鎮(zhèn)心安神方對(duì)辣椒素誘導(dǎo)的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瞬時(shí)受體電位通道蛋白及自噬蛋白表達(dá)的影響

盧亮，劉勇，東淳，李陽(yáng)梅，馮霞，陳若曦，趙一丁

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng)712046；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003

瘙癢是一種可引發(fā)搔抓意愿和搔抓反射的特異性皮膚感覺，可由多種皮膚疾病和系統(tǒng)性疾病引起[1]，其中超過6周的瘙癢稱為慢性瘙癢。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)癢覺的研究雖確定了相關(guān)受體和信號(hào)通路，但對(duì)癢覺信號(hào)的產(chǎn)生、傳導(dǎo)及調(diào)控的機(jī)制仍不清晰。有研究顯示，皮膚病患者瘙癢患病率為54.4%[2]。其發(fā)病機(jī)制不清，治療手段有限，長(zhǎng)期慢性瘙癢嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至造成焦慮、抑郁、失眠等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3]。

中醫(yī)治療慢性瘙癢具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。既往研究表明，中藥內(nèi)服、外用及非藥物療法可通過抑制神經(jīng)活性物質(zhì)釋放，調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)通路及相關(guān)受體活性改善慢性瘙癢[4]。鎮(zhèn)心安神方是以《素問·至真要大論篇》“諸痛癢瘡，皆屬于心”為理論指導(dǎo)形成的治療方劑，由龍骨、煅牡蠣、骨碎補(bǔ)、茯苓、淡竹葉組成，具有重鎮(zhèn)安神、平肝潛陽(yáng)、健脾補(bǔ)腎作用。課題組前期應(yīng)用本方治療慢性瘙癢性皮膚病取得可靠的臨床療效[5]，并通過實(shí)驗(yàn)初步表明本方對(duì)慢性皮炎模型動(dòng)物搔抓行為具有抑制作用[6]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察鎮(zhèn)心安神方含藥血清對(duì)辣椒素誘導(dǎo)的小鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細(xì)胞瞬時(shí)受體電位（TRP）通道蛋白TRPA1、TRPV1、TRPM8及自噬蛋白LC3表達(dá)的影響，為鎮(zhèn)心安神方治療慢性瘙癢性皮膚病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

6～8周齡雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量180～200 g，1～3日齡C57BL/6小鼠150只，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（鄂）2015-0018。飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度18～24℃，濕度50%～70%，12 h光照/黑暗循環(huán)，自由飲水進(jìn)食。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d開始灌胃，新生小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)24 h分離原代DRG細(xì)胞。

1.2 藥物、試劑與儀器

鎮(zhèn)心安神方（龍骨30 g，煅牡蠣30 g，骨碎補(bǔ)10 g，茯苓20 g，淡竹葉30 g），免煎顆粒購(gòu)自廣東一方制藥有限公司，將免煎顆粒以蒸餾水充分溶解，配制成原藥材濃度為1 g/mL混懸液，置于4℃保存?zhèn)溆?。辣椒素，上海阿拉丁生化科技有限公司，貨?hào)C107193；辣椒平，美國(guó)Cayman公司，貨號(hào)10007518；TRPA1抗體，以色列Alomone Labs，貨號(hào)ACC-037-25；TRPV1抗體、TRPM8抗體，美國(guó)Gene Tex公司，貨號(hào)分別為GTX54762、GTX54886；LC3抗體，美國(guó)Affinity公司，貨號(hào)AF5402；Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG，武漢博士德公司，貨號(hào)BA1031；β-tubulin，美國(guó)CST公司，貨號(hào)4466；神經(jīng)元無血清培養(yǎng)基，武漢普諾賽公司，貨號(hào)CM-M166。XTL型體視顯微鏡（鳳凰光學(xué)集團(tuán)），F(xiàn)V3000型激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司），MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），ECLIPSE Ts2型倒置顯微鏡（日本Nikon公司），5702R型低速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），F(xiàn)lexstation?3型酶 標(biāo)儀（美國(guó)MD公司），DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀、DYCZ-24DN型垂直電泳槽（北京六一儀器廠），JY300型水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.3 含藥血清制備

12只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組和鎮(zhèn)心安神方組，每組6只。給藥劑量根據(jù)人與大鼠體表面積折算[7]，空白組予蒸餾水10 mL/（kg·d）灌胃，鎮(zhèn)心安神方組予鎮(zhèn)心安神方混懸液6.3 g/（g·d）灌胃，2次/d，連續(xù)7 d。末次給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥1 h后0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，常溫靜置2 h以上，4℃、3 000 r/min離心15 min，血清56℃水浴30 min滅活，0.22μm濾膜過濾，即得空白血清和鎮(zhèn)心安神方含藥血清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分離及培養(yǎng)

75%乙醇消毒小鼠全身，超凈臺(tái)內(nèi)斷頭處死，剪開背部皮膚，打開脊髓腔，用顯微鑷取出雙側(cè)DRG，置預(yù)冷DMEM培養(yǎng)基中，加入Ⅰ型膠原酶（3 mg/mL）2 mL，37℃消化30 min，吸去液體，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化15 min，待細(xì)胞脫壁后加入完全培養(yǎng)基（90%DMEM+10%胎牛血清）終止消化，將細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用神經(jīng)元無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日向培養(yǎng)基內(nèi)加入阿糖胞苷（5μmol/L）抑制非神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，48 h后更換正常神經(jīng)元專用培養(yǎng)基。

1.5 免疫熒光鑒定背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

在培養(yǎng)皿中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗3次，0.5%Triton X-100室溫透明20 min；PBS浸洗3次，吸水紙吸干PBS，滴加山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸去封閉液，加β-tubulin一抗（1∶100），4℃濕盒孵育過夜；加Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG（1∶50），37℃濕盒孵育1 h，PBST浸洗3次，滴加DAPI，避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行核染，PBST洗去多余DAPI，吸水紙吸干液體，封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 造模、分組及干預(yù)

將原代DRG細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種至6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、鎮(zhèn)心安神方含藥血清組和辣椒平組，每組3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組、模型組和辣椒平組用20%空白血清預(yù)處理4 h，辣椒平組同時(shí)加入終濃度為1μmol/L的辣椒平，鎮(zhèn)心安神方含藥血清組用10%鎮(zhèn)心安神方含藥血清和10%空白血清預(yù)處理4 h，然后模型組、鎮(zhèn)心安神方含藥血清組和辣椒平組加入1μmol/L辣椒素，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h建立瘙癢模型[8]。

1.7 Western blot檢測(cè)

收集各組細(xì)胞，加入裂解液裂解，提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，依次加樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉，滴加TRPV1抗體（1∶200）、TRPA1抗體（1∶500）、TRPM8抗體（1∶500）、LC3抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜5次，每次5 min；滴加HRP標(biāo)記二抗（1∶50 000），37℃搖床孵育2 h；TBST洗膜，ECL發(fā)光液曝光，顯影液顯影，采用Bandscan 5.0軟件計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS6.12軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊用方差分析，方差不齊用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鑒定

接種的細(xì)胞大部分在4～6 h開始貼壁，呈圓形或橢圓形，胞體周圍出現(xiàn)一圈光暈。接種后24 h，大部分貼壁細(xì)胞長(zhǎng)出突起，多數(shù)細(xì)胞為具有多個(gè)突起的多極神經(jīng)元，少數(shù)為雙極和假單極神經(jīng)元，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)元突起的主干和分支明顯延長(zhǎng)并增粗，神經(jīng)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞體較大，折光性好，光暈強(qiáng)，交織成密集的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，突起細(xì)長(zhǎng)，見圖1。DRG細(xì)胞幾乎不增殖，免疫熒光染色結(jié)果顯示，DRG神經(jīng)元胞體及突起表現(xiàn)為β-tubulin染色陽(yáng)性，呈紅色熒光，細(xì)胞核表現(xiàn)為DAPI染色陽(yáng)性，呈藍(lán)色熒光，見圖2。

圖1 DRG細(xì)胞形態(tài)

圖2 DRG細(xì)胞鑒定（免疫熒光染色，×400）

2.2 鎮(zhèn)心安神方含藥血清對(duì)細(xì)胞瞬時(shí)受體電位通道蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，鎮(zhèn)心安神方含藥血清組細(xì)胞TRPV1、TRPA1蛋白表達(dá)降低，辣椒平組細(xì)胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與辣椒平組比較，鎮(zhèn)心安神方含藥血清組細(xì)胞TRPA1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TRPV1、TRPM8蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖3、表1。

表1 各組細(xì)胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組細(xì)胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與辣椒平組比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組模型組鎮(zhèn)心安神方含藥血清組辣椒平組n 3 3 3 3 TRPV1 0.167±0.013 0.674±0.096*0.461±0.068#0.408±0.058#TRPA1 0.165±0.030 0.570±0.083**0.411±0.021#△0.317±0.051#TRPM8 0.160±0.017 0.545±0.095**0.386±0.030 0.293±0.062#

圖3 各組細(xì)胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白免疫印跡

2.3 鎮(zhèn)心安神方含藥血清對(duì)細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，鎮(zhèn)心安神方含藥血清組和辣椒平組細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與辣椒平組比較，鎮(zhèn)心安神方含藥血清組細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P＜0.05）。見圖4、表2。

圖4 各組細(xì)胞LC3蛋白免疫印跡

表2 各組細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與辣椒平組比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組模型組鎮(zhèn)心安神方含藥血清組辣椒平組n 3 3 3 3 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.178±0.026 0.776±0.102**0.551±0.061#△0.341±0.083##

3 討論

瘙癢發(fā)作依賴于皮膚組織中細(xì)胞與神經(jīng)纖維相互作用，這一過程涉及眾多細(xì)胞、介質(zhì)、受體及通路，常表現(xiàn)為癢覺敏感、癢覺異常及自發(fā)性瘙癢，其核心機(jī)制為癢覺神經(jīng)通路敏化和調(diào)節(jié)功能失調(diào)[9]。TRP通道是存在于細(xì)胞膜或胞內(nèi)細(xì)胞器膜上的一類非選擇性陽(yáng)離子通道蛋白，對(duì)Ca2+具有高通透性，易被生理性或亞生理性刺激（如溫度變化、化學(xué)及機(jī)械壓力）激活，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，細(xì)胞膜去極化，神經(jīng)元活化閾值降低，是發(fā)生癢覺神經(jīng)敏化的重要基礎(chǔ)[10]。在慢性瘙癢性皮膚病患者中，普遍存在神經(jīng)生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素1、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素等瘙癢介質(zhì)釋放增加[11]，這些介質(zhì)可促進(jìn)末梢神經(jīng)生長(zhǎng)和數(shù)量增加，上調(diào)神經(jīng)肽類遞質(zhì)表達(dá)，激活TRP家族成員TRPV1和TRPA1[12]，通過組胺依賴性神經(jīng)通路和組胺非依賴性神經(jīng)通路傳遞瘙癢信號(hào)。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)游離Ca濃度對(duì)自噬和誘導(dǎo)自噬有重要調(diào)節(jié)作用[13]，但Ca2+對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制尚存在爭(zhēng)議。有研究顯示，Ca2+對(duì)自噬有抑制作用[14]。也有文獻(xiàn)報(bào)道Ca2+對(duì)自噬過程有促進(jìn)作用[15]。TRP通道是重要的Ca2+調(diào)控通道，對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化有“門控”作用。有研究表明，TRP通道可作為細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)器[16]，TRPV1通過AMPK信號(hào)通路抑制自噬，減輕心肌細(xì)胞缺氧損傷[17]，辣椒素能增加自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ和Atg5表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬[18]。TRPM型相關(guān)蛋白可通過增加細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，激活自噬并促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[13]。

《素問·至真要大論篇》有“諸痛癢瘡，皆屬于心”，王冰注曰：“心寂則痛癢微，心燥則痛癢甚，百端之起，皆自心生，痛癢瘡瘍生于心也?！薄鹅`樞·邪客》亦有“心者，五臟六腑之大主也，精神之所舍也”，指出皮膚疾病與心神的關(guān)系。鎮(zhèn)心安神方臨床用于特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹等瘙癢性皮膚病治療，選用具有鎮(zhèn)心安神、清心除煩、健脾補(bǔ)腎作用的藥物，損有余，補(bǔ)不足，從整體上改善患者瘙癢和睡眠，打破瘙癢-搔抓惡性循環(huán)，提高患者生活質(zhì)量。方中重用龍骨、煅牡蠣，龍骨主要成分為碳酸鈣、磷酸鈣[19]，煅牡蠣主要成分為碳酸鈣、微量元素和氨基酸[20]，骨碎補(bǔ)主要成分骨碎補(bǔ)總黃酮可調(diào)節(jié)體內(nèi)Ca2+水平[21]，推測(cè)以上藥物配伍對(duì)體內(nèi)Ca2+代謝和功能具有調(diào)控作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，鎮(zhèn)心安神方對(duì)辣椒素誘導(dǎo)的DRG細(xì)胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表達(dá)具有抑制作用，可能通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)，下調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，降低其興奮性，阻斷癢覺信號(hào)傳導(dǎo)。