高效液相法測定飼料中黃曲霉素B1的不確定度分析

鄧田方，吳玉剛，胡 蝶，徐煥宇，鄭會祥

廣東粵海飼料集團股份有限公司，廣東 湛江 524000

飼料及其原料在生產(chǎn)、儲存、運輸過程中往往因操作不當，容易被霉菌污染，產(chǎn)生霉菌毒素，如黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、伏馬毒素B1（fumonisin B1）等，黃曲霉毒素B1是飼料中最常見且危害較大的霉菌毒素，在動物飼料中存在15%～20%的超標污染[1]。黃曲霉毒素B1會導致動物生長受阻、飼料效率下降、免疫抑制、繁殖力下降[2]，也會誘導動物氧化應(yīng)激[3]等不良作用，對養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的影響。黃曲霉毒素B1不僅可以引起養(yǎng)殖動物的組織受損和代謝異常，同時也會在其組織中殘留下來[4]，而黃曲霉毒素B1被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ級致癌物，從而造成食品安全問題，可能危害消費者的身體健康。因此，明確飼料中的限量標準，準確檢測飼料中AFB1的含量，對保障產(chǎn)品質(zhì)量安全具有重要意義。為規(guī)范飼料市場，控制飼料質(zhì)量，降低安全風險，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2625 號公告對飼料中AFB1的限量做出了規(guī)定，并在2014 年7 月8 日發(fā)布了《飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》（GB/T 30955—2014），于2015 年1 月10 日實施，自此，AFB1在飼料行業(yè)中得到全面關(guān)注。

在具體測量操作過程中常存在由儀器設(shè)備、容量器具、標準曲線和人為操作等造成的不確定性，從而對飼料生產(chǎn)過程中產(chǎn)品安全監(jiān)測和質(zhì)量安全判定產(chǎn)生影響。因此，本研究根據(jù)JJF1059.1—2012《測量確定度的評定與表示》和GB/T 30955—2014《飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》中的高效液相法測定飼料中黃曲霉毒素B1的含量進行測定，找出影響測量結(jié)果不確定度的各種因素，對測定結(jié)果的不確定度進行評定，旨在為實驗室在該檢測過程中進一步提高檢測數(shù)據(jù)的可靠性和一致性做參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）標準品：AFB1標準品溶液（黃曲霉毒素B1標準溶液；Aflatoxin B11 μg/mL in Acetonitrile，英國LGC）。

2）試劑：乙腈、甲醇（色譜純，DIKMA 公司）。

3）樣品：南美白對蝦配合飼料。

4）親和柱：AFB1免疫親和柱（北京華安麥科）。

5）色譜柱：AE1205-2546（C18 EPS，5 μm，4.6×250 mm，120）；0.45 μm 水系濾膜（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）。

6）儀器設(shè)備。安捷倫1260 高效液相色譜儀、MS電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）、SCI412 離心機（SCJLOGEX）、HOKEE 純水儀（宏科）、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、溶劑過濾器（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）、光化學衍生器（北京華安麥科）。

1.2 測量步驟

1）提取。稱取試樣（粒度＜1 mm）5.000 0 g（精確到0.000 1 g）于50 mL 離心管中，加入0.5 g 氯化鈉及25.0 mL 甲醇溶液，以旋渦混合儀續(xù)高速震蕩提取2 min，定量濾紙過濾，準確移取10.0 mL 濾液并加入20.0 mL PBS 緩沖溶液或純水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1～2 次，至濾液澄清，備用。

2）凈化。準確移取15.0 mL 樣品提取液注入親和柱，使溶液以不超過2 mL/min 流速緩慢通過親和柱，待溶液全部流出后以10 mL 純水清洗柱子2次，棄去全部流出液，加入1 mL 甲醇洗脫，流速不超過1 mL/min，收集全部洗脫液于樣品瓶中，用氮吹儀在≤50 ℃下吹干，準確加入1.000 mL 流動相溶解，過濾后供色譜檢測用。

3）色譜測定。分別取相同體積樣品液和標準工作溶液（1、2、5、10、50 ng/mL）注入高效液相色譜儀，測定樣品溶液的響應(yīng)值（峰面積），樣品溶液與黃曲霉毒素B1標準溶液色譜圖比較得到試液中黃曲霉毒素B1的質(zhì)量濃度（ng/mL）。

1.3 數(shù)學模型

V，樣品提取溶液體積，單位為mL；

Vi，樣品的總稀釋體積，單位為mL；

ci，試液中黃曲霉毒素B1的質(zhì)量濃度，單位為ng/mL；

m，試樣質(zhì)量，單位為g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定結(jié)果

對試驗樣品重復測定7 次，稱量樣品質(zhì)量為5.000 0～5.002 3，提取后，樣液稀釋5 倍后進行測定，樣品中黃曲霉毒素B1含量為2.0～2.2 μg/kg，平均值為2.1 μg/kg，相對標準偏差為3.55%（表1）。

表1 黃曲霉毒素B1 的測定結(jié)果

2.2 質(zhì)量引入的不確定度urel（m）

天平引入的不確定度：從校準證書中可以找到所用的電子天平在稱量0≤m≤50 g 時，u（m）=0.17 mg（k=2），則其標準不確定度為：

試驗中稱量樣品質(zhì)量的平均值為m=5.000 2 g ，則質(zhì)量引入的相對標準不確定度為：

2.3 樣品試液處理過程體積引入的不確定度urel（v）

黃曲霉毒素B1提取和定容過程中引入的不確定度包括刻度移液管和移液器的允差和溫度引起的水的體積變化2 個部分，該過程引入的不確定度包括以下4 個方面。

1）由25 mL 刻度移液管產(chǎn)生的不確定度u（V1）：刻度移液管的證書所標示的擴展不確定度為0.02 mL（k=2），則25 mL 刻度移液管標準不確定度為：

由于試驗在20 ℃的環(huán)境下進行，在該試驗中用到的刻度移液管等其校驗證書上顯示的溫度均為20 ℃，因此由溫度引起的不確定度可忽略不計（以下容器相同），則在量取25 mL 溶液時，其相對標準不確定度為：

2）10 mL 刻度移液管產(chǎn)生的不確定度?？潭纫埔汗艿淖C書所標示的擴展不確定度為0.01 mL（k=2），則10 mL 刻度移液管標準不確定度為：

則在量取10 mL 溶液時，其相對標準標準不確定度為：

3）由100～1 000 μL 的移液槍產(chǎn)生的不確定度，從證書中可找出擴展不確定度（k=2），在制定樣品溶液定容時：量取1 000 μL 流動相溶解黃曲霉毒素B1，其相對標準不確定度為：

4）將urel(V1）、urel（V2）、urel（V3）合成，得體積引入的相對標準不確定度為：

2.4 標準曲線引入的不確定度urel（b）

1）標準品引入的不確定度urel（b1）。本試驗所用的黃曲霉毒素B1標準溶液質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL，證書中標示的擴展不確定度為0.03 μg/mL（k=2），黃曲霉毒素B1標準溶液的標準不確定度為：

2）標準曲線最小二乘法擬合引入的不確定度urel（b2）。對黃曲霉毒素B1的標準溶液的每個濃度測量3 次，共15 次，測得濃度與峰面積的對應(yīng)值（表2）。以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，擬合曲線方程y=ax+b，得到回歸方程：A=3.7925C-0.5979（A：峰面積；C：標準濃度），相關(guān)系數(shù)R2=1。

表2 標準工作液濃度的峰面積

樣品試液質(zhì)量濃度為C0=2.1 ng/mL，p=7，n=15，測該擬合曲線的標準不確定度為：

7 次測得樣品試液的平均質(zhì)量濃度為2.1 ng/mL（表1），則其相對標準不確定度為：

式中：

a，標準曲線的斜率；

Aj，黃曲霉毒素B1工作溶液濃度相對應(yīng)的峰面積；

Cj，吸光值對應(yīng)的黃曲霉毒素B1工作溶液濃度；

C，黃曲霉毒素B1工作溶液的平均值；

c0，樣品試液檢測濃度的平均值；

p，測量樣品次數(shù)；

n，測量黃曲霉毒素B1工作溶液的次數(shù)。

3）儀器自身帶來的不確定度urel（b3）。從校準證書中找到所用的液相色譜儀1260 的擴展不確定度為5.2%（k=2），其相對標準不確定度為：

4）標準溶液稀釋、定容引入的不確定度urel（b4）。其不確定度主要是由100～1 000 μL 和10～200 μL的移液槍引入。黃曲霉毒素B1標準液稀釋的過程：移取1 000 ng/mL 黃曲霉毒素B1的標準溶液100 μL，加900 μL 流動相，配制成100 ng/mL 的黃曲霉毒素B1儲備標準溶液u（b4-1），取500 μL 儲備液+500 μL 流動相配制成50 ng/mLu（b4-2），取100 μL儲備液+900 μL 流動相l(xiāng) 配制成10 ng/mlu（b4-3），取50 μL 儲備液+950 μL 流動相配制成5 ng/mLu（b4-4）；取20 μL 儲備液+980 μL 流動相配制成2 ng/mlu（b4-5）；取500 μL 標準液（2.4.4.5）+500 μL流動相配制成1 ng/mLu（b4-6），100～1 000 μL 和10～200 μL 移液槍的擴展不確定度均為為：（k=2），其標準不確定度均為，根據(jù)稀釋步驟，可得稀釋過程中產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

標準溶液稀釋、定容引入的相對標準不確定度合成為：

5）標準曲線引入的相對標準不確定度合成urel（b）：

2.5 測量重復性引入的不確定度urel（x）

根據(jù)飼料中黃曲霉毒素B1含量分別進行7 次獨立測定的結(jié)果（表1），黃曲霉毒素B1含量的標準偏差為：

7 次測定黃曲霉毒素B1含量平均結(jié)果為2.1 μg/kg。

2.6 合成相對標準不確定度

將上述不確定度各個分量列于表3：

表3 測定飼料中黃曲霉毒素B1 的不確定度

計算合成相對標準不確定度采用各個相對標準不確定度平方后求和再開根，即合成相對標準不確定度urel：

2.7 擴展不確定度

樣品中黃曲霉毒素B1含量的平均值為=2.1 μg/kg，u（）=urel×=2.1×0.047= 0.098 7 μg/kg，取包含因子k=2，則其擴展不確定度為：U=0.0987×2=0.1974≈0.2 μg/kg

因此，親和柱凈化-高效液相色譜法測定飼料中黃曲霉毒素B1含量為（2.1±0.2）μg/kg（k=2）。

3 結(jié) 語

采用親和柱凈化-高效液相色譜法測定飼料中黃曲霉毒素B1含量，標準曲線引入的不確定度和重復性試驗的標準偏差引入的不確定度最大，在試驗過程中要注意這2 項不確定度的相關(guān)操作，以確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。