補腎活血方對多囊卵巢綜合征-胰島素抵抗模型大鼠性激素水平及胰島素抵抗的影響

陶沖，林鶯，徐沙麗，林蕾，許金榜，2

1.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122；2.福建省婦幼保健院，福建醫(yī)科大學婦兒臨床醫(yī)學院，福建 福州 350001

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）在青春期和育齡期婦女中的患病率達5%～10%[1]。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）在PCOS患者中較為常見，IR進展后，易影響生殖系統(tǒng)功能，導致患者自然流產(chǎn)，亦有導致凝血功能異常及心血管疾病發(fā)生的風險[2-4]。國家級名老中醫(yī)門成福認為，PCOS不孕主要責之于腎，腎虛血瘀為其主要病因[5]。課題組前期研究表明，補腎活血法在改善PCOS患者臨床癥狀和體征、子宮內(nèi)膜容受性、IR等方面效果顯著[6-7]。補腎活血方是導師許金榜臨床治療PCOS-IR的經(jīng)驗方，本研究采用來曲唑聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)制備PCOS-IR大鼠模型[8]，觀察補腎活血方對模型大鼠性激素水平及IR的影響，明確其作用機制，為臨床治療PCOS-IR提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

6周齡SPF級雌性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，杭州醫(yī)學院提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物房，溫度22～26℃，濕度40%～70%，每日光照12 h，動物使用許可證號SYXK（閩）2019-0007。實驗過程嚴格遵守《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審批（FJTCM IACUC 2020096）。普通飼料（蛋白22.5%、碳水化合物65.4%、脂肪12.1%）、高脂飼料[9]（蛋白15%、碳水化合物26%、脂肪59%），均購自北京華阜康公司。

1.2 藥物

補腎活血方（菟絲子30 g，紫石英30 g，巴戟天15 g，熟地黃15 g，丹參15 g等）組成，飲片購自福州鷺燕醫(yī)藥有限公司，常規(guī)方法煎煮2次，第1次加10倍量水，第2次加8倍量水，分別煎煮1 h，紗布過濾，濃縮至原藥材濃度為0.88、1.75、3.25 g/mL混懸液，分裝，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。來曲唑片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，2.5 mg/片，批號210206KL，將藥片研碎，用CMC-Na溶液溶解，配制成濃度為0.1 mg/mL溶液。鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶制藥有限公司，0.85 g/片，批號ABX1690，將藥片粉碎，用CMC-Na溶液溶解，配制成濃度為20 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），美國Sigma公司，批號419273；卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）、雌二醇（E2）、抗米勒管激素（AMH）ELISA試劑盒，批號分別為MM-0566R1、MM-0624R1、MM-0577R1、MM-0552R1、MM-0219R1，江蘇酶免實業(yè)有限公司；蛋白激酶B（AKT）抗體，批號9272S，美國CST公司；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體，批號2972S，美國CST公司。7600P拜安進血糖儀及配套試紙（德國拜耳公司），JXFTPRP-48研磨機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司），JID-17R冷凍離心機（廣州吉迪儀器有限公司），Quant Studio6 Flex型RT-PCR儀（美 國ABI公 司），ChemiDocTMXRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 造模及分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，連續(xù)7 d在相同時段對大鼠進行陰道涂片觀察，篩選出具有正常動情周期大鼠36只，取6只大鼠每日予0.5%CMC-Na溶液灌胃及普通飼料喂養(yǎng)作為空白組，剩余30只大鼠每日予來曲唑溶液1 mL/100 g灌胃聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)制備PCOS-IR大鼠模型[8]，連續(xù)4周。第4周末，大鼠禁食12 h以上，腹腔注射50%葡萄糖注射液2 g/kg，尾尖采血檢測注射后0、15、30、60、120 min血糖（GLU）。以造模大鼠陰道涂片呈持續(xù)性動情間期，血糖曲線下面積（AUC）高于空白組為造模成功[10]。血糖AUC=7.5×GLU0min+15.0×GLU15min+22.5×GLU30min+45.0×GLU60min+30.0×GLU120min。

將30只PCOS-IR成模大鼠隨機分為模型組、西藥組和補腎活血方低、中、高劑量組（中藥低、中、高劑量組），每組6只。

2.2 給藥

造模成功后開始灌胃，西藥組灌胃20 mg/mL鹽酸二甲雙胍溶液，中藥低、中、高劑量組分別灌胃0.88、1.75、3.25 g/mL補腎活血方混懸液[11]，空白組和模型組灌胃滅菌飲用水，灌胃體積均為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)21 d。除空白組外，其余各組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

2.3 糖代謝相關(guān)指標檢測

末次給藥后，大鼠禁食12 h以上，次日8:00尾尖采血，血糖儀檢測大鼠空腹血糖（FPG）和空腹胰島素（FINS）；腹腔注射50%葡萄糖注射液2 g/kg，檢測注射后0、15、30、60、120 min血糖，采用Excel2019軟件計算血糖AUC，評估大鼠糖耐量，并計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

2.4 性激素水平檢測

糖耐量試驗24 h后（禁食12 h以上），腹腔注射20%烏拉坦5 mL/kg麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫、3 000 r/min離心10 min，ELISA檢測血清FSH、LH、T、E2、AMH水平。

2.5 RT-PCR檢測

取左側(cè)卵巢，生理鹽水清洗，剪取適量卵巢組織，Trizol法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR。反應(yīng)條件：95℃預變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40次循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.6 Western blot檢測

取適量卵巢組織，加入裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白分子量配膠，蛋白變性后，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉4℃封閉過夜，滴加AKT、mTOR、GAPDH一抗（均為1∶1 000），室溫搖床孵育2 h，滴加二抗（1∶5 000），室溫搖床孵育1.5 h，ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，以GAPDH為內(nèi)參，利用Image J軟件進行灰度分析。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett's T3法；不符合正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 補腎活血方對模型大鼠糖代謝相關(guān)指標的影響

與空白組比較，模型組大鼠FPG、血糖AUC、HOMA-IR顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠FPG、血糖AUC、HOMA-IR顯 著 降 低（P＜0.01，P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠FPG、血糖AUC、HOMA-IR比較（±s）

表2 各組大鼠FPG、血糖AUC、HOMA-IR比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數(shù)6 6 6 6 6 6 FPG/（mmol/L）3.55±0.29 4.37±1.00*2.93±0.65##3.35±0.64#3.47±0.69#3.55±0.62#血糖AUC/（min·mmol/L）1 238.88±78.91 1 966.63±143.02**1 551.25±295.78#1 320.50±238.24##1 369.88±415.69##1 321.75±327.00##HOMA-IR 3.67±0.29 11.54±1.39**7.55±1.03##7.32±1.79##7.12±0.87##6.60±0.61##

3.2 補腎活血方對模型大鼠性激素水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清FSH、E2水平顯著降低（P＜0.01），LH、T、AMH水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠血清FSH、E2水平顯著升高（P＜0.01），LH、T、AMH水平顯著降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清性激素水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清性激素水平比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數(shù)6 6 6 6 6 6 FSH/（IU/L）36.13±0.70 18.58±0.49**26.58±0.89##27.08±1.20##25.90±1.85##25.89±2.44##LH/（ng/L）33.30±0.32 47.81±1.32**36.27±0.27##39.38±2.04##39.21±0.95##37.96±2.66##T/（nmol/L）92.49±1.63 184.01±2.40**112.66±5.18##125.99±17.17##106.84±3.26##117.47±10.01##E2/（pg/mL）141.12±4.73 88.29±1.64**103.69±2.57##107.18±3.11##105.73±3.27##103.46±6.88##AMH/（pg/mL）163.44±3.79 271.77±7.28**189.92±8.31##203.10±6.73##191.63±3.97##203.92±16.27##

3.3 補腎活血方對模型大鼠卵巢組織蛋白激酶B和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織AKT和mTOR mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠卵巢組織AKT和mTOR mRNA表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠卵巢組織AKT和mTOR mRNA表達比較（±s）

表4 各組大鼠卵巢組織AKT和mTOR mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數(shù)6 6 6 6 6 6 AKT 1.03±0.28 0.45±0.11**0.88±0.22#1.42±0.25##1.56±0.24##1.41±0.42##mTOR 1.01±0.19 0.09±0.01**0.31±0.09##0.28±0.10#0.26±0.07#0.25±0.08#

3.4 補腎活血方對模型大鼠卵巢組織蛋白激酶B和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織AKT和mTOR蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠卵巢組織AKT和mTOR蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)果見圖1、表5。

圖1 各組大鼠卵巢組織AKT和mTOR蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠卵巢組織AKT和mTOR蛋白表達比較（±s）

表5 各組大鼠卵巢組織AKT和mTOR蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數(shù)6 6 6 6 6 6 AKT 0.77±0.12 0.50±0.01*0.90±0.13##1.03±0.17##1.32±0.11##1.30±0.18##mTOR 0.42±0.09 0.22±0.10*0.43±0.10##0.42±0.02#0.53±0.03##0.45±0.12##

4 討論

根據(jù)PCOS-IR臨床表現(xiàn)，屬中醫(yī)學“月經(jīng)愆期”“不孕”“癥瘕”等范疇?！毒霸廊珪D人規(guī)》云：“是以調(diào)經(jīng)種子之法，亦惟以填補命門，顧惜陽氣之為主?！闭{(diào)經(jīng)種子以補腎陽為主。月經(jīng)后期血?？仗摚又I陽虛致氣血運行不暢，瘀阻胞宮，使卵子無法得到滋養(yǎng)進而發(fā)育成熟，形成排卵障礙、月經(jīng)過少或月經(jīng)延遲。《傅青主女科》云：“且肥胖之婦，內(nèi)肉必滿，遮隔子宮，不能受精，此必然之勢也?！狈逝终叨鄽馓?，氣虛則血瘀，血瘀胞宮受阻，難以受孕。PCOS發(fā)病主要因腎-天癸-沖任-胞宮軸失調(diào)，卵巢功能障礙導致排卵功能異常。橫斷面調(diào)查研究顯示，PCOS患者病位主要在腎（60.00%），病性類證素出現(xiàn)最多為血瘀（50.39%），證候類型多為腎虛血瘀（34.75%），腎虛血瘀與不孕癥呈正相關(guān)（P＜0.05）[12]；張紅陽等[13]研究顯示，PCOS患者西醫(yī)診斷Ⅲ型（稀發(fā)/無排卵+高雄激素臨床和/或生化特征）中腎虛血瘀證占比較高，故治療常以補腎活血為法。補腎活血方中菟絲子、紫石英、巴戟天等溫補腎陽、滋養(yǎng)陰精、益精填髓，可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢生殖軸功能，改善卵巢、子宮質(zhì)量，抑制卵巢顆粒細胞凋亡，調(diào)控激素水平，促進排卵，降低自然流產(chǎn)率；丹參活血養(yǎng)血，氣血通暢，腎精亦得到補充[14-16]。本實驗結(jié)果顯示，補腎活血方可顯著降低模型大鼠血清T、LH、AMH水平，升高E2、FSH水平，下調(diào)IR相關(guān)指標FPG、血糖AUC、HOMA-IR水平。

研究表明，PI3K/AKT信號通路是胰島素調(diào)節(jié)血糖的下游通路之一，其作用機制主要通過胰島β細胞分泌的胰島素與細胞膜外的胰島素受體結(jié)合，磷酸化激活PI3K/AKT通路，調(diào)控下游分子，抑制糖異生，最終下調(diào)血糖水平[17-20]。AKT可直接影響mTOR信號通路下游基因表達，AKT/mTOR信號通路異常會導致女性卵巢病變，影響卵泡發(fā)育，甚至導致不孕及卵巢早衰[21-22]。胰島β細胞缺陷和IR與PCOS卵巢和子宮內(nèi)膜PI3K/AKT/mTOR信號通路受損有關(guān)[23-24]。以上研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路參與PCOS-IR卵泡發(fā)育、IR等過程。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠卵巢組織AKT、mTOR mRNA和蛋白表達降低，提示AKT/mTOR信號通路被抑制，補腎活血方能上調(diào)AKT、mTOR mRNA和蛋白表達，激活AKT/mTOR信號通路。

綜上所述，補腎活血方能改善PCOS-IR大鼠性激素水平和IR，其作用機制可能是通過激活卵巢AKT/mTOR信號通路，促進葡萄糖轉(zhuǎn)運，減輕糖代謝障礙。