澤瀉葉三萜的制備及其對磺胺間甲氧嘧啶鈉在大鼠體內代謝的影響

王榆鑫，陶夢婷，張 淇，趙宇哲，蘭 坤，陶 超，李麗霞

（四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130）

澤瀉為澤瀉科植物東方澤瀉Alisma orientate(Sam.)Juzep.或澤瀉Alisma plantago-aquatica Linn.的干燥塊莖[1]，具有利水滲濕、化濁降脂等功效，用于小便不利、水腫脹滿等病癥[2]。澤瀉的活性成分主要是三萜類成分[3]，具有降血脂[4]、抗動脈粥樣硬化[5]、利尿[6]等藥理活性。澤瀉以塊莖入藥，澤瀉葉作為生產廢料，處理費工，污染環(huán)境，且增大澤瀉種植的連作障礙。課題組前期研究結果表明，澤瀉葉和澤瀉塊莖具有非常相似的三萜類成分。

磺胺類藥物是一類廣譜抑菌藥物，性質穩(wěn)定、價格低廉，作為獸藥廣泛用于家畜養(yǎng)殖中。這些藥物進入動物體內后，可殘留在肉、蛋等動物性食品中，并會在食用者體內蓄積，影響其健康[7]?；前烽g甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）屬于長效磺胺類藥物，其在磺胺類藥物中對動物細菌性感染和抗球蟲的預防和治療作用最強，但其在動物體內清除時間較長，休藥期長達28天。如果未清除完全，會隨著畜牧肉類進入人體，蓄積到一定程度會破壞人的正常免疫機能、造血系統、腦神經系統和消化系統，且會導致微生物產生抗性基因，對生物體的生育能力和甲狀腺造成影響[8]。

本試驗基于前期研究基礎和澤瀉葉的組織結構特點，采用復合酶酶解法從澤瀉葉中提取總三萜類成分，并通過測定血藥濃度，研究其對磺胺間甲氧嘧啶鈉在大鼠體內代謝的影響，以期為尋找一種天然的、能有效縮短抗生素休藥期的天然藥物奠定基礎，為澤瀉葉的綜合開發(fā)利用提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SPF級雄性SD大鼠30只，體質量（200±20）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證號SCXK（川）2020-030。

1.2 藥材與試劑

澤瀉葉（采自四川省眉山市灃碩中藥材合作社，經李麗霞老師鑒定為澤瀉Alisma plantagoaquatica Linn），陰干后剪碎備用。10萬U/g木瓜蛋白酶（南寧龐博生物工程有限公司）；5 000 U/mL中性纖維素酶（滄州夏盛酶生物技術有限公司）；磺胺間甲氧嘧啶鈉標準品（含量≥99%，四川拜耳動物保健有限公司）；高氯酸（成都金山化學試劑有限公司）；生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）；無水乙醇、香草醛、乙酸乙酯、冰醋酸、氨水、正己烷和鹽酸等為分析純，甲醇、乙腈和磷酸等為色譜純(成都市科隆化學品有限公司)。

1.3 儀器設備

ZDHW型電熱套、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；RE-2000E型旋轉蒸發(fā)儀（鄭州科泰實驗設備有限公司）；DHG-2080B型電熱恒溫鼓風干燥箱（鄭州生元儀器有限公司）；ST16R型大容量高速臺式冷凍離心機、多功能熒光化學發(fā)光免疫儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；JHD-003型水浴氮吹儀（上海極恒實業(yè)有限公司）；1260 InfinityⅡ型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）。

1.4 復合酶酶解工藝優(yōu)化指標的測定方法

1.4.1 粗三萜得率的計算

粗三萜得率（%）=（粗三萜質量/澤瀉葉質量）×100%

1.4.2 總三萜含量測定

1.4.2.1 標準曲線的建立

參照石峰等[9]的方法并稍作修改。精密稱取23-乙酰澤瀉醇B對照品1.26 mg，于25 mL容量瓶中，加適量乙醇溶解，搖勻，定容，得到質量濃度為0.050 4 mg/mL的23-乙酰澤瀉醇B對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL于10 mL的試管中，在60℃水中將溶劑揮干，揮干后于試管中加入0.2 mL的5%香草醛冰乙酸溶液、0.8 mL高氯酸，60℃水浴15 min，冷卻5 min，加冰醋酸5.0 mL，搖勻，于555 nm波長處測定。以23-乙酰澤瀉醇B含量為橫坐標，縱坐標為吸光度繪制標準曲線，得到線性回歸方程為Y=8.523X-0.038 5（R2=0.999 6）。

1.4.2.2 樣品總三萜含量的測定

取所得的澤瀉葉粗三萜0.01 g置于10 mL的容量瓶中，用85%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密移取供試品溶液0.2 mL，后續(xù)操作按1.4.2.1項下的方法進行，隨行乙醇空白，在555 nm處測定吸光度，根據線性回歸方程計算總三萜的含量。

總三萜含量（%）=（三萜質量/粗三萜質量）×100%

1.4.3 總三萜提取率的計算

總三萜提取率（%）=（粗三萜得率×總三萜含量）×100%

1.5 單因素試驗

1.5.1 復合酶比例的篩選

稱取5 g澤瀉葉，固定料液比為1∶20，分別加入纖維素酶與木瓜蛋白酶比例為（1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2）的復合酶1.2%，自然pH，酶解90 min。升溫至100℃滅酶。棄去酶解液，向圓底燒瓶中加入料液比為1∶20的85%乙醇，在100℃下，冷凝回流浸提2 h，提取2次，合并提取液，得澤瀉葉總三萜。以澤瀉葉總三萜提取率為指標，優(yōu)選最佳復合酶比例。試驗平行3次，結果取平均值。

1.5.2 復合酶酶解的單因素篩選

按照1.5.1項下的酶解方法，控制纖維素酶與木瓜蛋白酶比例為1∶2，分別以酶解時間（30、60、90、120、150 min）、酶用量（0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）和酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）為自變量進行試驗，以澤瀉葉總三萜提取率為指標，優(yōu)選最佳工藝參數。每組試驗重復3次，結果取平均值。

1.6 響應面法優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，以澤瀉葉總三萜提取率作為響應值，選取影響較顯著的3個因素：料液比、酶解溫度和酶解時間作為考察因素，設計3因素3水平響應面優(yōu)化試驗進行分析。響應面分析因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken響應面實驗因素水平表Table 1 Box-Behnken test factors and the level of design

1.7 澤瀉葉總三萜提取物的精制

取澤瀉葉粗三萜提取物，按質量比1∶5加蒸餾水溶解。用等體積乙酸乙酯萃取5次，將所得萃取液濃縮烘干，即得精制三萜。按1.4.2.2項下的方法測定精制三萜中三萜的濃度。

1.8 澤瀉葉總三萜提取物對磺胺間甲氧嘧啶鈉在大鼠體內代謝的影響

1.8.1 動物分組及給藥

將30只雄性SD大鼠隨機分為5組，每組6只，分別標記為空白組、模型組、總三萜高（1.6 g/kg）、中（0.8 g/kg）和低（0.4 g/kg）劑量給藥組。適應性喂養(yǎng)7 d開始進行正式試驗。給藥組每天上午10:00灌胃給藥一次，灌胃體積為1 mL/100 g，模型組和空白組灌予相同體積的生理鹽水。給藥三天后，禁食12小時，自由飲水，除空白組外，其余各組按100 mg/kg劑量灌胃給予磺胺間甲氧嘧啶鈉，灌胃體積為1mL/100g，空白組給予相應體積生理鹽水，在灌胃后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、24、48、72、96、120、144、168 h通過眼眶靜脈采血，各血樣在4℃，3 500 r/min離心10 min，分離血漿，于-20℃保存待測。

1.8.2 固相萃取-高效液相色譜法測定血漿中SMM-Na含量

1.8.2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3液相色譜柱（4.6×250 nm，5μm）；流動相：0.02 mol/L磷酸∶乙腈（80∶20），三乙胺調節(jié)pH至3.5；檢測波長：230 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃。

1.8.2.2 標準曲線的建立

參照羅園[10]已建立的方法進行試驗。用流動相配制SMM-Na溶液，取配好的SMM-Na溶液100μL加入到400μL空白血漿中，使得血漿中SMM-Na質量濃度分別為100.0、50.0、25.0、5.0、2.5和1.0 μg/mL，另吸取雙蒸水100μL于400μL空白血漿中，作空白組對照。按照1.8.2.3項下血漿樣品的預處理方法處理后采用HPLC法進行檢測。以血漿藥物濃度C為橫坐標，藥物峰面積A為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為A=42.205C-19.362（R2=0.999 7）。

1.8.2.3 待測樣品的制備

取血漿樣品0.5 mL，加入乙腈1 mL，渦旋混勻2 min，5 000 r/min，離心5 min，取上清液至離心管中。殘渣再加入乙腈1 mL重復以上操作，合并兩次上清液并用氮氣吹干，向離心管加入0.1 mol/L HCl 2 mL和正己烷1 mL，超聲清洗，洗液轉入10 mL離心管中，再向離心管中加入同體積的HCl和正己烷，超聲清洗，合并兩次清洗液，渦旋混勻后于離心機中離心5 min，轉速為5 000 r/min，棄上層正己烷層，再加正己烷1 mL，渦旋混勻2 min，再棄掉正己烷，留下層為備用液。

取MCX固相萃取柱依次用甲醇2 mL和0.1 mol/L HCl 2 mL活化，取備用液過柱，控制流速1 mL/min。依次用0.1 mol/L HCI溶液1 mL和50%甲醇乙腈液2 mL淋洗，用洗脫液（5%氨水乙腈）4 mL洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干后加流動相（磷酸∶乙腈=80∶20）0.5 mL超聲溶解，用0.45μm微孔濾膜過濾，按1.8.2.1項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，計算峰面積，代入標準曲線方程中，計算藥物濃度。

1.9 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 復合酶比例對澤瀉葉總三萜提取率的影響

由圖1可知，當纖維素酶與木瓜蛋白酶比例為1∶2時，澤瀉葉總三萜提取率最大為0.31%，因此，復合酶的最佳比例為纖維素酶∶木瓜蛋白酶=1∶2。

圖1 復合酶比例的篩選Figure 1 Screening of mixed enzyme ratio(±s,n=3)

2.1.2 酶解時間對澤瀉葉總三萜提取率的影響

由圖2A可知，澤瀉葉總三萜提取率隨著酶解時間的升高先增大后減小。從30 min至90 min，提取率從0.23%到0.30%，增幅為30.43%。隨著提取時間的增加，提取率反而降低?？赡苁请S著酶解時間的增長，酶解作用充分發(fā)揮，使得提取率增大，但時間過長，酶的催化活性降低導致提取率降低。因此，復合酶的最佳酶解時間為90 min。

2.1.3 酶用量對澤瀉葉總三萜提取率的影響

由圖2B可知，澤瀉葉總三萜提取率隨著復合酶用量的升高先增大后減小。復合酶用量從0.80%至1.20%，得到的提取率從0.28%增加到0.31%，增幅為10.71%。隨著酶添加量的增加，提取率反而降低。這是由于在一定酶解條件下，酶濃度不足時，酶濃度越大裂解細胞壁的效率越高，當酶濃度到飽和后，再增加酶濃度對結果的影響就變弱了。因此，復合酶的最佳酶用量為1.20%。

2.1.4 料液比對澤瀉葉總三萜提取率的影響

由圖2C可知，澤瀉葉總三萜提取率隨著料液比的增加先增大后減小。料液比從1∶10至1∶20時，得到的提取率從0.18%增加至0.32%，增幅為77.78%。隨著料液比的增加，提取率稍微降低?？赡苁请S著溶劑增多，擴大了反應體系中澤瀉葉與復合酶的接觸面積，總三萜提取率增加。但隨著料液比繼續(xù)增加，酶濃度降低，導致酶與底物結合不充分，使提取率降低。因此，最佳料液比為1∶20。

圖2 酶解時間(A)、酶用量(B)、料液比(C)、酶解溫度(D)對總三萜提取率的影響Figure 2 Effects of enzymolysis time(A),enzyme dosage(B),material-liquid ratio(C),enzymolysis temperature(D)on total triterpenes yield(±s,n=3)

2.1.5 酶解溫度對澤瀉葉總三萜提取率的影響

由圖2D可知，澤瀉葉總三萜提取率隨著酶解溫度的升高先增大后減小。溫度從30℃至50℃，得到的提取率從0.24%增加到0.41%，增幅為70.83%。隨著溫度的升高，酶活性降低，總三萜提取率逐漸降低。可能是復合酶在50℃時活性最強，分解細胞壁效果最佳。當溫度進一步升高時，酶蛋白開始受熱變性，使得酶活性逐漸降低，導致總三萜提取率下降。因此，復合酶最佳酶解溫度為50℃。

以提取率的增幅為指標，由以上4個單因素的實驗結果可知影響總三萜提取率高低的順序為：料液比、酶解溫度、酶解時間、酶用量。

2.2 響應面優(yōu)化

2.2.1 響應面分析方案及結果

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計三因素三水平的響應面分析試驗，以總三萜提取率為響應值，試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface test

2.2.2 回歸模型建立及方差分析

應用Design-Expert 10.0.7軟件進行分析，得到多元二次回歸模擬方程為Y=0.408+0.045A+0.003 7B-0.0187 5C-0.017 5AB-0.017 5AC-0.02BC-0.031 5A2-0.044B2-0.009C2，方差分析見表3?；貧w模型（P<0.01）極顯著，相關系數明該模型R2=0.907 6，失擬項P=0.454 5（P>0.05），表明失擬項相對于絕對誤差不顯著，因此，該模型對試驗的擬合程度良好，能較好的反映各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該模型對實驗參數進行分析。由F值的大小可判斷，在所選擇的試驗范圍內，3個因素對澤瀉葉總三萜提取率影響的順序為料液比（A）>酶解時間（C）>酶解溫度（B）。此外，一次項A顯著，B、C不顯著；二次項B2極顯著，A2顯著、C2不顯著。交互項AB、AC和BC均不顯著。響應面分析見圖3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 驗證試驗

采用Design-Expert 10.0.7軟件回歸分析，得出當酶解料液比為1∶23.225，酶解溫度為51.75℃以及酶解時間為70.77 min時，澤瀉葉總三萜提取率達到最大，為0.45%。結合生產實際，將響應面法計算所得最優(yōu)工藝修訂為：料液比為1∶25，酶解溫度50℃、酶解時間為70 min。重復實驗3次，測得最終總三萜平均提取率為0.44%，與預測值（0.45%）接近，RSD值為0.36%，表明工藝穩(wěn)定可行，能滿足實驗以及實際生產要求。

2.3 澤瀉葉總三萜提取物的精制

結果表明，精制三萜中三萜含量為28.95%，比粗三萜中三萜含量6.08%有一定的提高，為后續(xù)實驗提供物質基礎。

2.4 澤瀉葉總三萜提取物對磺胺間甲氧嘧啶鈉在大鼠體內代謝的影響

色譜圖結果見圖5。根據回歸方程計算血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線（圖4）。由圖4可知，模型組血藥濃度峰值出現在3.5 h，而給藥組血藥濃度峰值提前至2 h，血藥濃度峰值和給藥劑量呈負相關，模型組和給藥組血藥濃度的峰值均有顯著性差異（P<0.05）。模型組磺胺間甲氧嘧啶鈉的清除時間需要144 h，高、中和低劑量組磺胺間甲氧嘧啶鈉清除時間分別為72、96和120 h，表明給藥組磺胺間甲氧嘧啶鈉的清除速率顯著快于模型組，且藥物清除速率的順序為高劑量組>中劑量組>低劑量組，呈現一定的劑量依賴性。

圖4 血漿藥-時曲線圖Figure 4 Plasma concentration-time curves

圖5 HPLC色譜圖Figure 5 HPLC chromatogram

3 討論

酶輔助提取技術通過分解細胞壁及細胞間質中的纖維素、半纖維素等成分使有效成分溶出，在提高中藥有效成分提取效率中發(fā)揮重要作用[11]。酶解有單酶法和復合酶法，常用酶有木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，纖維素酶等。目前暫無酶解輔助提取澤瀉和澤瀉葉中總三萜的研究，但已有文獻對澤瀉塊莖總三萜的提取工藝進行了報道。鄧迎娜[12]、宋麗[13]和石峰[9]都用超聲提取法提取澤瀉總三萜，所得提取率分別為1.93%、2.63%和2.98%；易醒[14]用微波預處理澤瀉后加熱回流提取總三萜，所得提取率為1.78%；羅奮熔[15]采用傳統直接加熱回流法提取澤瀉總三萜，所得提取率為0.14%。澤瀉葉含有很多韌性較強的纖維，會大大影響提取效率，本實驗前期研究發(fā)現木瓜蛋白酶和纖維素酶可較好提高澤瀉葉三萜的提取率，木瓜蛋白酶作用于蛋白，纖維素酶作用于細胞壁，故采用復合酶輔助提取澤瀉葉總三萜。實驗結果證明，復合酶酶解后澤瀉葉總三萜提取率顯著提高，為0.44%。

目前已有研究表明中藥提取物具有加速抗生素代謝的作用，如楊銳等[16]發(fā)現甘草提取物能加快氟苯尼考在雞體內的吸收和消除速度，王培等[17]研究發(fā)現黃芩和五倍子提取物都可以促進恩諾沙星及其次級代謝產物環(huán)丙沙星的代謝和消除速率。澤瀉有良好的利尿作用，研究表明澤瀉乙酸乙酯部位是澤瀉利尿的主要部位，并發(fā)現三萜類化合物主要集中于乙酸乙酯部位[18]?；诖?，我們推測澤瀉葉總三萜提取物能加速抗生素在動物體內的代謝和清除。獸用抗生素殘留嚴重危害人體健康和環(huán)境安全，磺胺類藥物（SAs）是獸醫(yī)臨床上常用的廣譜抗生素，在動物體內清除速度慢、休藥期長，常出現殘留問題，如磺胺甲惡唑在大西洋庸鰈肌肉和肝臟中的清除時間分別為432 h、624 h[19]，甲氧芐啶在蛋黃中的殘留清除時間長達37 d[20]。調查發(fā)現，75%肉類樣品中SAs的總濃度超過100μg/kg，在雞肉和豬肉中的最大殘留量高達2 700和3 600μg/kg[21]。本實驗結果顯示，澤瀉葉總三萜提取物高劑量組能提前72 h清除大鼠體內的磺胺間甲氧嘧啶鈉，占整個清除周期的1/2，表明其能有效地加速磺胺間甲氧嘧啶鈉在大鼠體內的代謝，縮短大鼠體內磺胺間甲氧嘧啶鈉的代謝周期，并降低殘留，為獸醫(yī)臨床合理用藥提供了理論依據。

基于本實驗結果，澤瀉葉總三萜提取物會對抗生素血藥濃度峰值造成影響，使峰值前移，所以在實際應用中，擬在使用了抗生素，并過了抗生素半衰期后再以口服給藥的方式應用澤瀉葉總三萜提取物，這樣可以在不影響抗生素的使用效果的前提下，起到減少抗生素殘留，縮短抗生素休藥期的作用。本實驗僅考慮了總三萜提取物對動物體內抗生素血藥濃度的影響，未涉及組織臟器的殘留，但在后續(xù)的本體動物臨床實驗中，會充分考慮對組織臟器，特別是會作為食品的組織臟器的影響。

4 結論

本研究所得的酶解工藝穩(wěn)定可行，具有推廣應用價值。同時為獸醫(yī)臨床提供了一種能有效縮短抗生素休藥期和減少抗生素殘留的天然藥物，為澤瀉葉的綜合開發(fā)利用奠定了基礎。