辛夷配方顆粒UPLC指紋圖譜及含量測定研究

李振雨，呂渭升，何民友，段志文，楊潔，劉曉霞，魏梅，2，孫冬梅，2，陳向東

1.廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244；2.江西一方天江藥業(yè)有限公司，江西 南昌 330006

辛夷為木蘭科植物望春花Magno1ia biondiiPamp.、玉蘭Magno1ia denudataDesr.或武當(dāng)玉蘭Magno1ia sprengeriPamp.的干燥花蕾，具有散風(fēng)寒、通鼻竅作用，用于治療風(fēng)寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵[1]。辛夷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，歷代本草均有收載?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究表明，辛夷主要含有揮發(fā)油、木脂素、黃酮、生物堿等有效成分，具有抗炎、抗過敏、降壓、興奮子宮等藥理作用，臨床多用于治療鼻炎和鼻竇炎等[2-4]。

傳統(tǒng)中藥飲片臨床使用以湯劑為主，湯劑的活性成分是中藥臨床有效性的物質(zhì)基礎(chǔ)，辛夷配方顆粒以水為溶劑，經(jīng)現(xiàn)代工業(yè)提取、濃縮、干燥、制粒而制成，作為新的飲片形式代替?zhèn)鹘y(tǒng)飲片供臨床辨證論治、隨證加減、配方使用[5]。目前辛夷配方顆粒的質(zhì)量控制模式仍延續(xù)傳統(tǒng)的化學(xué)藥品質(zhì)量控制思路，僅以木蘭脂素為定量指標(biāo)[6-8]，然而以木蘭脂素為代表的木脂素類有效成分極性較小、水溶性差，因此，該類化學(xué)成分從飲片到配方顆粒的轉(zhuǎn)移率并不高，僅測定木蘭脂素等木脂素類成分對辛夷配方顆粒生產(chǎn)工藝的質(zhì)量控制略顯不足；另外，單一化學(xué)成分定量分析難以全面反映配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，且缺乏專屬性。中藥色譜指紋圖譜能夠提供更為全面、豐富的定性和半定量信息。HPLC指紋圖譜因柱效低、色譜分離能力有限、分析時(shí)間長等缺點(diǎn)，難以適應(yīng)中藥復(fù)雜體系的研究。超高效液相色譜法（UPLC）分辨率高、分離能力強(qiáng)、分析時(shí)間大大縮短，在中藥指紋圖譜建立方面優(yōu)勢明顯[9-10]。

本研究采用UPLC建立辛夷配方顆粒指紋圖譜，對辛夷配方顆粒有效成分進(jìn)行定性和半定量分析，并增加對辛夷配方顆粒水溶性成分的定量分析，從多角度控制辛夷配方顆粒的質(zhì)量，為提升辛夷配方顆粒的質(zhì)量控制水平提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters H-Class超高效液相色譜儀（沃特世公司），YMC Triart C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9μm），ME204E萬分之一分析天平（梅特勒-托利多公司），XP26百萬分之一分析天平（梅特勒-托利多公司），JJ600電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），KQ500D數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），Milli-Q Direct超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）。

木蘭脂素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110882-201708，含量96.5%），木蘭花堿對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkq17063003，含量98.0%），松脂素二甲醚對照品（伊普賽諾，批號(hào)1506434，含量100.0%），表木蘭脂素B對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wka02424，純度≥98%），辛夷對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)121079-200704）。乙醇、甲醇為分析純（西隴科學(xué)有限公司），磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、乙腈（默克股份有限公司）為色譜純，水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

辛夷配方顆粒10批（批號(hào)CG01～CG10），來自廣東一方制藥有限公司。制備方法：取辛夷飲片6 000 g，加水煎煮，收集揮發(fā)油適量（以β-環(huán)糊精包合，備用），過濾，濾液濃縮成清膏，加入揮發(fā)油包合物，再加入輔料適量，噴霧干燥，加入輔料適量，混勻，制粒，制成1 000 g，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 超高效液相色譜條件

采用YMC Triart C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9μm），以乙腈為流動(dòng)相A、0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～15 min，10%～15%A；15～25 min，

15%～38%A；25～35 min，38%～44%A；35～39 min，44%～100%A；39～40 min，100%A），流速0.3 mL/min，檢測波長230 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量1μL。

2.1.2 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸，其余色譜條件同“2.1.1”項(xiàng)下，電噴霧離子源（H-ESI），正離子掃描模式，掃描范圍（m/z）70～1 050 Da，歸一化碰撞電壓（NCE）20 V，鞘氣壓力35 arb，輔助壓力10 arb，噴霧電壓3.80 kV，吹掃氣0 arb，0S-lens電壓50 V，毛細(xì)管溫度350℃，加熱溫度350℃。

2.1.3 對照品溶液制備

取木蘭脂素、木蘭花堿、松脂素二甲醚和表木蘭脂素B對照品各適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含木蘭脂素55μg、木蘭花堿100μg、松脂素二甲醚100μg和表木蘭脂素B 50μg的溶液，即得。

2.1.4 供試品溶液制備

取辛夷配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.1.5 .1精密度試驗(yàn)

取辛夷配方顆粒（批號(hào)CG09）適量，研細(xì)，取約0.2 g，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，以5號(hào)峰木蘭脂素峰為參照峰S，計(jì)算其余共有峰與S峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時(shí)間RSD為0.04%～0.19%，相對峰面積RSD為0.10%～0.69%，均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 .2重復(fù)性試驗(yàn)

取辛夷配方顆粒（批號(hào)CG09）適量，研細(xì)，取約0.2 g，平行6份，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以5號(hào)峰木蘭脂素峰為參照峰S，計(jì)算其余共有峰與S峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時(shí)間RSD為0.06%～0.25%，相對峰面積RSD為0.14%～0.63%，均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 .3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取辛夷配方顆粒（批號(hào)CG09）適量，研細(xì)，取約0.2 g，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定，以5號(hào)峰木蘭脂素峰為參照峰S，計(jì)算其余共有峰與S峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時(shí)間RSD為0.07%～0.24%，相對峰面積RSD為0.20%～0.51%，均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 指紋圖譜建立及分析

分別取10批辛夷配方顆粒樣品，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄各批次辛夷配方顆粒樣品指紋圖譜。將10批辛夷配方顆粒指紋圖譜的CDF格式導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723版）軟件，以批號(hào)CG09樣品指紋圖譜為參照圖譜，進(jìn)行共有峰標(biāo)識(shí)，共標(biāo)定7個(gè)共有指紋峰（見圖1），進(jìn)行多點(diǎn)保留時(shí)間校正和峰匹配，生成辛夷配方顆粒對照指紋圖譜（見圖2）。計(jì)算10批辛夷配方顆粒樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表1。

圖1 10批辛夷配方顆粒UPLC指紋圖譜共有峰標(biāo)識(shí)

圖2 辛夷配方顆粒UPLC對照指紋圖譜

表1 10批辛夷配方顆粒指紋圖譜相似度評價(jià)

10批辛夷配方顆粒指紋圖譜的相似度為0.965～0.997，表明10批樣品具有較高的相似性。為嚴(yán)格控制辛夷配方顆粒的大生產(chǎn)質(zhì)量，根據(jù)10批樣品測定結(jié)果，規(guī)定按《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723版）計(jì)算，辛夷配方顆粒供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度應(yīng)不得低于0.95。

2.1.7 指紋圖譜共有指紋峰的高分辨質(zhì)譜指認(rèn)

取辛夷配方顆粒（批號(hào)CG09）供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)確分子量與辛夷配方顆粒樣品質(zhì)譜圖中未知色譜峰的分子量進(jìn)行對比，結(jié)合目標(biāo)色譜峰的二級質(zhì)譜信息，并與賽默飛mzVault標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，對辛夷配方顆粒指紋圖譜7個(gè)共有指紋峰進(jìn)行指認(rèn)，共指認(rèn)出其中4個(gè)成分，分別為2號(hào)峰木蘭花堿、4號(hào)峰松脂素二甲醚、5號(hào)峰木蘭脂素和7號(hào)峰表木蘭脂素B，見圖3、表2。

表2 辛夷配方顆粒指紋圖譜指紋峰鑒定

圖3 辛夷配方顆粒UPLC指紋圖譜共有指紋峰的質(zhì)譜指認(rèn)

2.1.8 指紋圖譜共有峰的對照品確證

根據(jù)質(zhì)譜指認(rèn)結(jié)果，通過對照品保留時(shí)間比對，并結(jié)合紫外-可見3D光譜圖，對高分辨質(zhì)譜指認(rèn)出的色譜峰進(jìn)行確證，確定峰2為木蘭花堿、峰4為松脂素二甲醚、峰5為木蘭脂素、峰7為表木蘭脂素B，見圖4。

圖4 辛夷配方顆粒UPLC指紋圖譜共有峰的對照品確證

2.2 木蘭脂素和木蘭花堿含量測定

2.2.1 色譜條件

同“2.1.1”項(xiàng)下。

2.2.2 對照品溶液制備

取木蘭脂素和木蘭花堿對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含木蘭脂素55μg、木蘭花堿100μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備

同“2.1.4”項(xiàng)下。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

取木蘭脂素、木蘭花堿對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，木蘭脂素及木蘭花堿峰面積的RSD分別為0.68%、2.6%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取木蘭脂素對照品19.462 mg、木蘭花堿對照品20.356 mg置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL含木蘭脂素1 878.083μg、木蘭花堿1 994.888μg的對照品貯備液。分別精密移取上述對照品貯備液5.0、2.0、1.0、0.5、0.1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述6個(gè)不同濃度對照品溶液1μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。木蘭脂素回歸方程為：Y=1 871.81X+3 442.95，r=0.999 9，表明木蘭脂素在18.781～1 878.083μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。木蘭花堿回歸方程為：Y=11.899X+17.288，r=0.999 9，表明木蘭花堿在19.949～1 994.888μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取辛夷配方顆粒樣品（批號(hào)CG09）適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，平行6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算木蘭脂素和木蘭花堿的平均含量和RSD。結(jié)果顯示，木蘭脂素平均含量為22.87 mg/g，RSD=0.27%；木蘭花堿平均含量為24.62 mg/g，RSD=1.49%。RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱定木蘭脂素對照品24.576 mg、木蘭花堿對照品27.719 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品加樣母液。取9個(gè)錐形瓶，分為3組，每組3個(gè)，按樣品與對照品含量為1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例分別加入木蘭脂素和木蘭花堿對照品母液各1、2、3 mL，氮?dú)獯蹈?。取辛夷配方顆粒（批號(hào)CG09），研細(xì)，取約0.1 g，平行9份，精密稱定，置于上述錐形瓶中，按“2.2.3”項(xiàng)下確定的方法制備9份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算木蘭脂素和木蘭花堿的含量和加樣回收率。結(jié)果木蘭脂素加樣回收率為95.16%～98.32%，平均回收率為96.51%，RSD=0.86%；木蘭花堿加樣回收率為94.60%～103.19%，平均回收率為99.10%，RSD=2.80%，均符合要求，表明該方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表3。

表3 木蘭脂素、木蘭花堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取辛夷配方顆粒（批號(hào)CG09）適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算木蘭脂素、木蘭花堿峰面積RSD分別為0.36%、0.24%，均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 樣品測定

按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備10批辛夷配方顆粒供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算辛夷配方顆粒中木蘭脂素和木蘭花堿的含量，結(jié)果見表4。

表4 10批辛夷配方顆粒中木蘭脂素和木蘭花堿含量測定結(jié)果（mg/g）

10批辛夷配方顆粒樣品木蘭脂素含量為18.65～27.87 mg/g，木蘭花堿含量為21.20～32.97 mg/g，不同批次辛夷配方顆粒木蘭脂素和木蘭花堿的含量存在一定差異。根據(jù)10批辛夷配方顆粒木蘭花堿的含量測定結(jié)果，以均值的70%為限度標(biāo)準(zhǔn)，辛夷配方顆粒木蘭脂素的含量應(yīng)不低于16.96 mg/g，修約為17.0 mg/g，即每1 g配方顆粒含木蘭脂素（C23H28O7）應(yīng)不低于17.0 mg；辛夷配方顆粒木蘭花堿的含量應(yīng)不低于18.86 mg/g，修約為19.0 mg/g，即每1 g配方顆粒含木蘭花堿（C20H24NO4）應(yīng)不低于19.0 mg。

3 討論

本試驗(yàn)采用UPLC對辛夷配方顆粒指紋圖譜與有效成分的含量進(jìn)行同時(shí)測定，在45 min內(nèi)即完成主要色譜峰的良好分離，且230 nm處色譜峰數(shù)目較多、響應(yīng)值較大、基線平穩(wěn)，定量指標(biāo)木蘭脂素和木蘭花堿的分離度和峰純度符合定量要求，因此選擇230 nm作為檢測波長。流動(dòng)相的篩選考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-水3種溶劑系統(tǒng)的洗脫和分離效果，結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，各色譜峰出峰時(shí)間短、分離度較好。考察4種不同品牌和填料的色譜柱YMC Triart C18（2.1 mm×100 mm，1.9μm）、Agilent SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8μm）、Waters HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8μm）、Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）對各色譜峰的分離效果，結(jié)果采用YMC Triart C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9μm）時(shí)各色譜峰分離效果最佳。含量測定與指紋圖譜方法一致，在保證主要色譜峰得到較好的分離情況下，縮短分析時(shí)間。

本研究對供試品溶液的制備方法進(jìn)行考察，包括提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間以及提取溶劑用量，最終確定樣品的最佳前處理方法。在提取溶劑考察中，分別考察了甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、10%甲醇、乙醇、70%乙醇、稀乙醇和水等溶劑，結(jié)果顯示，采用80%甲醇為提取溶劑，辛夷配方顆粒指紋圖譜各共有指紋峰的總峰面積/稱樣量值及2種有效成分的含量最大，因此，選擇80%甲醇為提取溶劑。同時(shí)比較了超聲與回流提取方式，結(jié)果顯示，2種提取方式各共有指紋峰的總峰面積/稱樣量值、峰型及分離效果，以及木蘭脂素和木蘭花堿的含量無明顯差異，為操作方便，選擇超聲提取的處理方式。此外，對不同超聲時(shí)間（15、30、45 min）及提取溶劑不同用量（15、25、50 mL）進(jìn)行考察，以各共有指紋峰的總峰面積/稱樣量值及2種有效成分的含量為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳的提取時(shí)間和溶劑用量，結(jié)果顯示，采用80%甲醇25 mL超聲提取30 min的提取效率最高。

鑒于中藥有效成分的多樣性及復(fù)雜性，單一成分定量的化學(xué)藥品質(zhì)量控制模式既缺乏專屬性，又難以反映中藥內(nèi)在質(zhì)量屬性，因此，采用指紋圖譜結(jié)果多成分含量測定的方式，實(shí)現(xiàn)對辛夷配方顆粒的質(zhì)量控制，結(jié)果顯示，10批辛夷配方顆粒指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均在0.95以上，表明不同批次的配方顆粒樣品相似度較高，生產(chǎn)工藝相對比較穩(wěn)定。

2020年版《中華人民共和國藥典》辛夷項(xiàng)下僅以木蘭脂素為含量測定指標(biāo)，難以反映辛夷配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。本研究采用UPLC建立辛夷配方顆粒的指紋圖譜，同時(shí)測定其木蘭脂素、木蘭花堿含量，以建立的方法對10批辛夷配方顆粒的指紋圖譜相似度及木蘭脂素、木蘭花堿含量進(jìn)行了比較，實(shí)現(xiàn)對辛夷配方顆粒中有效成分的定性和半定量分析，并增加對辛夷配方顆粒中水溶性成分的定量分析，從多角度控制辛夷配方顆粒的質(zhì)量，該方法專屬性強(qiáng)，分析時(shí)間短，能夠有效提升辛夷配方顆粒的質(zhì)量控制水平。