甘草酸單銨鹽對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)及甲烷產(chǎn)量的影響

蔣辰宇 崔浩然 白天天 普宣宣 劉俊峰，2 郭雪峰，2*

(1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾843300；2.畜牧科技兵團重點實驗室，阿拉爾843300)

在過去25年中，隨著人們對畜產(chǎn)品需求量的增加，加速了畜牧業(yè)的發(fā)展，導(dǎo)致反芻動物數(shù)量增多和溫室氣體排放量增加。甲烷排放量僅次于二氧化碳，但它在地球上的升溫潛能約為二氧化碳的25倍[1]。其他研究表明，反芻動物的甲烷排放不僅造成2%～12%的能量損失，而且降低了飼料利用率并導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能的降低和飼養(yǎng)成本增加[2]。因此，降低反芻動物的甲烷排放量不僅減少對環(huán)境的污染，并且還提高了反芻動物生產(chǎn)性能，減少飼料能量損失。有研究表明，皂苷作為植物次生代謝產(chǎn)物可以提高瘤胃發(fā)酵效率[3]，通過直接或間接抑制產(chǎn)甲烷菌的活性，降低甲烷產(chǎn)生，此外，它還能提高菌體蛋白的合成效率，提高流入十二指腸的菌體蛋白產(chǎn)量[4]。皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，源于不同植物提取的皂苷在改善瘤胃發(fā)酵方式及效果上也不盡相同[5-8]。甘草酸單銨鹽是甘草皂苷(又稱甘草酸)的一種鹽形式。甘草酸單銨鹽的分子式為C42H65NO16，甘草皂苷的分子式為C42H62O16。由于甘草皂苷在常溫中水溶性較低，為獲得穩(wěn)定、安全、方便的使用途徑，通常使用水溶性較好的甘草酸鹽，如甘草酸單銨鹽、甘草酸二銨鹽、甘草酸一鉀鹽等[9]。新疆是中國甘草的主要產(chǎn)區(qū)，具有非常豐富的甘草資源，若甘草酸單銨鹽能夠用于調(diào)控反芻動物瘤胃發(fā)酵，降低瘤胃甲烷產(chǎn)量，可為新疆地區(qū)豐富的甘草資源開發(fā)利用提供新的思路。因此，本試驗研究不同濃度的甘草酸單銨鹽對綿羊體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)及甲烷產(chǎn)量的影響，旨在為其作為植物提取物添加劑的應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘草酸單銨鹽選購自新疆阿拉爾某甘草產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司，為白色粉末，高效液相色譜法(HPLC)測定其純度≥98%。

1.2 試驗動物及飼糧

選取3只平均體重為(35±3) kg、安裝永久性瘺管的卡拉庫爾羊作為瘤胃液采集的試驗動物。每日09:00和20:00分2次定量飼喂，自由飲水。根據(jù)《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)[10]進行飼糧配制，飼糧以玉米和苜蓿顆粒為主要原料，精粗比為60:40，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content消化能 DE/(MJ/kg)13.61粗蛋白質(zhì) CP11.35鈣 Ca1.14磷 P0.32非纖維性碳水化合物 NFC3)56.11中性洗滌纖維 NDF34.85非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維 NFC/NDF1.61

1.3 試驗設(shè)計

體外培養(yǎng)以粉碎過40目后的基礎(chǔ)飼糧為發(fā)酵底物，分別設(shè)置對照組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組，甘草酸單銨鹽添加濃度分別為0、50、150、250、350、450 mg/L的，分別進行3、9、12、21、24 h的分批次體外培養(yǎng)，每個濃度的每個時間設(shè)置3個重復(fù)，測定其pH、總產(chǎn)氣量、干物質(zhì)降解率、氨態(tài)氮(NH3-N)濃度、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度及甲烷產(chǎn)量。

1.4 體外發(fā)酵培養(yǎng)方法

1.4.1 體外發(fā)酵裝置

體外發(fā)酵裝置為恒溫水浴搖床(溫度和搖晃頻率均可調(diào)節(jié))，搖床上安裝自制框架，用于固定玻璃注射器(100 mL)，并使玻璃注射器的2/3浸入水浴中。玻璃注射器底端連接有自制可控制開關(guān)的閥門，用于抽取人工瘤胃液和收集發(fā)酵氣體。

1.4.2 人工瘤胃液配置

瘤胃液采集：晨飼前2 h，采集3只綿羊瘤胃中不同位點的瘤胃液，并用40～60目4層尼龍布過濾，隨后倒入預(yù)熱達39 ℃的保溫瓶中，蓋嚴瓶口，迅速帶回實驗室并保溫備用。

人工瘤胃液制備：人工唾液根據(jù)Menke等[11]的方法制備。備齊所需培養(yǎng)液，并按1∶2的比例向瘤胃液中加入提前通入二氧化碳并預(yù)熱的人工唾液均勻混合，此過程持續(xù)通入二氧化碳。

1.4.3 體外發(fā)酵培養(yǎng)及樣品的處理

準確稱取發(fā)酵底物0.2 g及對應(yīng)濃度的甘草酸單銨鹽，將其放入注射器頂端，每個樣品稱取3個平行樣。注射芯在插入注射器前應(yīng)在其表面均勻涂抹凡士林，并小心插入注射器，防止發(fā)酵底物被吹出。將配制完的人工瘤胃液吸至注射器內(nèi)，此過程持續(xù)通入二氧化碳，每支30 mL，關(guān)閉注射器閥門，置于39 ℃恒溫數(shù)顯水浴搖床中振蕩發(fā)酵。記錄不同發(fā)酵時間點的產(chǎn)氣量，氣體通過采血針及真空采血管進行收集，收集的氣體用于測定甲烷產(chǎn)量，收集氣體后的發(fā)酵液立即進行pH測定，隨后將發(fā)酵液3 500 r/min離心10 min。取發(fā)酵液上清液分裝入瓶，-20 ℃保存，用于測定NH3-N和VFA濃度。

1.5 指標測定

總產(chǎn)氣量：通過讀取注射器上的刻度測定。

pH：通過?，斉票銛y式pH測試筆進行測定。

干物質(zhì)降解率：按照《動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)實踐教程》[12]測定飼糧干物質(zhì)含量并按公式計算降解率。

歐陽橘紅調(diào)離濱湖先到南京，偶然的機會認識了部里一個司長，半年不到就結(jié)了婚，婚后就沒回南京上班了。她先在化工部當(dāng)工程師，那年國務(wù)院組建石油化工集團公司，從化工部分了一批人到集團公司，她也分到了集團公司，最后在集團副總工程師的位置退休，現(xiàn)在還兼了兩所大學(xué)客座教授。

干物質(zhì)降解率=100×(B-C)/B。

式中：B為待測樣品中干物質(zhì)的含量；C為待測樣品尼龍袋殘渣中干物質(zhì)含量。

NH3-N濃度：參照馮宗慈等[13]方法進行測定。

VFA濃度：參照丁學(xué)智等[14]的方法，采用GC-2014氣相色譜儀進行測定。測定條件為進樣口溫度130 ℃，檢測器溫度200 ℃，柱溫220 ℃，柱流量0.6 mL/min。

甲烷產(chǎn)量：采用GC-2014氣相色譜儀測定。測定條件為進樣口溫度120 ℃，檢測器溫度180 ℃，柱溫80 ℃，柱流量1 mL/min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 21.0的單因素方差分析進行顯著性分析，用Duncan氏法和LSD法進行多重比較，以平均值±標準差表示結(jié)果。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度甘草酸單銨鹽對體外累積產(chǎn)氣量的影響

由表2可知，隨著發(fā)酵時間的增長，產(chǎn)氣量逐漸增加，其中發(fā)酵初期產(chǎn)氣量增長速度較快，且添加甘草酸單銨鹽后的產(chǎn)氣量增長速度高于對照組。但在發(fā)酵24 h后，Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組的產(chǎn)氣量均顯著低于對照組(P<0.05)。Ⅰ組和Ⅱ組在發(fā)酵24 h后的產(chǎn)氣量略大于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵24 h后產(chǎn)氣量最低組為Ⅴ組，產(chǎn)氣量為47.93 mL；產(chǎn)氣量最高組為Ⅱ組，產(chǎn)氣量為64.83 mL。

表2 不同濃度甘草酸單銨鹽對體外產(chǎn)氣量的影響

2.2 不同濃度甘草酸單銨鹽對發(fā)酵液pH的影響

由表3可知，隨著發(fā)酵時間的增長,各組pH呈逐漸下降的趨勢。不同濃度的甘草酸單銨鹽處理后，各試驗組pH均有所下降。在發(fā)酵3 h后，各試驗組pH均顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵9 h后，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組的pH顯著低于對照組(P<0.05)，其他試驗組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵12 h后，各試驗組pH均低于對照組，其中Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組與對照組相比差異顯著(P<0.05)；在發(fā)酵21 h后，各試驗組pH均顯著低于對照組(P<0.05)；但發(fā)酵24 h后，各試驗組與對照組相比，差異均不顯著(P>0.05)。

表3 不同濃度甘草酸單銨鹽對發(fā)酵液pH的影響

2.3 不同濃度甘草酸單銨鹽對發(fā)酵底物干物質(zhì)降解率的影響

表4 不同濃度甘草酸單銨鹽對發(fā)酵底物干物質(zhì)降解率的影響

2.4 不同濃度甘草酸單銨鹽對發(fā)酵液NH3-N濃度的影響

由表5可知，與對照組相比，各試驗組的NH3-N濃度有下降的趨勢。在發(fā)酵3 h后，Ⅰ組、Ⅳ組、Ⅴ組的NH3-N濃度均顯著低于對照組(P<0.05)；在發(fā)酵9 h后，Ⅲ組、Ⅳ組的NH3-N濃度顯著低于對照組(P<0.05)；在發(fā)酵12 h后，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組的NH3-N濃度均顯著低于對照組(P<0.05)；在發(fā)酵21 h后，Ⅳ組的NH3-N濃度顯著低于對照組(P<0.05)；在發(fā)酵24 h后，Ⅱ組和Ⅴ組的NH3-N濃度顯著低于對照組(P<0.05)。

表5 不同濃度甘草酸單銨鹽對瘤胃液NH3-N濃度的影響

2.5 不同濃度甘草酸單銨鹽對發(fā)酵液VFA濃度的影響

由表6可知，隨著發(fā)酵時間的增長，添加甘草酸單銨鹽發(fā)酵液的VFA濃度均呈逐漸增加后稍有降低的趨勢。與對照組相比，試驗組乙酸濃度均呈降低的趨勢，在發(fā)酵12 h后，Ⅲ組乙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；在發(fā)酵3、9和12 h后,Ⅳ組乙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；在發(fā)酵3和12 h后，Ⅴ組乙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)。Ⅰ組再發(fā)酵12 h后，Ⅲ組在發(fā)酵12 h后，Ⅳ組在發(fā)酵3、9和12 h后，Ⅴ組在發(fā)酵3和12 h后丙酸濃度均顯著低于對照組(P<0.05)，但在發(fā)酵24 h后，各試驗組丙酸濃度與對照組相比，差異不顯著(P>0.05)。Ⅳ組在發(fā)酵3和9 h后，及Ⅴ組在發(fā)酵3、12及21 h后，丁酸濃度均顯著低于對照組(P<0.05)，在發(fā)酵24 h后，Ⅳ組的丁酸濃度最低，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。乙酸/丙酸隨著甘草酸單銨鹽濃度的增加逐漸降低。

表6 不同濃度甘草酸單銨鹽對瘤胃液VFA濃度的影響

2.6 不同濃度甘草酸單銨鹽對發(fā)酵液甲烷產(chǎn)量的影響

由表7可知，隨著各組發(fā)酵時間的增加，甲烷產(chǎn)量也隨之增加，但甲烷產(chǎn)量隨著甘草酸單銨鹽濃度的增加而逐漸降低。在發(fā)酵9 h后，Ⅳ組的甲烷產(chǎn)量顯著低于對照組(P<0.05)，其他試驗組均與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；在發(fā)酵3、12、21、24 h后，各試驗組與對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。

表7 不同濃度甘草酸單銨鹽對發(fā)酵液甲烷產(chǎn)量的影響

3 討 論

瘤胃產(chǎn)氣量在一定程度上可以反映出發(fā)酵底物被瘤胃微生物利用的程度[15]，同時產(chǎn)氣量也能夠表現(xiàn)出飼糧中可以利用營養(yǎng)成分的多少，當(dāng)可利用的營養(yǎng)成分越高時產(chǎn)氣量越高[16]。瘤胃氣體主要來源于瘤胃中碳水化合物發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體，主要成分是二氧化碳(50%～65%)、甲烷(30%～40%)，其中還有少量的氮氣、氧氣、氫氣和硫化氫[17]。Hu等[18]利用不同濃度的茶皂素體外發(fā)酵24 h，結(jié)果表明添加茶皂素減少了瘤胃的產(chǎn)氣量；郭雪峰等[5]利用甘草提取物進行體外發(fā)酵24 h，結(jié)果表明產(chǎn)氣量隨著甘草提取物濃度的增加而降低，與本試驗結(jié)果一致。但王曉霞等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，通過體外發(fā)酵試驗研究無患子皂苷及茶皂素對瘤胃發(fā)酵及甲烷產(chǎn)量的影響，表明添加無患子皂苷及茶皂素均提高了瘤胃產(chǎn)氣量并且降低了甲烷產(chǎn)量。?？←惖萚7]的研究也表明絲蘭皂苷提高了瘤胃產(chǎn)氣量同時降低了甲烷產(chǎn)量。王新峰[8]在體外發(fā)酵試驗中添加絞股藍皂苷減少了產(chǎn)氣量同時也減少了甲烷產(chǎn)量。不同植物皂苷均對瘤胃甲烷的產(chǎn)量起到抑制的作用，但產(chǎn)氣量的高低有所不同，這可能是由于不同植物皂苷的分子結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致對改善瘤胃發(fā)酵途徑有所不同，其原理有待進一步研究。

pH是反映瘤胃穩(wěn)定性的重要指標。飼糧結(jié)構(gòu)是影響瘤胃pH的主要因素，pH過高或過低對瘤胃微生物的生長和繁殖都會產(chǎn)生影響[19]。瘤胃發(fā)酵的pH正常范圍一般在6.0～7.0。同時pH的變化會影響VFA濃度以及VFA組成[20]。本試驗參考史高峰等[21]的方法測定甘草酸單銨鹽呈弱酸性，可能影響到本試驗各組的pH，使其有降低的趨勢，但各組pH(6.09～6.40)始終處于6.0～7.0的正常范圍之內(nèi)，對瘤胃微生物的正常活動沒有產(chǎn)生負面影響。

飼糧底物降解率在一定程度上反映瘤胃微生物對其利用的情況，同時降解率的高低與飼糧營養(yǎng)組成有著密不可分的關(guān)系[22]。潘龍等[23]的研究表明，添加柴胡皂苷提高了飼糧干物質(zhì)降解率，這與本試驗添加350 mg/L的甘草酸單銨鹽提高了干物質(zhì)降解率結(jié)果一致。也有研究表明，添加低濃度的絲蘭皂苷可刺激某些瘤胃細菌的生長，調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)，從而提高了飼糧消化率，但高濃度的皂苷在改善瘤胃發(fā)酵上起到驅(qū)除原蟲類似的特性，會導(dǎo)致飼糧消化率下降[24]。但徐晨晨等[25]的研究表明，添加苜蓿皂苷對飼糧干物質(zhì)降解率無顯著影響。因此，關(guān)于皂苷對飼糧降解率的影響結(jié)果報道不一致，這可能與皂苷的種類和添加劑量有關(guān)，具體作用機制有待進一步研究。

NH3-N是飼糧中蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)發(fā)酵分解的產(chǎn)物，也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的主要成分，其濃度反映瘤胃微生物對飼糧中蛋白質(zhì)分解能力及吸收速率的平衡狀態(tài)[26]。在瘤胃中的大部分細菌都是以NH3-N為生長的唯一氮源，而瘤胃原蟲不能利用NH3-N合成所需的蛋白質(zhì)，但可以產(chǎn)生大量NH3-N[27]。嚴淑紅[28]報道奶牛灌服茶皂素可降低NH3-N濃度，其原因可能是茶皂素抑制了原蟲的活性，本試驗結(jié)果與其相似，隨著甘草酸單銨鹽濃度的增加，發(fā)酵液的NH3-N的濃度逐漸降低。但有其他研究表明添加絞股藍皂苷使NH3-N濃度增加，其原因可能是絞股藍皂苷導(dǎo)致原蟲裂解，產(chǎn)生大量微生物蛋白并被其他微生物所利用，從而導(dǎo)致NH3-N濃度的增加[8]。本試驗各試驗組的NH3-N濃度均在6～30 mg/dL的正常范圍之內(nèi)，因此添加甘草酸單銨鹽未對發(fā)酵液NH3-N的平衡性產(chǎn)生不利影響。

VFA可為反芻動物提供能量，是動物生長、繁殖與泌乳等基本活動的主要能量來源之一，其濃度變化直接影響反芻動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、利用和生產(chǎn)能力等[29]。其中瘤胃微生物是影響VFA比例和利用率的主要因素。纖維降解菌利用飼糧中碳水化合物生成乙酸、甲酸、H2、乙醇和乳酸，同時瘤胃甲烷菌與其存在共生關(guān)系可以利用種間氫轉(zhuǎn)移跳過降解過程中生成丙酸和琥珀酸等步驟，提高能量轉(zhuǎn)化效率以及飼料利用率[30]。有研究表明，甲烷產(chǎn)量與纖維的降解率呈正相關(guān)，且反芻動物瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量和纖維降解菌的數(shù)量也呈正相關(guān)關(guān)系[31]。本試驗在添加甘草酸單銨鹽后乙酸在發(fā)酵后期濃度有所降低，致使乙酸/丙酸下降，導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量降低，與上述報道一致。張婷婷[32]研究報道，茶皂甙主要通過改變瘤胃VFA組成結(jié)構(gòu)來調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式，且改善瘤胃發(fā)酵的主要原因是降低了乙酸/丙酸，這與本試驗的結(jié)果一致。但王勇等[33]報道稱，在飼糧中添加苜蓿皂苷提取物提高了乙酸和丁酸的濃度，降低了丙酸濃度，改善了瘤胃發(fā)酵模式并提高了采食量及日增重。關(guān)于皂苷對瘤胃VFA組成影響的報道不一致，這可能與皂苷的種類及理化性質(zhì)有關(guān)。也有研究報道認為瘤胃pH對VFA的結(jié)構(gòu)也有影響，當(dāng)pH在5.5時添加絲蘭提取物改變了VFA結(jié)構(gòu)，提高了丙酸濃度，降低了乙酸濃度，但pH在7.0時則對VFA結(jié)構(gòu)無影響[34]。本試驗添加甘草酸單銨鹽發(fā)酵液的pH為6.09～6.40，可能會引起VFA結(jié)構(gòu)的改變，但機理需要進一步研究。

影響甲烷產(chǎn)量的因素有很多，如飼糧營養(yǎng)結(jié)構(gòu)、pH、乙酸/丙酸、瘤胃甲烷菌數(shù)量等[35]。反芻動物甲烷排放量其中90%是由瘤胃微生物甲烷菌產(chǎn)生[36]。本試驗結(jié)果表明，隨著甘草酸單銨鹽濃度的提高，甲烷產(chǎn)量逐漸降低，說明甘草酸單銨鹽對瘤胃甲烷的產(chǎn)生存在抑制作用，但同時瘤胃pH、NH3-N、VFA濃度等指標均在正常的范圍內(nèi)，說明甘草酸單銨鹽在抑制甲烷產(chǎn)生的同時并未對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生負面影響。Rodríguez等[37]以狼尾草作為發(fā)酵底物，添加象耳豆皂苷體外發(fā)酵24 h并測定甲烷產(chǎn)量，結(jié)果表明甲烷產(chǎn)量顯著降低。有研究認為絲蘭皂苷、絞股藍皂苷、絲蘭皂苷等均可降低瘤胃甲烷的產(chǎn)生量[5-8]，但降低瘤胃甲烷產(chǎn)生量的途徑并不相同。有研究表明，皂苷可導(dǎo)致瘤胃原蟲的數(shù)量減少，從而導(dǎo)致生成甲烷需要的H2減少，與原蟲共生的甲烷菌數(shù)量降低[38]。但由于不同種類的皂苷在改善瘤胃發(fā)酵途徑上有所不同，影響甲烷產(chǎn)量的機理可能也有所不同，因此甘草酸單銨鹽抑制甲烷產(chǎn)生的微生物機理有待進一步通過體內(nèi)試驗進行研究。

4 結(jié) 論

① 甘草酸單銨鹽可降低瘤胃液體外發(fā)酵的產(chǎn)氣量、pH、NH3-N濃度、乙酸/丙酸、甲烷產(chǎn)量，但均未超過正常的生理范圍。

② 在本試驗條件下，通過各項指標分析比較，綜合認為添加濃度為350 mg/L的甘草酸單銨鹽適宜綿羊體外發(fā)酵。