苯扎氯銨、癸甲溴銨煙霧消毒對大鼠呼吸道刺激性及安全性初步評價

李楠鑫，陳 洋，陳詩奇，張繼甫，彭一丁，鐘佳男，張 偉，符華林*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸藥創(chuàng)新制劑工程技術(shù)研究中心，成都 611130；2.成都科宏達(dá)科技有限公司，四川 新津 611400）

近年來，消毒已成為預(yù)防各種畜禽傳染病的重要措施，也是當(dāng)前維護(hù)公共環(huán)境安全的重要方法。對畜禽場舍進(jìn)行霧化消毒可以同時兼顧抗菌消毒及維護(hù)動物機(jī)體健康的雙重目標(biāo)，是規(guī)模養(yǎng)殖中常用的消毒方法之一[1]。煙霧機(jī)是利用燃燒產(chǎn)生的高溫氣體的熱能和高速氣體的動能，使消毒液受熱而迅速煙化揮發(fā)呈煙霧狀，霧滴粒徑在10μm以內(nèi)[2]，相對普通霧化消毒，煙霧消毒液霧滴更小，消毒效果更為徹底。煙霧消毒以消毒劑和煙霧助劑為藥液，通過發(fā)煙機(jī)進(jìn)行發(fā)煙，煙霧在空氣中可長時間懸浮，可有效殺滅空氣中浮游的有害病菌，切斷病原菌傳播途徑。煙霧消毒已廣泛應(yīng)用于城市環(huán)衛(wèi)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)、垃圾污水處理場、大面積疾控防疫及公共場所消毒滅菌等領(lǐng)域[3]。但是消毒劑使用時是否會因煙霧化而對動物或者人體產(chǎn)生毒性影響也值得養(yǎng)殖場關(guān)注。

苯扎氯銨及癸甲溴銨是兩種常見的陽離子表面活性劑，可以有效殺滅大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等養(yǎng)殖場常見細(xì)菌[4-6]。苯扎氯銨消毒劑屬于低效消毒劑，被廣泛應(yīng)用于復(fù)方消毒劑、健康護(hù)理液（滴眼液、滴鼻液等）及化妝品中[7]。癸甲溴銨廣泛應(yīng)用于各種養(yǎng)殖場、寵物診所的舍內(nèi)環(huán)境、飲水、各種設(shè)備及器具、車輛及工作人員的消毒。目前暫無將苯扎氯銨及癸甲溴銨用于煙霧消毒的報道，為了科學(xué)評價煙霧消毒可能帶來的對動物安全性的影響，本試驗通過考察苯扎氯銨及癸甲溴銨煙霧消毒對試驗大鼠呼吸道及全身安全性的影響，為苯扎氯銨及癸甲溴銨用于煙霧消毒提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

苯扎氯銨溶液、癸甲溴銨溶液、煙霧助劑（成都科宏達(dá)科技有限公司），生理鹽水，水合氯醛及4%多聚甲醛（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

BCA蛋白定量試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、白蛋白（ALB）測定試劑盒、肌酐（Cr）測定試劑盒、尿素氮（BUN）測試盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶/ALT/GPT）測試盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷草轉(zhuǎn)氨酶/AST/GOT）測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗儀器

煙霧消毒機(jī)（成都科宏達(dá)科技有限公司），SZM-45B1顯微鏡（舜宇光學(xué)科技有限公司），TGL-16G離心機(jī)（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）、FC酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技），RM2235石蠟切片機(jī)（德國Leica），DM1000徠卡顯微成像系統(tǒng)（德國Leica）。

1.3 實驗動物

6～7周齡健康SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體重180～220 g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司。實驗動物飼養(yǎng)遵循《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南》(Council,2010)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度（60±10）%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)（每天5～8 g/100 g體重）并自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組

將40只大鼠于試驗前分別稱重并記錄，然后隨機(jī)分成4組，每組10只，具體分組設(shè)置見表1。

表1 試驗分組Table 1 Experimental grouping

1.4.2 動物處理

在1 000 L可密閉透明有機(jī)玻璃柜，放入試驗大鼠10只。啟動煙霧機(jī)按照表1分組對相應(yīng)藥液進(jìn)行發(fā)煙，待發(fā)煙機(jī)工作穩(wěn)定，向密閉有機(jī)玻璃柜噴煙2 min相應(yīng)藥液，并保持霧化狀態(tài)30 min。隨后打開玻璃柜通風(fēng)并移出大鼠于常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境；各組每天按照前述煙霧化方式處理1次，連續(xù)進(jìn)行14 d。試驗期間，試驗鼠可以自由采食、飲水。

1.4.3 試驗觀察

每天觀察記錄各組試驗鼠的死亡情況、采食情況、飲水情況和每次通過噴煙前后試驗鼠的形態(tài)及行為變化。描述并記錄試驗鼠的精神情況、毛色情況、二便情況、眼部情況、鼻口分泌物情況和其他行為狀況，測定記錄試驗鼠呼吸頻率。

1.4.4 生理生化指標(biāo)測定

當(dāng)試驗進(jìn)行至第14天時，稱量各組體重，禁食16 h，分別通過眼眶后叢靜脈與心臟采1.5 mL抗凝血與5 mL不抗凝血?？鼓糜跍y定血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞壓積（HCT），紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、血小板（PLT）計數(shù)與白細(xì)胞分類；非抗凝血分離血清用于測定總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），具體操作按試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4.5 肺洗滌液指標(biāo)測定

采血結(jié)束后，脫頸椎處死大鼠，打開胸腔結(jié)扎左側(cè)肺門。分離出頸部氣管，在氣管下端開小口，將粗針頭插入氣管并用細(xì)線扎緊，緩慢注入2.5 mL 0.9%氯化鈉溶液，可見試驗鼠右肺逐漸膨大，變白，停留10 s后，將灌洗液緩慢抽回，記錄抽回體積，再重復(fù)一次以上操作，合并兩次的灌洗液，置于5 mL EP管中。將灌洗液在4℃離心（1 500 r/min）15 min，測定上清液中蛋白含量及乳酸脫氫酶活性，具體操作按試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4.6 病理切片及觀察

試驗大鼠解剖并稱量肝、腎、心、肺（包括進(jìn)行肺部灌洗后的右肺）、睪丸（卵巢）濕重，計算臟/腦比值，采集腦、心、肺（只取未進(jìn)行肺部灌洗的左肺）、肝、腎、睪丸（卵巢）制作病理切片，檢查有無病理改變。檢測方法步驟如下：

包埋：4%多聚甲醛固定的組織樣本，經(jīng)流水沖洗30 min，進(jìn)行組織修塊，放入病理包埋塑料筐中進(jìn)行脫水（75%乙醇6 h，85%乙醇10 h，95%乙醇4 h，無水乙醇Ⅰ2 h，無水乙醇Ⅱ2 h），透明（二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ15 min），浸蠟3 h，最后包埋組織塊于石蠟中。

切片：采用Leica RM2235切片機(jī)將組織切成5μm厚的薄片，在溫水中將組織展平后撈在載玻片上，60℃烘烤切片至少2 h。

染色：切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，流水洗滌20 min，用蘇木素染色8 min，流水洗滌5 min，鹽酸酒精分化，伊紅染色3 min，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明后用樹脂膠封片。

顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化，對正常組織或有明顯病變部位均采用顯微成像系統(tǒng)拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠行為觀察結(jié)果

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后精神狀況良好，行為活躍。試驗前后大鼠二便正常，鼠籠墊料基本保持正常干燥。試驗前后眼部基本無變化，無明顯分泌物。試驗第2天，癸甲溴銨組大鼠煙霧消毒后開始出現(xiàn)鼻黏膜輕度出血；第3～4天，除去離子水組外，其余組都開始出現(xiàn)鼻黏膜輕度出血，嚴(yán)重程度由高到低依次為Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ，各組大鼠鼻黏膜輕度出血后2 h內(nèi)基本恢復(fù)正常。

2.2 大鼠體重增長、飲水量及臟器指數(shù)變化

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后體重增長、日均飲水量如圖1、2所示。各臟器指數(shù)變化結(jié)果如圖3所示。各試驗組大鼠與空白組相比14 d內(nèi)體重增長及飲水量變化無顯著性差異（P>0.05）。各試驗組大鼠的臟/腦比與空白組相比均無顯著性差異（P>0.05）。表明苯扎氯銨和癸甲溴銨經(jīng)煙霧消毒后對動物生長性能沒有影響。

圖1 大鼠14 d體重增長變化Figure 1 Ponderal growth of rats for 14 days

圖2 大鼠14 d日均飲水量Figure 2 Daily water intake of rats for 14 days

圖3 各試驗組大鼠的臟/腦比Figure 3 Dirty/brain ratio of rats in each experimental group

2.3 血液生化指標(biāo)結(jié)果

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后測得的血液生化指標(biāo)結(jié)果如圖4所示，各試驗組大鼠與空白組相比，血清總蛋白含量、白蛋白含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量、肌酐含量、尿素氮含量均無顯著性差異（P>0.05）。表明苯扎氯銨及癸甲溴銨煙霧消毒對動物生化指標(biāo)沒有顯著影響。

圖4 各組大鼠血液生化結(jié)果Figure 4 Blood biochemical results of rats in each group

2.4 血常規(guī)指標(biāo)測定結(jié)果

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后測得的血常規(guī)指標(biāo)具體結(jié)果如圖5所示，各試驗組大鼠與空白組相比，血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞數(shù)目、白蛋白數(shù)目、血小板數(shù)目、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比都不具有顯著性差異（P>0.05）。

圖5 各組大鼠血常規(guī)指標(biāo)結(jié)果Figure 5 Results of blood routine indexes of rats in each group

2.5 肺洗滌液指標(biāo)測定結(jié)果

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后測得肺洗滌液中蛋白質(zhì)、LDH的測定結(jié)果如圖6所示，與空白組相比，各組大鼠的肺洗滌液中總蛋白濃度和LDH值沒有顯著差異（P>0.05）。說明苯扎氯銨及癸甲溴銨經(jīng)煙霧化后對動物呼吸道黏膜沒有明顯影響。

圖6 肺洗滌液指標(biāo)結(jié)果Figure 6 Index results of pulmonary washing fluid

2.6 病理切片結(jié)果

各組大鼠經(jīng)煙霧消毒后各臟器切片見圖7。心：各組心臟組織結(jié)構(gòu)均未見異常，各心室壁及室間隔壁結(jié)構(gòu)無明顯病變，心肌胞漿紅染，排列規(guī)律，胞核呈泡狀或卵圓形，均無明顯病理變化。肝：各組肝臟組織結(jié)構(gòu)均未見異常，肝小葉明顯，肝索清晰，肝竇內(nèi)含少量紅細(xì)胞。僅癸甲溴銨組部分肝臟見輕度空泡變性（2/6）（圖8），這可能跟各組大鼠個體差異有關(guān)，其余組別肝臟細(xì)胞均無明顯病理變化。脾：各組脾臟組織結(jié)構(gòu)未見異常，白髓區(qū)可見明顯淋巴小結(jié)和動脈周圍淋巴鞘，淋巴細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量未見明顯異常；紅髓區(qū)脾索和脾竇形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，脾竇中紅細(xì)胞豐富，淋巴細(xì)胞無明顯病理變化。肺：各組肺組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常，各級支氣管未見明顯異常。肺泡腔因灌注壓力不均輕微擴(kuò)張不均，肺泡壁血管及細(xì)胞成分均無明顯病理變化。腎：皮質(zhì)區(qū)腎小球數(shù)量及形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常，皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)腎小管管腔結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞完整，刷狀緣明顯，未見明顯病理變化?？傮w表明苯扎氯銨及癸甲溴銨煙霧消毒對大鼠臟器未有顯著影響。

圖7 大鼠臟器切片圖Figure 7 Section of rat viscera

圖8 癸甲溴銨組肝臟輕度空泡變性Figure 8 Mild hepatic vacuolar degeneration in deciquam solution group

3 討論

3.1 煙霧消毒對大鼠行為的影響

煙霧消毒后各組大鼠行為基本無異常，除去離子水組外，其余組大鼠噴煙第3～4天后表現(xiàn)出輕微鼻腔出血癥狀，但2 h內(nèi)基本恢復(fù)，說明煙霧消毒劑或煙霧助劑對大鼠鼻腔黏膜有輕微刺激性。

3.2 煙霧消毒對大鼠體重增長、飲水量及臟器指數(shù)的影響

動物的體重主要與發(fā)育和營養(yǎng)關(guān)系較大，生長過程中主要受營養(yǎng)條件及吸收功能所影響。在長期毒性試驗時，藥物可能是影響營養(yǎng)吸收的重要因素，從而導(dǎo)致其體重增加出現(xiàn)變化。傳統(tǒng)的以臟器重量/體重來表示的臟器指數(shù)會有較大的波動，而腦重的變化受動物整體發(fā)育影響大，藥物影響作用相對較小個別藥物除外，所以臟腦比系數(shù)的波動主要反映臟器本身的變化，腦的因素其次。這樣計算的臟腦比系數(shù)就可以直接反映出該臟器的相對重量變化。其結(jié)果比臟體比系數(shù)更能可靠和準(zhǔn)確地表現(xiàn)出進(jìn)行這項統(tǒng)計學(xué)檢驗的目的[8]。故本次試驗臟器指數(shù)以臟腦比系數(shù)為評價指標(biāo)。各試驗組大鼠與空白組大鼠體重增長及臟器指數(shù)并無顯著性差異（P>0.05），說明苯扎氯銨及癸甲溴銨煙霧消毒并不影響大鼠生長發(fā)育。

3.3 煙霧消毒對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)是指血液中的一些酶和蛋白質(zhì)，這些小分子酶和蛋白質(zhì)在代謝、免疫調(diào)節(jié)、能量傳遞及生長發(fā)育等方面發(fā)揮著十分重要的作用[9]。各試驗組大鼠與空白組相比，血清總蛋白含量、白蛋白含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶含量均無顯著性差異（P>0.05），說明苯扎氯銨、癸甲溴銨或煙霧助劑對大鼠的肝臟無實質(zhì)性損傷；各試驗組大鼠與空白組相比，肌酐含量無顯著性差異（P>0.05），說明苯扎氯銨、癸甲溴銨或煙霧助劑對大鼠的腎小球濾過功能無影響；各試驗組與空白組相比，血清中尿素氮含量無顯著性差異（P>0.05），說明苯扎氯銨、癸甲溴銨或煙霧助劑對大鼠的肝、腎臟功能無影響。

3.4 煙霧消毒對大鼠血常規(guī)指標(biāo)測定的影響

血常規(guī)主要對血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板3種細(xì)胞有形成分進(jìn)行測定和分析[10]。各試驗組大鼠與空白組相比，血常規(guī)指標(biāo)測定結(jié)果都不具有顯著性差異（P>0.05），說明苯扎氯銨、癸甲溴銨或煙霧助劑對大鼠正常的新陳代謝無影響，不會引起炎癥反應(yīng)[11]，對大鼠的免疫系統(tǒng)及非特異性細(xì)胞免疫功能無影響。

3.5 煙霧消毒對大鼠肺洗滌液指標(biāo)測定的影響

肺洗滌液中蛋白質(zhì)濃度的高低、LDH活性的大小主要與肺部作用機(jī)制和霧滴大小有關(guān)。一定大小的霧滴進(jìn)入肺泡腔后，會被巨噬細(xì)胞吞噬，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)和趨化因子，使肺泡、毛細(xì)血管屏障的通透性增加，血漿蛋白溢出，導(dǎo)致肺泡灌洗液中蛋白含量增高[12]。乳酸脫氫酶（LDH）是一種糖酵解酶,存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞膜受損或通透性增加時可漏至細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞外液中LDH的活性增加[13]。LDH活性的高低能反映膜損傷程度[14]。與空白組相比，各組大鼠的肺洗滌液中總蛋白濃度和LDH值沒有顯著差異（P>0.05），說明苯扎氯銨、癸甲溴銨和煙霧助劑在試驗周期內(nèi)未造成大鼠肺損傷。

4 結(jié)論

苯扎氯銨及癸甲溴銨煙霧消毒對大鼠生長性能、生理生化及呼氣道黏膜分泌并無影響，僅對鼻腔黏膜會產(chǎn)生輕微刺激性，但可很快恢復(fù)。苯扎氯銨及癸甲溴銨用于煙霧消毒對大鼠呼吸系統(tǒng)的毒力強(qiáng)度及刺激性強(qiáng)度并不強(qiáng)，苯扎氯銨煙霧消毒安全性更佳，但仍需進(jìn)一步研究及改善。