不同實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定單胃動(dòng)物飼料樣品總能的一致性及可加性研究

張晉源 王鈺明 杜中原 董 瑩 李黛淋 王躍麗 黃慶華 杜青之 黃艷玲 趙 峰*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都610041；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京100193；3.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，云浮527400；4.新希望六和股份有限公司，北京100102； 5.唐人神集團(tuán)股份有限公司，株洲412000；6.青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，青島266000； 7.湖南中本智能科技有限公司，長(zhǎng)沙410013)

無(wú)論是生物學(xué)法或體外消化法評(píng)定飼料的有效能值，飼料、糞、尿樣及未消化殘?jiān)目偰?GE)都是必需測(cè)定的數(shù)據(jù)，其變異可能直接影響有效能值的準(zhǔn)確性，從而影響不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定飼料有效能值的可比性。因此，比較不同實(shí)驗(yàn)室間在樣品GE測(cè)定上的差異程度非常重要。目前，在GE的測(cè)定上，我國(guó)僅有煤的發(fā)熱量測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 213—2008)[1]。而動(dòng)物飼料及糞、尿樣品GE的測(cè)定參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(ISO 9831:1998)[2]，其實(shí)驗(yàn)室間的重復(fù)性變異系數(shù)和再現(xiàn)性變異系數(shù)因樣品不同分別在0.09%～2.10%和0.59%～4.71%變化。Bourdillon等[3-4]的試驗(yàn)結(jié)果表明，不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定飼糧GE的變異系數(shù)因樣品不同在0.29%～1.79%變異。Pérez等[5]也得出不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定飼糧GE的變異系數(shù)為1.0%。然而，在上述試驗(yàn)中，用于測(cè)定GE的氧彈熱量計(jì)型號(hào)未詳細(xì)列出。Sibbald等[6]發(fā)現(xiàn)同一氧彈熱量計(jì)在不同的測(cè)定模式下GE的測(cè)定值存在較大差異。杜中原等[7]的數(shù)據(jù)表明，在同一實(shí)驗(yàn)室條件下不同生產(chǎn)商提供的氧彈熱量計(jì)在測(cè)定飼料、糞樣的GE及變異程度上均存在明顯的差異。這些客觀存在的變異必將導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定GE存在更大的變化，然而，其變異程度鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此，本研究在6個(gè)實(shí)驗(yàn)室間使用2種氧彈熱量計(jì)測(cè)定飼料樣品的GE，從而比較不同實(shí)驗(yàn)室間GE測(cè)定的差異及變異程度，為飼糧GE的測(cè)定準(zhǔn)確度提供參考。

1 材料與方法

1.1 飼料原料及飼糧

選用玉米、小麥麩、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、大豆油為代表性飼料原料樣品，其概略養(yǎng)分見(jiàn)表1。

表1 飼料原料的概略養(yǎng)分(絕干基礎(chǔ))

飼糧1～5由玉米、小麥麩、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、大豆油以及膨潤(rùn)土中的2～7種原料組成，形成一系列GE梯度相差約0.418 MJ/kg的飼糧；飼糧6～10在飼糧1～5基礎(chǔ)上添加4%的預(yù)混料(維生素和微量元素的添加量參考王亞等[9])等比例替代原飼糧，其組成見(jiàn)表2。除大豆油外，所有樣品粉碎(粉碎機(jī)型號(hào)：XT-A400；生產(chǎn)商：永康市紅太陽(yáng)機(jī)電)后過(guò)40目方形篩孔，于-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 飼糧組成(絕干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)分為2個(gè)部分。內(nèi)容一：考察飼料的上樣量對(duì)氧彈熱量計(jì)測(cè)定GE值的影響，以確定GE測(cè)定值相對(duì)穩(wěn)定的適宜上樣量。對(duì)6個(gè)飼料原料和10個(gè)飼糧采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，上樣量設(shè)5個(gè)處理水平，即0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g，每個(gè)處理采用PARR-6400氧彈熱量計(jì)重復(fù)測(cè)定4次。內(nèi)容二：考察6個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定飼料原料、飼糧GE的實(shí)驗(yàn)室間變異度及飼料原料間GE的可加性。根據(jù)內(nèi)容一結(jié)果上樣量統(tǒng)一為0.8 g。采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將6個(gè)飼料原料和10個(gè)飼糧各100 g發(fā)至6個(gè)實(shí)驗(yàn)室。其中實(shí)驗(yàn)室1～4采用PARR-6400型氧彈熱量計(jì)，實(shí)驗(yàn)室5、6采用IKA C-2000型氧彈熱量計(jì)。各實(shí)驗(yàn)室對(duì)每個(gè)樣品測(cè)定4個(gè)重復(fù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

按GB/T 6435—2014[10]測(cè)定樣品的水分含量并計(jì)算其干物質(zhì)含量。按GB/T 6432—2018[11]、GB/T 6433—2006[12]、GB/T 6438—2007[13]測(cè)定飼料的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量。飼料及飼糧的GE的測(cè)定根據(jù)ISO 9831:1998[2]的方法進(jìn)行。考慮到粉狀樣品在燃燒時(shí)容易拋灑，從而導(dǎo)致燃燒不充分的幾率增加，因此，采用Whatman鏡頭紙(型號(hào)：2105-841)包裹飼料樣品。在測(cè)樣前，先稱量10張鏡頭紙的總重量(>0.7 g)，然后在氧彈熱量計(jì)中測(cè)定鏡頭紙的GE值。測(cè)定樣品GE時(shí)分別稱量鏡頭紙和樣品的質(zhì)量，在氧彈熱量計(jì)的參數(shù)中輸入鏡頭紙的質(zhì)量及每克的能值，以便測(cè)定樣品GE時(shí)予以扣除。所有實(shí)驗(yàn)室按照相同說(shuō)明進(jìn)行操作。

預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diets：VA 1 500 IU，VD3170 IU，VE 11 IU，VK30.5 mg，VB11.0 mg，VB22.5 mg，VB61.0 mg，VB1211 μg，泛酸 pantothenic acid 8.0 mg，煙酸 nicotinic acid 10.0 mg，葉酸 folic acid 0.3 mg，生物素 biotin 0.05 mg，氯化膽堿 choline chloride 350 mg，Cu(as copper sulfate)4.5 mg，F(xiàn)e(as ferrous sulfate)70 mg，Zn(as zinc sulfate)70 mg，Mn(as manganese sulfate)3 mg，Se(as sodium selenite)0.3 mg，I(as calcium iodate)0.14 mg，NaCl 3 g，石粉 limestone 9.1 g，磷酸氫鈣 CaHPO47.8 g，膨潤(rùn)土 bentonite 18.1 g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

飼糧GE計(jì)算值公式如下：

式中：Gk為某組分的GE值(干物質(zhì)基礎(chǔ))；Pk為組分在該飼糧中的比例(干物質(zhì)基礎(chǔ))。

采用SAS 9.2的MEANS模塊計(jì)算基本統(tǒng)計(jì)量。根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，用GLM模塊分析上樣量對(duì)GE測(cè)定值的差異，并采用Contrast語(yǔ)句進(jìn)行GE測(cè)定值對(duì)上樣量的一次、二次關(guān)系檢驗(yàn)。根據(jù)GB/T 28043—2019[14]和吳旻[15]的描述計(jì)算穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)Z比分?jǐn)?shù)。根據(jù)GB/T 6379.2—2004[16]的描述計(jì)算實(shí)驗(yàn)室間一致性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量曼德?tīng)杊和k值，并計(jì)算GE測(cè)定值的重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室間及再現(xiàn)性變異系數(shù)。通過(guò)GLM模型分析實(shí)驗(yàn)室間GE測(cè)定值的差異顯著性；采用REG模塊將飼糧1～10實(shí)測(cè)的GE值對(duì)計(jì)算的GE進(jìn)行線性歸回，采用TEST語(yǔ)句檢驗(yàn)斜率與1，截距與0的差異顯著性；采用配對(duì)TTEST檢驗(yàn)GE計(jì)算值與測(cè)定值的差異顯著性。從而檢驗(yàn)飼料原料間GE測(cè)定值在飼糧中是否可加。統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算公式[16]如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 上樣量對(duì)飼料樣品GE測(cè)定值的影響

由表3可知，6個(gè)飼料原料及10個(gè)飼糧的GE測(cè)定值均隨上樣量的增加而呈顯著線性和二次曲線增加(P<0.05)。0.2 g上樣量樣品的GE測(cè)定值均顯著低于0.4～1.0 g上樣量相應(yīng)的GE測(cè)定值(P<0.05)。除大豆油和飼糧3以外，0.4 g上樣量測(cè)定的樣品GE測(cè)定值均顯著低于0.8～1.0 g上樣量相應(yīng)的GE測(cè)定值(P<0.05)。在0.6～1.0g上樣量間，樣品GE測(cè)定值相對(duì)差異較小。

表3 不同樣品的上樣量對(duì)GE測(cè)定值的影響

2.2 不同實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定飼料及飼糧GE值的一致性檢驗(yàn)

由圖1可知，從實(shí)驗(yàn)室GE測(cè)定值的Z比分值看，實(shí)驗(yàn)室2有2個(gè)樣品的|Z|>3，實(shí)驗(yàn)室5有2個(gè)樣品的|Z|>3，實(shí)驗(yàn)室6有1個(gè)樣品的|Z|>3。實(shí)驗(yàn)室1、3、4的|Z|均在2以內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)室1～4采用PARR-6400型氧彈熱量計(jì)，實(shí)驗(yàn)室5～6采用IKA C-2000型氧彈熱量計(jì)測(cè)定GE。下圖同。

由圖2可知，從實(shí)驗(yàn)室GE測(cè)定值一致性檢驗(yàn)的曼德?tīng)杊統(tǒng)計(jì)量看，實(shí)驗(yàn)室2的測(cè)定結(jié)果偏低，而實(shí)驗(yàn)室5的測(cè)定結(jié)果偏高。實(shí)驗(yàn)室4的測(cè)定結(jié)果最接近實(shí)驗(yàn)室間的平均值。實(shí)驗(yàn)室1和3的測(cè)定結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室間的平均值相對(duì)接近。從實(shí)驗(yàn)室GE測(cè)定值一致性檢驗(yàn)的曼德?tīng)杒統(tǒng)計(jì)量看，實(shí)驗(yàn)室5和6的測(cè)定結(jié)果變異度接近，且高于實(shí)驗(yàn)室1、2、3、4。實(shí)驗(yàn)室1、2、3、4的變異度相對(duì)接近。

圖2 6個(gè)實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定飼料GE的曼德?tīng)杊和k統(tǒng)計(jì)量

由表4可知，在6個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定6個(gè)飼料原料和10個(gè)飼糧GE的多重比較中，實(shí)驗(yàn)室3和5各有12個(gè)樣品的GE測(cè)定值最高，實(shí)驗(yàn)室2有14個(gè)樣品的GE測(cè)定值最低，實(shí)驗(yàn)室1有9個(gè)樣品的GE測(cè)定值偏低。而實(shí)驗(yàn)室4和6的GE測(cè)定值最大或最低的樣品數(shù)量少于5個(gè)。GE測(cè)定值的重復(fù)性變異系數(shù)在0.09%～0.31%，實(shí)驗(yàn)室間變異系數(shù)在0.28%～0.61%，再現(xiàn)性變異系數(shù)在0.29%～0.64%。

表4 不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定樣品GE的變異

2.3 不同實(shí)驗(yàn)室間飼糧GE測(cè)定值的可加性

由表5可知，實(shí)驗(yàn)室1、3、5和6對(duì)10個(gè)飼糧GE的計(jì)算值與測(cè)定值相差分別為-0.05～0.11 MJ/kg、-0.05～0.27 MJ/kg、-0.07～0.20 MJ/kg和-0.12～0.06 MJ/kg，配對(duì)t檢驗(yàn)差異不顯著(P>0.05)。而實(shí)驗(yàn)室2和4對(duì)10個(gè)飼糧GE的計(jì)算值與測(cè)定值相差分別為-0.01～0.17 MJ/kg和0.00～0.18 MJ/kg，配對(duì)t檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。6個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定10個(gè)飼糧的GE測(cè)定值對(duì)計(jì)算值的線性回歸模型中，斜率與1均無(wú)顯著差異(P>0.05)，截距與0均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 不同實(shí)驗(yàn)室飼糧GE測(cè)定值與計(jì)算值的差異

3 討 論

3.1 上樣量對(duì)氧彈熱量計(jì)GE測(cè)定值的影響

氧彈熱量計(jì)測(cè)定飼料GE的原理是根據(jù)樣品燃燒后釋放出來(lái)的熱量被水吸收，通過(guò)測(cè)定水溫升高幅度計(jì)算樣品的GE值[2]。由于氧彈、點(diǎn)火絲等金屬材料也可以吸收熱量，因此，采用苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定其熱容量。當(dāng)上樣量較低時(shí)釋放出來(lái)的總熱量低，水溫升高幅度也低，而氧彈、點(diǎn)火絲等金屬材料吸收熱量占比相對(duì)較高，從而大大降低了測(cè)定的準(zhǔn)確性。ISO 9831—1998[2]規(guī)定上樣量以燃燒后水溫升高2～3 ℃為參考，稱樣重量取決于樣品的能值和氧彈熱量計(jì)的有效熱容量，其推薦一般樣品的上樣量為1 g。然而，在實(shí)際測(cè)定中，樣品(如食糜、體外消化殘?jiān)?的數(shù)量有時(shí)難以達(dá)到規(guī)定的重量要求，或樣品能值及密度偏低，坩堝容量不足以裝載規(guī)定重量的樣品，有些研究者采用添加助燃劑如苯甲酸[17]、礦物油等以使燃燒后溫度升幅達(dá)到儀器規(guī)定的范圍。然而，目前在測(cè)定豬、雞、鴨飼糧、糞樣或體外消化水解殘?jiān)腉E值中，鮮見(jiàn)關(guān)于上樣量的詳細(xì)描述[18]，而在實(shí)際操作中不同實(shí)驗(yàn)室間在上樣量上可能大相徑庭。本研究中無(wú)論是飼料原料還是飼糧，其上樣量在0.2～0.6 g時(shí)GE測(cè)定值均隨上樣量的增加而升高，而在0.6～1.0 g時(shí)GE測(cè)定值相對(duì)穩(wěn)定，這表明隨著上樣量的增加，水溫升幅增加，氧彈吸收的熱量占比下降，從而使樣品GE測(cè)定值趨穩(wěn)。這一現(xiàn)象與馬艷等[19]使用PARR-6300測(cè)定玉米的GE在上樣量低于0.5～0.7 g變化時(shí)測(cè)定值逐步增加并趨穩(wěn)的結(jié)論類似，與杜中原等[7]使用PARR-6400型氧彈熱量計(jì)測(cè)定玉米GE與上樣量的關(guān)系也相似。上述結(jié)果表明，在飼料樣品GE的測(cè)定中，上樣量不應(yīng)低于0.6 g。

3.2 實(shí)驗(yàn)室間氧彈熱量計(jì)測(cè)定GE值的變異及可加性

目前國(guó)內(nèi)飼料企業(yè)測(cè)定飼料GE主要采用美國(guó)PARR、德國(guó)IKA及長(zhǎng)沙奔特等不同廠家生產(chǎn)的氧彈熱量計(jì)。不同生產(chǎn)商制造的氧彈熱量計(jì)在構(gòu)造、GE的計(jì)算原理上均存在某些差異。通過(guò)苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品校正可以減少不同型號(hào)儀器間的差異。在實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定結(jié)果一致性的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)判上，通過(guò)Z比分值考察實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定的異常值[14-15]，而曼德?tīng)杊和k統(tǒng)計(jì)量分別表示實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定值的偏差程度及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的變異程度[16]。根據(jù)|Z|≤2，測(cè)定值滿意；2<|Z|<3,測(cè)定值“有問(wèn)題”；|Z|≥3，測(cè)定值“不滿意”的評(píng)判準(zhǔn)則[15]，本研究中實(shí)驗(yàn)室2有2個(gè)樣品測(cè)定值“不滿意”；實(shí)驗(yàn)室5有2個(gè)樣品GE測(cè)定值“不滿意”；實(shí)驗(yàn)室6有1個(gè)樣品GE測(cè)定值“不滿意”。這些樣品并未呈現(xiàn)特定的某1個(gè)或幾個(gè)樣品。上述實(shí)驗(yàn)室間96個(gè)數(shù)據(jù)比較中，91個(gè)數(shù)據(jù)的一致性是滿意，比例達(dá)到94.8%。曼德?tīng)杊統(tǒng)計(jì)量表明,實(shí)驗(yàn)室2和5的GE測(cè)定值偏離了實(shí)驗(yàn)室間的平均測(cè)定值。綜合Z比分值和曼德?tīng)杊統(tǒng)計(jì)量，提示實(shí)驗(yàn)室2、5、6在GE的測(cè)定上需要加強(qiáng)測(cè)定過(guò)程的控制。曼德?tīng)杒統(tǒng)計(jì)量表明，實(shí)驗(yàn)室5和6測(cè)定GE的變異相對(duì)偏高，這可能與這2家實(shí)驗(yàn)室采用的氧彈熱量計(jì)的型號(hào)不同于實(shí)驗(yàn)室1～4有關(guān)，這一現(xiàn)象與杜中原等[7]比較2種型號(hào)的氧彈熱量計(jì)測(cè)定飼料及糞樣GE的變異度存在差異的結(jié)論相似。本研究中16個(gè)樣品GE測(cè)定的重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室間及再現(xiàn)性變異系數(shù)均在0.64%以內(nèi)。這一變異程度比ISO 9831:1990[2]在剔除部分實(shí)驗(yàn)室異常測(cè)定值后7類樣品GE測(cè)定值的重復(fù)性變異系數(shù)小于2.10%的范圍??；比Bourdillon等[3-4]報(bào)道的不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定飼糧GE的變異系數(shù)小于1.79%及Pérez等[5]得出不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定飼糧GE的變異系數(shù)為1.0%都低。這表明參與本研究的6個(gè)實(shí)驗(yàn)室在測(cè)定飼料樣品GE的變異度是相對(duì)較低的。

目前在飼料配方中，飼糧的可消化養(yǎng)分的含量都是根據(jù)原料的可消化養(yǎng)分含量線性可加計(jì)算的。從方法學(xué)的角度看，可加性是方法成立的基本原則[20-21]。在檢驗(yàn)?zāi)骋粶y(cè)定方法是否具有可加性的手段上，通常采用以下2種統(tǒng)計(jì)方法：1)t檢驗(yàn)比較混合樣品的實(shí)測(cè)值與根據(jù)混合樣品各成分的實(shí)測(cè)值及組成比例獲得的計(jì)算值是否相等[22-23]；2)根據(jù)混合樣品的測(cè)定值對(duì)計(jì)算值的線性關(guān)系是否與Y=X重疊[24]。本研究中6個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)10個(gè)飼糧的GE測(cè)定值對(duì)計(jì)算值的回歸與Y=X均重疊，4個(gè)實(shí)驗(yàn)室配對(duì)t檢驗(yàn)得出GE測(cè)定值與計(jì)算值無(wú)顯著性差異，但2個(gè)實(shí)驗(yàn)室(2和4)GE測(cè)定值顯著低于計(jì)算值。這表明大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼料間GE的可加性是非常滿意的。

4 結(jié) 論

氧彈熱量計(jì)測(cè)定GE的上樣量應(yīng)在0.6 g以上。6個(gè)實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定飼料GE值呈現(xiàn)較好一致性(94.8%的滿意度)，且變異較低(重復(fù)性、再現(xiàn)性及實(shí)驗(yàn)室間的變異系數(shù)≤0.64%)。4個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定飼料GE的可加性高，2個(gè)實(shí)驗(yàn)室的可加性稍低。