一種制備高存活性腸膜明串珠菌凍干制劑的方法

韓瑨，馮華峰，喬禎逸，吳正鈞

（光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436）

凍干粉是采用真空冷凍干燥技術(shù)將待凍干樣品中水分先行預(yù)凍，然后在真空無(wú)菌的環(huán)境下逐漸提高環(huán)境溫度，將樣品中的被凍結(jié)的水分升華而最終得到的干燥粉狀物。由于凍干粉的制備工藝可以極大限度的保留樣品原有的生物活性，因此，較多應(yīng)用于中草藥、乳酸菌等領(lǐng)域。以乳酸菌為例，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[1]、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）[2]、嗜酸乳桿菌[3]（Lactobacillus acidophilus）、動(dòng)物雙歧桿菌[4]（Bifidobacterium animalis）、乳酸乳球菌[5]（Streptococcus lactis）等常規(guī)乳酸菌的凍干保護(hù)技術(shù)已有大量研究和報(bào)道，而這些技術(shù)大多采用先發(fā)酵后收集菌體，再重懸于保護(hù)劑中冷凍干燥的傳統(tǒng)方法，盡管技術(shù)相對(duì)成熟，但在菌體收集和重懸過(guò)程中，往往伴有菌體損失、雜菌污染等不利因素或風(fēng)險(xiǎn)，因此，新型、高效且安全的凍干技術(shù)亟待解決。

明串珠菌屬細(xì)菌（Leuconostoc）是一類乳品生產(chǎn)中重要的商業(yè)化菌株，在分類學(xué)上隸屬于細(xì)菌界（Bacteria）—厚壁菌門(mén)（Firmicutes）—桿菌綱（Bacilli）—乳桿菌目（Lactobacillales）—明串珠菌科（Leuconostocaceae），廣泛分布于植物表面及發(fā)酵制品（泡菜、果酒等）中的腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）[6]、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）[7]等均為典型的明串珠菌。根據(jù)生物學(xué)特性的差異，腸膜明串珠菌又可分為4個(gè)亞種：右旋糖酐亞種（L.m.subsp.dextranicum）、乳脂亞種（L.m.subsp.cremoris）、腸膜亞種（L.m.subsp.mesenteroides）[8]以及蘇木亞種（L.m.subsp.suionicum）[9]。2012年5月8日，腸膜明串珠菌腸膜亞種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的論證，最終被《中華人民共和國(guó)食品安全法》和《新資源食品管理辦法》正式列入《可用于食品的菌種名單》，然而該菌株僅有的凍干技術(shù)[10]與上述常規(guī)乳酸菌基本類似，因此其凍干工藝面臨著與后者相同的問(wèn)題與風(fēng)險(xiǎn)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，L.mesenteroides BD1710（CGMCC NO.6432）可在預(yù)調(diào)pH值和添加蔗糖的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)糖[11]，并經(jīng)預(yù)試驗(yàn)證實(shí)上述發(fā)酵液的凍干粉中BD1710的存活率較高，因此，本文在前期優(yōu)化數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法繼續(xù)考察培養(yǎng)溫度、蔗糖濃度、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值4個(gè)因素對(duì)BD1710凍干存活率的影響，并對(duì)預(yù)測(cè)的優(yōu)選條件進(jìn)行驗(yàn)證和比較，最后評(píng)價(jià)凍干制劑的穩(wěn)定性以及該凍干技術(shù)的通用性。

1 材料與方法

1.1 菌種與試驗(yàn)材料

L.mesenteroides BD1710（CGMCC 0847）：光明乳業(yè)股份有限公司；L.mesenteroides LM57、LM79：丹尼斯科公司；L.mesenteroides ATCC10830a：美國(guó)菌種保藏中心。

M17瓊脂/液體培養(yǎng)基：英國(guó)奧克塞德公司；成熟番茄：市售；脫脂乳粉：光明乳業(yè)股份有限公司；蔗糖、海藻糖、NaOH、MnSO4（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SQ2130Z型榨汁機(jī)：上海帥佳電子科技有限公司；HVE-50型高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；SG-402TX型超凈工作臺(tái)：美國(guó)THE BAKER COMPANY公司；AVANTI J30I型高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)BECKMAN COULTER公司；HZQ-F160型搖床：蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-25型pH計(jì)：美國(guó)奧立龍公司；XW-80A型漩渦混合儀：上海青浦滬西儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵種子的制備

從 L.mesenteroides BD1710（CGMCC NO.6432）、LM57、LM79、ATCC10830a的凍存管中以接種環(huán)挑取少量菌粉劃線于M17蔗糖瓊脂培養(yǎng)（以2.0%蔗糖取代M17培養(yǎng)基中0.5%的乳糖，在120℃下滅菌20 min即得）上，置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃好氧培養(yǎng)24 h后取出，用接種環(huán)挑取單菌落接入1 mL M17蔗糖液體培養(yǎng)基中，采用渦旋混合儀將細(xì)胞均勻分散后，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后取出，再按2%接種量接種于50 mL上述M17蔗糖液體培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液經(jīng)15 000 r/min離心10 min后取沉淀，并以相同體積的無(wú)菌蒸餾水清洗3次后重懸，即得發(fā)酵用的種子。

1.3.2 培養(yǎng)基和傳統(tǒng)凍干保護(hù)劑的制備

番茄汁的制備：成熟番茄清洗、去皮，榨汁，果汁部分經(jīng)多層紗布過(guò)濾后，經(jīng)15 000 r/min離心10 min，取清液即得。

番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的制備：向100%的番茄汁中加入10%、15%、20%的蔗糖，加熱溶解并冷卻后，用5.0 mol/L食品級(jí)NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.0、7.0和8.0，在120℃下滅菌20 min即得相應(yīng)蔗糖濃度及初始pH值的無(wú)菌番茄汁蔗糖培養(yǎng)基。

傳統(tǒng)凍干保護(hù)劑的制備：將脫脂乳粉、海藻糖、蔗糖、MnSO4分別裝于透明包裝袋內(nèi)，進(jìn)行輻照滅菌后，在無(wú)菌條件下以無(wú)菌水溶解混合制成如下濃度的凍干保護(hù)劑：脫脂乳粉（10%）、海藻糖（3%）、MnSO4（0.25%）、蔗糖（4%），備用。

1.3.3 BD1710番茄汁蔗糖發(fā)酵液的制備及冷凍干燥

將1.3.1方法制備的L.mesenteroides BD1710發(fā)酵種子以2.0%接種量無(wú)菌操作接入1.3.2方法制備的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中，分別于15、25、35℃搖床（180 r/min）恒溫培養(yǎng)12、24、36 h即得發(fā)酵液。將上述方法制備的發(fā)酵液置于超低溫冷凍冰箱中預(yù)凍12 h后，置于冷阱溫度為-50℃的真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干24 h。

1.3.4 傳統(tǒng)方法制備BD1710凍干制劑

將1.3.1方法制備的L.mesenteroides BD1710發(fā)酵種子以2.0%接種量無(wú)菌操作接種于pH7.0，蔗糖濃度為15%的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h得發(fā)酵液，加入4倍無(wú)菌蒸餾水后8 000 r/min離心10 min，棄上清，向菌泥中加入1.3.2方法制備的傳統(tǒng)凍干保護(hù)劑（菌泥∶保護(hù)劑=1∶3，質(zhì)量比），用漩渦混合儀振蕩使菌均勻懸浮于保護(hù)劑中[10]。將上述方法制備的菌體重懸液置于超低溫冷凍冰箱中預(yù)凍12 h后，置于冷阱溫度為-50℃的真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干24 h。

1.3.5 凍干存活率的測(cè)定

利用M17平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)樣品凍干前（發(fā)酵液/菌體重懸液）和后（凍干粉）中的BD1710活菌總數(shù)，兩者的比值即為凍干存活率，計(jì)算公式如下：

凍干存活率/%=凍干后活菌總數(shù)（CFU）/凍干前活菌數(shù)（CFU）×100

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化因素的最佳水平

為了確定最佳的凍干工藝，參考前期BD1710產(chǎn)糖的優(yōu)選條件[11]，選取培養(yǎng)時(shí)間（A）、培養(yǎng)溫度（B）、初始pH（C）、蔗糖濃度（D）4個(gè)主要因素為自變量，凍干存活率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平表Table 1 Factors and levels of RSM

1.3.7 驗(yàn)證與比較試驗(yàn)

根據(jù)1.3.6方法得到的優(yōu)選條件以及1.3.4所述的傳統(tǒng)凍干方法[10]制備凍干制劑，對(duì)響應(yīng)面預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證并比較不同凍干技術(shù)的存活率差異。

1.3.8 凍干制備的穩(wěn)定性

將優(yōu)選發(fā)酵條件下制備的凍干制劑裝入無(wú)菌的鋁箔袋內(nèi)，分別置于常溫（25℃）和冷藏（4℃）條件下保存 12 個(gè)月，其中每隔 3 個(gè)月，即 0、3、6、9、12 個(gè)月取樣測(cè)定活菌總數(shù)。

1.3.9 凍干技術(shù)的適用性

參照優(yōu)化后的制備方法，分別發(fā)酵制備獲得L.mesenteroides BD1710（CGMCCNO.6432）、LM57、LM79、ATCC10830a的凍干制劑（n=3），測(cè)定各菌株的凍干存活率。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及回歸模型建立，運(yùn)用Origin Pro 2016、Excel 2013進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)及回歸分析

本研究選用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)多變量發(fā)酵體系中的研究因素（培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、初始pH值、蔗糖濃度）和評(píng)價(jià)因素（凍干存活率）的相關(guān)性和及其相互影響進(jìn)行分析，通過(guò)軟件（Design Expert 8.0.6）推算建立二次回歸數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而獲得優(yōu)選的發(fā)酵因素組合。

根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)的原理，設(shè)計(jì)N=29的四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中析因點(diǎn)24個(gè)，區(qū)域中心零點(diǎn)的重復(fù)試驗(yàn)5個(gè)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of RSM

續(xù)表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 Design and results of RSM

進(jìn)一步利用Design Expert 8.0.6對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型：凍干存活率（%）=88.20+15.08A+4.67B+7.67C+16.42D+0.75AB+8.50AC+1.50AD+6.00BC-4.75BD+3.50CD-14.64A2-21.27B2-29.27C2-12.89D2。該模型的 R2=0.9874，調(diào)整R2=0.974 8，說(shuō)明回歸方程與數(shù)據(jù)的擬合度較高，可解釋97.48%試驗(yàn)所得結(jié)果。

二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of the quadratic response surface regression model

該模型顯著（p＜0.000 1），且無(wú)失擬因素存在（失擬項(xiàng)p值為0.108 7＞0.05）。各因素的交互作用對(duì)菌體凍干存活率的影響順序?yàn)椋篈C（p，0.000 4）＞BC（0.006 1）＞BD（0.022 9）＞CD（0.080 7）＞AD（0.433 3）＞AB（0.692 7），其中，部分因素的交互作用（A和D、B和C）對(duì)凍干存活率的影響如圖1所示。

圖1 初始pH值和培養(yǎng)溫度、蔗糖濃度和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用對(duì)凍干存活率的影響Fig.1 The effect of the interactions of initial pH and cultivation temperature，sucrose concentration and cultivation time on the survival rate of freeze-drying

由圖1可知，各因素在所選范圍均存在響應(yīng)最高點(diǎn)，這與表3中模型的顯著性結(jié)果一致。根據(jù)二次回歸模型的預(yù)測(cè)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為29.61 h，培養(yǎng)溫度為29.49℃，初始pH值為7.34，蔗糖濃度為16.74%時(shí)，菌株BD710的最高凍干存活率可達(dá)95.57%。綜合考慮了后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)的可操作性，對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行修正：培養(yǎng)時(shí)間為29.5 h，培養(yǎng)溫度為29.5℃，初始pH值為7.3，蔗糖濃度為16.8%。

2.2 驗(yàn)證與比較試驗(yàn)

為驗(yàn)證預(yù)測(cè)值的可靠性，在優(yōu)選條件下制備凍干制劑（n=3），檢測(cè)菌株的凍干存活性能。同時(shí)，參照傳統(tǒng)工藝[10]（1.3.4所述方法）制備凍干制劑（n=3），繼而與前述優(yōu)化條件下獲得的凍干制劑進(jìn)行存活率的比較，結(jié)果如圖2所示。

經(jīng)驗(yàn)證，在優(yōu)化條件下，BD1710的凍干存活率均值為92.44%，基本與模型預(yù)測(cè)值（95.57%）處于同一水平，試驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)測(cè)值較佳的擬合度表明響應(yīng)面法對(duì)BD1710凍干工藝的優(yōu)化是有效的。

圖2 驗(yàn)證與比較試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of the validation and comparison experiments

另一方面，采用傳統(tǒng)的菌體收集、保護(hù)劑重懸等方法制備BD1710凍干制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凍干存活率（76.81%）與文獻(xiàn)報(bào)道持平，卻遠(yuǎn)低于本文優(yōu)化后的菌體保護(hù)效果，其原因可能是：一、BD1710代謝蔗糖產(chǎn)生了大量的高分子聚合物[11]；二、發(fā)酵底物中的蔗糖本身具有一定的凍干保護(hù)作用[12]，而番茄汁中的番茄紅素、VC等則是協(xié)助微生物有效規(guī)避氧毒害的天然抗氧化劑[13-14]；三、傳統(tǒng)工藝離心收集菌體時(shí)產(chǎn)生的剪切力，對(duì)菌體造成了物理傷害，使沉降菌體中的活菌數(shù)下降，進(jìn)而導(dǎo)致離心存活率的降低[15]，上述因素引起了兩種制備方法在終產(chǎn)品菌株存活性能方面的顯著性差異。

2.3 凍干制劑的穩(wěn)定性

將BD1710在優(yōu)選條件下制備的凍干制劑分別置于5℃和25℃（室溫）進(jìn)行12個(gè)月的保藏試驗(yàn)，保藏不同時(shí)間后活菌數(shù)的測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

圖3 BD1710凍干制劑在5℃和25℃保藏條件下的活菌數(shù)變化Fig.3 Viable counts changes in freeze-dried BD1710 preparation during stored in 5℃and 25℃

5℃冷藏條件下，BD1710凍干制劑中活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為 9.83～8.54（即活菌數(shù)為 6.80×109CFU/g～3.50×108CFU/g），而室溫25℃條件下，單位質(zhì)量?jī)龈芍苿┲蠦D1710的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為9.83～5.15（即活菌數(shù)為6.80×109CFU/g～1.40×105CFU/g）。該保藏試驗(yàn)結(jié)果表明，BD1710在低溫條件下的存活效果顯著優(yōu)于室溫的效果，前者的活菌數(shù)量可在長(zhǎng)達(dá)一年的保藏期內(nèi)穩(wěn)定維持在每克1億個(gè)（1.00×108CFU/g）以上，而后者的活菌數(shù)卻在保藏期內(nèi)嚴(yán)重下滑。這可能是由于低溫條件延緩了BD1710的代謝速率，有助于其凍干制劑具備至少12個(gè)月的活菌數(shù)保障能力，這種現(xiàn)象普遍存在于其他乳酸菌凍干制劑的保藏研究中，例如保藏在室溫的雙歧桿菌凍干制劑的存活能力下降幅最大，而隨著貯藏溫度的降低，存活性能逐漸提高，當(dāng)貯藏溫度為-18℃時(shí)，菌株的存活效果最佳[16]。

2.4 方法的通用性

在優(yōu)化條件下，分別發(fā)酵制備獲得L.mesenteroides BD1710 （CGMCC NO.6432）、LM57、LM79、ATCC10830a的凍干制劑（n=3），不同菌株的凍干存活率如圖4所示。

圖4 不同腸膜明串珠菌的凍干存活率Fig.4 Freeze-dried survival rates of different Leuconostoc mesenteroides

不同腸膜明串珠菌在相同條件下制備的凍干制劑的存活率差異很大。在各菌株的凍干制劑中，BD1710的存活率最高（92.44%），ATCC 10830（82.90%）次之，LM57（74.50%）最低，可能是菌株間生長(zhǎng)特性的差異決定了各自存活性能的不同，或與培養(yǎng)基中天然保護(hù)劑（蔗糖、VC）的消耗量有關(guān)，或受到凍干保護(hù)相關(guān)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響，或兼而有之。盡管各菌株凍干制劑的存活性能的高低不一、各不相同，但所有測(cè)試菌株的凍干存活率均達(dá)70%以上，表明經(jīng)腸膜明串珠菌發(fā)酵后番茄汁蔗糖培養(yǎng)基，直接冷凍干燥來(lái)制備凍干制劑的加工工藝具有一定的通用性，適用于其他的腸膜明串珠菌。

3 結(jié)論與討論

隨著當(dāng)代乳業(yè)技術(shù)的飛速發(fā)展，明串珠菌的重要性逐漸得到普遍的認(rèn)同，盡管它們的生理學(xué)和遺傳學(xué)的研究程度還不如其他乳球菌，卻隨處可見(jiàn)于各種乳制品發(fā)酵劑或乳品環(huán)境中，因此，被稱為非發(fā)酵劑乳酸菌（non-starter lactic acid bacteria，NSLAB）。研究顯示，明串珠菌具有調(diào)節(jié)腸道紊亂[17]、代謝果糖生成甘露醇[18]、合成 K 族維生素[19]、水解 α-半乳糖苷[20]、產(chǎn)細(xì)菌素[21]等益生功能，同時(shí)有助于形成干酪孔眼[22]、產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[23]。此外，腸膜明串珠菌還可在蔗糖的誘導(dǎo)下產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶，后者將蔗糖酶解并鍵合成右旋葡聚糖（dextran，大分子葡聚糖聚合物的一種）[24]，具備增粘、穩(wěn)定、乳化水體系以及持水性等加工性能[25]，可作為天然來(lái)源的穩(wěn)定劑或增稠劑來(lái)替代現(xiàn)有的合成添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)，然而與潛力巨大的應(yīng)用市場(chǎng)形成鮮明反差的是，目前所使用凍干保護(hù)技術(shù)依然相對(duì)傳統(tǒng)，這些技術(shù)的基本步驟為發(fā)酵、菌體收集、重懸、冷凍干燥，盡管工藝路線比較成熟，然而在菌體收集和重懸過(guò)程中，往往伴有菌體損失、雜菌污染等不利因素或風(fēng)險(xiǎn)，因此，研究與開(kāi)發(fā)腸新型的膜明串珠菌凍干制劑的生產(chǎn)工藝是滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求的必要前提。

本文采用響應(yīng)面法考察了培養(yǎng)溫度、蔗糖濃度、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值4個(gè)因素對(duì)BD1710凍干存活率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為29.5 h，培養(yǎng)溫度為29.5℃，初始pH值為7.3，蔗糖濃度為16.8%時(shí)，菌株BD710凍干存活率的理論值可達(dá)95.57%。進(jìn)一步的驗(yàn)證與比較試驗(yàn)顯示，實(shí)際值（92.44%）與理論值基本一致，并顯著優(yōu)于傳統(tǒng)工藝的凍干保護(hù)效果（76.81%）。另一方面，與傳統(tǒng)工藝相比，盡管由于凍干工藝的簡(jiǎn)易性致使所得的凍干粉純度有所欠缺，然而在菌株存活性能方法優(yōu)勢(shì)巨大。此外，該法制備的凍干制劑在低溫保藏條件下具有一定的穩(wěn)定性，保藏于4℃的凍干制劑其活菌數(shù)量可在12個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定維持在每克1億個(gè)（1.00×108CFU/g）以上，并且此工藝通用性強(qiáng)，適用于其他腸膜明串珠菌凍干制劑的生產(chǎn)。