肝素親和柱在乳鐵蛋白檢測中的應用優(yōu)化

樓飛，楊秀敏，章寅

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學院莊行綜合試驗站，上海201415；2.沈陽市動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽110034；3.上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司，上海200436）

乳鐵蛋白是近年來國內(nèi)外開發(fā)研究速度較快的一種營養(yǎng)添加劑，由于其具有：廣譜抗菌，抗病毒感染作用；能調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵平衡；調(diào)解骨髓細胞的生成；抑制人體腫瘤細胞的作用；能同多種抗生素及抗真菌制劑協(xié)同作用，有效地治療疾病等功效，使其產(chǎn)品在國內(nèi)外食品加工中的應用范圍日益廣泛[1-2]。乳鐵蛋白是一種極具營養(yǎng)價值的活性糖蛋白，對嬰幼兒或者成人的健康具有重要的意義[3-4]。GB14880-2012我國《食品營養(yǎng)強化劑使用標準》中規(guī)定嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的最大允許使用量為1.0 g/kg，而目前國內(nèi)外未建立乳鐵蛋白測定相關的國家標準。文獻中報道的測定乳鐵蛋白含量的方法大致可以歸為以下幾類：酶聯(lián)免疫吸附法、十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、毛細管電泳法、高效液相色譜法和高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法[5-7]。

其中，酶聯(lián)免疫吸附法是將抗原、抗體特異性反應和酶的高效催化作用有機結(jié)合起來的一種新穎、快速的免疫學分析技術，具有靈敏度高、檢測限低、樣品無需純化等特點，因此該法應用范圍最廣、常用于包括初乳和乳粉等一系列產(chǎn)品中的乳鐵蛋白質(zhì)量濃度的測定，但該法所用試劑盒昂貴，不適于長期大量檢測乳鐵蛋白。SDS-PAGE法具有測定準確快速、操作簡便等特點，適用于初步分離效果的監(jiān)控，但對純度較低的乳鐵蛋白檢測時，由于乳鐵蛋白與其他雜蛋白分子量相近，很難達到分離，故僅適用于高純度的樣品測定。毛細管電泳法由于進樣量少，因而制備能力差，而且由于毛細管直徑比較小，造成了靈敏度較低，重現(xiàn)性差等一系列缺點。

高效液相色譜法擁有分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高，操作自動化等優(yōu)點，是目前食品檢測領域應用最廣泛的方法之一。乳鐵蛋白的等電點為8.2左右，是一種分子量為80 kDa，具有大約700個氨基酸殘基序列的單體糖蛋白，并連接1～2個配糖體（配糖體成分約占7%）[8-10]。乳鐵蛋白一共有兩個鐵離子結(jié)合位，每個結(jié)合位可以與一個鐵離子結(jié)合?，F(xiàn)已有多篇文獻研究報道應用高效液相色譜檢測乳制品中的乳鐵蛋白含量，前處理方法包括：（1）樣品采用脫脂，酸法去除酪蛋白，硫酸銨沉淀富集，纖維素濾膜過濾凈化等方法進行預處理[11-12]；（2）通過額外加入的二價鐵離子使乳鐵蛋白的構(gòu)型更利于沉淀，然后用體積分數(shù)60%乙醇溶液沉淀蛋白除去糖分，再用醋酸鹽緩沖液提取乳鐵蛋白并分離掉酪蛋白進行預處理[13-14]；（3）樣品采用0.5 mol/L氯化鈉溶液溶解，稀釋至適當濃度作為預處理等方法[15]。

肝素是一種含硫酸酯的酸性多糖，有文獻報道乳鐵蛋白可與這類多負電荷分子糖胺多糖通過親和層析結(jié)合[16-18]。本標準中采用HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素親和柱作為目標化合物純化和濃縮的前處理步驟[19-20]，由于是首次將該親和柱應用到乳鐵蛋白的檢測中，故對應用條件進行了摸索和優(yōu)化，包括：肝素親和柱的承載量、淋洗液和洗脫液的濃度、pH值等參數(shù)的優(yōu)化等，建立一種適合乳鐵蛋白檢測的前處理凈化方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乳鐵蛋白標準物質(zhì)（批號：SP113101）：Tatua公司提供；乙腈為（色譜純）：美國默克公司；無水乙醇、氯化鈉、磷酸、磷酸氫二鈉、三氟乙酸（均為分析級）：國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；超純水：美國賽默飛世爾科技有限公司；高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素親和柱：美國通用電氣醫(yī)療集團；Jouan Ceterifuge MR23i離心機：美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肝素親和柱的應用比較

本方法中采用HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素親和柱作為目標化合物純化和濃縮的前處理步驟。通過經(jīng)過和未經(jīng)過肝素親和柱純化的樣品色譜圖，分析其對乳鐵蛋白檢測應用的可行性。

1.2.2 肝素親和柱承載量的測定

該款肝素親和柱對乳鐵蛋白純化和濃縮的前處理步驟未有報道，親和柱的承載量對方法的準確度方面有很大的影響，故在本方法中進行了承載量的試驗。采用40 μg～10 000 μg不同的上柱量測定回收率的方式，選定承載量范圍值。

1.2.3 磷酸鹽濃度的優(yōu)化

前處理過程中需要分離純化乳鐵蛋白，故首先要求將乳鐵蛋白從基質(zhì)中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原先的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。故在本方法中進行磷酸鹽濃度的優(yōu)化，通過奶粉本底和加標回收率的測定，在磷酸鹽pH=7.0的條件下，依次選擇濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mol/L 進行比較。

1.2.4 磷酸鹽pH值的優(yōu)化

乳鐵蛋白是一種分子量為80 kDa，具有大約700個氨基酸殘基序列的單體糖蛋白，并連接1個～2個配糖體。對于這一類大分子量的蛋白質(zhì)，pH值對其的結(jié)構(gòu)有一定的影響。故在本方法中進行磷酸鹽pH值的優(yōu)化，通過奶粉本底和加標回收率的測定，在磷酸鹽濃度為0.2 mol/L的條件下，依次選擇pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 進行比較。

1.2.5 洗脫液鹽濃度的優(yōu)化

洗脫步驟屬于肝素親和柱使用過程中比較關鍵的步驟，在此步驟中乳鐵蛋白目標化合物將從親和柱中被洗脫下來，故洗脫液的濃度對整個試驗比較關鍵。選定Na2HPO4的濃度為0.05 mol/L，pH=7.0，設定4個不同濃度的 NaCl濃度即 0.25、0.50、1.0、2.0 mol/L，通過加標回收測定，選定最佳的NaCl濃度。

1.2.6 洗脫液pH值的優(yōu)化

同樣原理，選定0.05 mol/L的Na2HPO4，1.0 mol/L濃度的NaCl，設定5個不同的pH值即5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，通過加標回收測定，選定最佳的pH值。

1.2.7 肝素親和柱洗脫體積的測定

本方法中采用1 mL規(guī)格的HiTrapTMHeparin HP親和柱，乳鐵蛋白的上柱量控制在 100 μg～10 000 μg，試驗設計當乳鐵蛋白的上柱量為最大值即10 000 μg時，分別收集第 1 mL，第 2 mL，第 3 mL，第 4 mL，第5 mL，第6 mL～8 mL的洗脫液，上機測定。

1.2.8 自制肝素親和柱性能的比較

目前市場上使用率最高的肝素親和柱是由美國通用電氣醫(yī)療集團生產(chǎn)的HiTrapTMHeparin HP親和柱，為了驗證乳鐵蛋白檢測是否只能依靠該款親和柱，本試驗采用偶聯(lián)有肝素分子的瓊脂糖作為填料自制了一批肝素親和柱。將自制的肝素親和柱與Hi-TrapTMHeparin HP肝素親和柱在相同的試驗條件下進行回收率的測定。

1.3 液相色譜條件

色譜柱規(guī)格：C4，5 μm，300A°（孔徑），250 mm×4.6 mm（內(nèi)徑）；檢測波長：280 nm；柱溫：30℃；進樣體積：50 μL；流速：1.0 mL/min；流動相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈，梯度洗脫參數(shù)見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序表Table 1 Optimization of gradient elution

2 結(jié)果與分析

2.1 肝素親和柱的應用比較

圖1為經(jīng)過和未經(jīng)過肝素親和柱純化的樣品液相色譜比較圖。

圖1 肝素親和柱純化樣品比較色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of lactoferrin with heparin affinity column cleanup and without

從色譜圖1中可以看出未純化的樣品成分復雜，難以滿足檢測需要，經(jīng)過肝素親和柱純化的樣品，雜質(zhì)少，峰形好，符合檢測的要求。

2.2 肝素親和柱承載量的測定

1 mL HiTrapTMHeparin HP肝素親和柱對乳鐵蛋白承載量的測定結(jié)果見表2。

表2 1 mL HiTrapTMHeparin HP肝素親和柱對乳鐵蛋白承載量的測定（n=3）Table 2 Determination of the bearing capacity of lactoferrin by 1 mL HiTrapTMHeparin HP（n=3）

從表2可知，當乳鐵蛋白的上柱量達到100 μg時，1 mL規(guī)格的HiTrapTMHeparin HP肝素親和柱的回收率就達到90%以上，乳鐵蛋白的上柱量在100 μg～10 000 μg時，回收率在 93.8%～105%之間，符合試驗要求。故本試驗中將樣品中乳鐵蛋白的上柱量控制100 μg～10 000 μg之間，如果試驗中遇到高濃度乳鐵蛋白含量的樣品時，需將樣品稀釋至合適的濃度后再使用親和柱；反之則可適當增加稱樣量和上柱體積。

2.3 磷酸鹽濃度的優(yōu)化

磷酸鹽濃度的優(yōu)化結(jié)果見表3。

表3 磷酸緩沖液濃度優(yōu)化表（n=3）Table 3 Optimization of phosphate buffer concentration（n=3）

從表3數(shù)據(jù)得知，隨著磷酸緩沖液濃度的增加，回收率先增加后降低至零，當磷酸緩沖液濃度達到0.4 mol/L時，回收率為0，故選定乳鐵蛋白檢測時磷酸緩沖液濃度為0.2 mol/L，同時發(fā)現(xiàn)在該濃度下目標峰附近的雜質(zhì)最少，符合試驗要求。

2.4 磷酸鹽pH值的優(yōu)化

磷酸鹽pH值的優(yōu)化結(jié)果見表4。

表4 磷酸緩沖液pH優(yōu)化表（n=3）Table 4 Optimization of phosphate buffer pH（n=3）

從表4可知，隨著磷酸緩沖液pH值的增加，回收率先增加后降低，整體數(shù)值在72.3%～91.3%之間，當磷酸緩沖液pH值為8.0時回收率為最大，同時此pH值下目標峰附近的雜質(zhì)最少，符合試驗要求。

2.5 洗脫液鹽濃度的優(yōu)化

洗脫液鹽濃度的優(yōu)化結(jié)果見表5。

從表5可知，隨著NaCl濃度的增加，回收率相應增加。高濃度的NaCl有利于乳鐵蛋白從親和柱中的洗脫。但2.0 mol/L的NaCl容易造成液相色譜儀的損傷，不利于機器穩(wěn)定狀態(tài)的保持，故選定1.0 mol/L的NaCl作為洗脫濃度。

表5 洗脫液鹽濃度優(yōu)化表（n=3）Table 5 Optimization of NaCl concentration（n=3）

2.6 洗脫液pH值的優(yōu)化

洗脫液pH值的優(yōu)化結(jié)果見表6。

表6 磷酸緩沖液pH優(yōu)化表（n=3）Table 6 Optimization of phosphate buffer pH（n=3）

從表6試驗結(jié)果可以得知，不同的pH值下，回收率范圍為94.9%～98.0%，最高值和最低值的相對相差3.2%，故選定常規(guī)的pH=8。

2.7 肝素親和柱洗脫體積的測定

肝素親和柱洗脫體積的測定結(jié)果見表7。

表7 肝素親和柱洗脫體積的測定（n=3）Table 7 Optimization of elution volume（n=3）

由表7可知1 mL規(guī)格的HiTrapTMHeparin HP肝素親和柱，乳鐵蛋白的上柱量為10 000 μg時，收集到的第1 mL和第2 mL的洗脫液中乳鐵蛋白總的洗脫率達到96.5%以上，第3 mL洗脫液中乳鐵蛋白的洗脫率為 0.15%，第 4 mL，第 5 mL，第 6 mL～8 mL的洗脫液中未檢測到乳鐵蛋白，故本試驗中選定收集洗脫液的體積為3.0 mL。

2.8 自制肝素親和柱性能的比較

自制肝素親和柱性能的比較結(jié)果見表8。

表8 自制肝素親和柱性能的比較（n=3）Table 8 Comparison of the properties of homemade heparin affinity columns（n=3）

由表8可知，在相同的試驗條件下上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司的實驗室自制的親和柱平均回收率為97.6%，相對相差1.4%，HiTrapTMHeparin HP肝素親和柱的平均回收率100.4%，相對相差1.9%，柱效比較接近，證明同類型的肝素親和柱可以使用到本方法中用于乳鐵蛋白的檢測。

3 結(jié)論

本文首次提出將肝素親和柱應用到乳鐵蛋白檢測前處理過程中，優(yōu)化之后的前處理過程包括：試樣中的乳鐵蛋白經(jīng)磷酸氫二鈉溶液（0.20 mol/L，pH=8.00±0.5）提取，HiTrapTMHeparin HP 1 mL 規(guī)格的親和柱經(jīng)上述磷酸氫二鈉溶液活化后，上樣，經(jīng)過磷酸氫二鈉溶液淋洗，磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液（磷酸氫二鈉0.05 mol/L，NaCl 1 mol/L，pH=8.00±0.5）洗脫，并定容至3.0 mL，上機測定。本方法與文獻中報道的方法相比，具有檢測成本低、操作方便簡單、耗時較短、重復性好、靈敏度高的優(yōu)勢，能滿足目前乳鐵蛋白的日常檢測任務。