi)硒水平下降，影響硒蛋白的合成，L-絲氨酸為硒蛋白合成提供碳骨架，硒蛋白合成降低可能引起血漿L-絲氨酸水平的升高。此外，L-絲氨酸具有抗氧化活性，L-絲氨酸水平的增加可能是機(jī)體應(yīng)對硒水平下降引起的氧化應(yīng)激的增加。進(jìn)行補(bǔ)硒后發(fā)現(xiàn)，與SD-B組相比，SD-LY、SD-MY和SD-HY組血漿L-絲氨酸水平顯著降低。這可能是由于補(bǔ)硒顯著提高血漿硒水平，使硒蛋白合成增加，消耗大量L-絲氨酸，造成血漿L-絲氨酸水平下降。大鼠長期缺硒后海馬L-絲氨酸水平未出現(xiàn)顯著變化，補(bǔ)充高劑量硒后海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平顯著升高，這可能是由于L-絲氨酸不能通過血腦屏障，大腦利用葡萄糖從頭合成大量L-絲氨酸以滿足硒蛋白合成的生理需要[18]，引起海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平升高。與SS-B組相比，缺硒532 d大鼠皮質(zhì)L-絲氨酸水平升高，但無顯著差異，補(bǔ)充低劑量硒后L-絲氨酸水平顯著降低，恢復(fù)至SS-B組水平。缺硒大鼠大腦皮質(zhì)L-絲氨酸水平增加可能是機(jī)體應(yīng)對缺硒引起的氧化應(yīng)激水平增加，補(bǔ)硒使大腦皮質(zhì)硒水平升高，進(jìn)而使得L-絲氨酸水平恢復(fù)正常。

4 結(jié) 論

① 補(bǔ)硒使缺硒大鼠體重恢復(fù)正常，并可顯著提高大鼠血漿、大腦皮質(zhì)、小腦硒水平。

② 長期缺硒使大鼠血漿L-絲氨酸水平顯著升高，但對大腦皮質(zhì)、海馬L-絲氨酸水平無顯著影響，血漿、大腦皮質(zhì)、海馬D-絲氨酸水平也無顯著影響。

③ 以富硒酵母形式補(bǔ)硒，飼糧硒水平為0.18、0.36和0.72 mg/kg時可顯著降低缺硒大鼠血漿L-絲氨酸水平，飼糧硒水平為0.72 mg Se/kg時還可顯著升高缺硒大鼠海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平。