黃曲霉毒素免疫親和柱重復(fù)利用的探討

趙麗元 郝愛魚 劉英慧

免疫親和柱是20世紀(jì)90年代在分析領(lǐng)域得到應(yīng)用的一種新技術(shù)，它是將一定量的單克隆抗體偶聯(lián)在合適的擔(dān)體上，制成相應(yīng)的免疫親和柱。該柱具有高選擇性吸附和抗干擾的特性，凈化效果好，檢測(cè)靈敏度高，是目前國際上較為常用的檢測(cè)真菌毒素樣品前處理方法之一[1]?！吨袊幍洹?010年版一部[2]、《歐洲藥典》7.0[3]、GB/T 18979-2003[4]中均采用該方法進(jìn)行黃曲霉毒素的測(cè)定。隨著《中國藥典》中收載需檢測(cè)黃曲霉毒素的中藥材和制劑的品種的增加，以及中藥中黃曲霉毒素殘留研究的深入[5-9]，免疫親和柱的使用將會(huì)越來越廣泛。但從文獻(xiàn)報(bào)道來看，免疫親和柱的使用條件和回收處理?xiàng)l件研究并不是很多。僅有王瑩等[1]人對(duì)M1免疫親和柱的制備及使用條件進(jìn)行了優(yōu)化；李佩暖等[10]人對(duì)黃曲霉毒素前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化；李衛(wèi)崗等[11]人重復(fù)使用了3次無明顯影響。以上文章是以牛奶和花生為樣品對(duì)黃曲霉毒素免疫親和柱前處理方法進(jìn)行的研究，未見有人以中藥材為樣品對(duì)黃曲霉毒素免疫親和柱的回收純化及重復(fù)利用進(jìn)行研究，本文即以中藥材為樣品對(duì)黃曲霉毒素免疫親和柱的重復(fù)利用的影響因素進(jìn)行研究。目前，黃曲霉毒素免疫親和柱的生產(chǎn)廠家較少，美國VICAM，德國LC-Tech及北京華安麥科生物技術(shù)有限公司為較常見，價(jià)格在100～200元范圍內(nèi)。由于此免疫親和柱為一次性使用，不建議重復(fù)使用，因此一份樣品的檢驗(yàn)成本就要近200元，對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)室或?qū)⑦M(jìn)行黃曲霉素的深入研究的實(shí)驗(yàn)室，檢驗(yàn)或科研成本將大大增加，從而限制了黃曲霉毒素的研究工作的開展。本文選用了使用最廣泛的美國VICAM公司的AflaTest@P免疫親和柱為研究對(duì)象，對(duì)其重復(fù)利用的影響因素進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

2695e高效液相色譜儀；光衍生器UVE(LC Tech公司)；黃曲霉毒素混合對(duì)照品(Supelco公司；批號(hào)：LB82382)；免疫親和柱(AflaTest@P, 1 mL, VICAM公司)。

2 方法

2.1供試品溶液的制備 供試品溶液制備方法參考《中國藥典》2010年版一部。PBS緩沖液：2.9 g Na2HPO4·12H2O+ 0.27 g KH2PO4+ 0.2 g KCl+ 8.0 g NaCl用超純水溶解至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至7.4，加熱煮沸，冷卻待用。

2.2使用過的免疫親和柱的處理方法 使用過的免疫親和柱用5 ml水洗，5 mlPBS緩沖液過柱，洗后用PBS緩沖液填充柱子，室溫放置1～2 h后，置2～8℃冰箱內(nèi)放置過夜。

2.4色譜條件 用Zobax SB-C18色譜柱，以乙腈-甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫。

3 結(jié)果

3.1無基質(zhì)干擾時(shí)親和柱重復(fù)利用情況 取黃曲霉毒素對(duì)照品33 ng(黃曲霉毒素B112.5 ng)，用水稀釋成甲醇濃度14%的溶液作為樣品溶液，進(jìn)行回收試驗(yàn)，重復(fù)使用4次，結(jié)果見表1。

表1 無基質(zhì)干擾時(shí)親和柱回收試驗(yàn)結(jié)果

由表1 可見，親和柱經(jīng)過四次試驗(yàn)，回收率的結(jié)果無明顯差異，仍在90%以上，由此可見，在藥材干擾的情況下，親和柱可重復(fù)使用4次。

3.2不同中藥材使用后親和柱重復(fù)利用情況

3.2.1陰性與陽性中藥材使用后親和柱重復(fù)利用情況 取澤瀉(陰性樣品)和澤瀉+33 ng黃曲霉毒素(陽性樣品)進(jìn)行考察，結(jié)果見表2和3。第一次：制備陰性中藥材和陽性中藥材使用一次后的親和柱;第二次：均加入澤瀉+33 ng黃曲霉毒素考察回收率;第三次：均加入澤瀉+33 ng黃曲霉毒素考察回收率。

表2 陰性樣品回收試驗(yàn)結(jié)果

表3 陽性樣品回收試驗(yàn)結(jié)果

由表2和表3可見，親和柱經(jīng)過三次試驗(yàn)，無論是陰性樣品柱還是陽性樣品柱，回收率的結(jié)果無明顯差異，黃曲霉毒素總量第二次使用后回收率為82.4%和79.2%，第三次使用后回收率為64.0%，63.9%，因此中藥材中是否含有黃曲酶毒素不是影響親和柱回收利用的主要因素。從結(jié)果可見，黃曲霉毒素的回收率隨著使用次數(shù)的增加在逐漸降低，特別是G2回收率降低明顯，第二次使用后回收率降低至16.2%和22.5%，第三次使用后回收率降低至3.7%，4.1%。分析原因可能是澤瀉中某些物質(zhì)對(duì)親和柱中抗體造成破壞或抑制其結(jié)合，因此作者進(jìn)行不同的中藥材親和柱重復(fù)利用的考察。

3.2.2種子類中藥材親和柱重復(fù)利用情況 選取容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的種子類中藥材杏仁，薏苡仁和柏子仁進(jìn)行親和柱的回收情況的考察，每份樣品中同時(shí)加入33 ng黃曲霉毒素對(duì)照品進(jìn)行回收，結(jié)果見表4。

表4 種子類中藥材回收考察結(jié)果

由表4可見，親和柱經(jīng)過三次試驗(yàn)，杏仁和薏苡仁的回收率無明顯降低，黃曲霉毒素總量以及G1,B2,B1均在90%以上，G2略有降低，但也在65%以上。柏子仁黃曲霉毒素總量以及G1,B2,B1能達(dá)到85%以上，但G2降低較大，僅達(dá)49%。從結(jié)果可見，種子類中藥材也存在一定的差異，黃曲霉毒素總量以及G1,B2,B1隨著使用次數(shù)的增加回收率影響不大，可以重復(fù)使用。而部分品種對(duì)G2的影響較大，不易重復(fù)利用。

3.2.3根莖類(含生物堿等活性成分)中藥材親和柱重復(fù)利用情況 選取根莖類(含生物堿等活性成分)中藥材苦參，三七，玄參進(jìn)行親和柱重復(fù)利用情況的考察，每份樣品中同時(shí)加入33 ng黃曲霉毒素對(duì)照品進(jìn)行回收，結(jié)果見表5。

3.3親和柱處理方法對(duì)重復(fù)利用的影響 取黃曲霉毒素對(duì)照品33 ng進(jìn)行研究。免疫親和柱加入對(duì)照品33 ng凈化后：①立即用水-PBS洗滌，過夜放置；②用水-PBS洗滌后立即使用(考察復(fù)性時(shí)間的影響)；③空氣中暴露3 h后，水-PBS洗滌，過夜放置(考察空氣暴露的影響)；④甲醇中浸泡3 h后，水-PBS洗滌，過夜放置(考察有機(jī)溶劑的影響)；再加入對(duì)照品33 ng過柱凈化，回收結(jié)果見表6。

表5 根莖類(含生物堿等活性成分)中藥材回收考察結(jié)果

由表5可見，親和柱經(jīng)過三次試驗(yàn)，苦參，三七，玄參黃曲霉毒素總量及各組分回收率均有降低，其中降低最明顯的G2分別降低至33%，23%，50%，其次B2降低至67%,74%,83%，B1、G1和總量降低較少，回收率可達(dá)70%以上。由此可見，根莖類(含生物堿類活性成分)中藥材中可能存在某些物質(zhì)使親和柱上的抗體脫落或抑制其結(jié)合，從而使回收率降低較多，不建議重復(fù)利用。

表6 親和柱不同的處理方法對(duì)重復(fù)利用的影響

由表6可見，親和柱使用后立即重復(fù)使用，抗體沒有復(fù)性的時(shí)間，G2回收率下降了95.6%，總回收率下降了33.7%；抗體在空氣中暴露至3 h，G2回收率下降了78.5 %，總回收率下降了24.9%；甲醇可以使抗體變性，當(dāng)時(shí)間長時(shí)，可以造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，當(dāng)甲醇中時(shí)間長達(dá)3 h，G2回收率下降93.2%，總回收率下降了16.6%。

4 討論

4.1黃曲酶毒素免疫親和柱的凈化受很多因素的影響，Siu-Po等人考察了較低pH值[9]對(duì)免疫親和柱的回收有很大的影響，很多在提取液中pH值較低(pH 4以下)的中藥材其回收率均較低，特別對(duì)黃曲霉素G2的影響更大，因此通過在稀釋溶液中加入0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液可提高其回收率。在對(duì)中藥材進(jìn)行回收率的考察時(shí)，作者對(duì)樣品的提取液同時(shí)進(jìn)行了pH值的測(cè)定，結(jié)果均在6～8之間，因此排除了pH值低對(duì)回收率的影響。

4.2免疫親和柱上偶聯(lián)的抗體屬于蛋白質(zhì)類，在某些條件比如有機(jī)溶劑，失去緩沖條件等條件下可能變性失活。因此免疫親和柱使用后，應(yīng)立即用水或PBS洗滌，盡可能縮短空氣中暴露的時(shí)間，并需要4℃放置使抗體充分復(fù)性。

4.3在研究時(shí)作者采用了黃曲霉毒素對(duì)照品33 ng(黃曲霉毒素B112.5 ng)進(jìn)行的回收考察，其濃度比樣品進(jìn)行三水平回收率最高濃度略高，其目的是考察柱子在進(jìn)行回收率考察后是否可以重復(fù)利用。

通過對(duì)照品無基質(zhì)條件下的考察，在柱容量范圍內(nèi)，親和柱的重復(fù)利用不會(huì)對(duì)回收率有顯著影響，而樣品中是否含有黃曲酶毒素也不會(huì)顯著影響樣品的回收率。在對(duì)3種種子類中藥材(杏仁，薏苡仁，柏子仁)進(jìn)行考察時(shí)，除柏子仁中G2降低明顯外，其余回收率均無明顯降低，因此親和柱可以重復(fù)利用，這與李佩暖等[10]人以花生為樣品進(jìn)行親和柱的重復(fù)利用考察結(jié)果基本一致。在對(duì)4種根莖類中藥材(澤瀉，苦參，三七，玄參)的考察時(shí)，回收率均降低較多，而G2更是最容易受影響部分，因此親和柱不利于重復(fù)利用，這可能與根莖類中藥材復(fù)雜的化學(xué)成分(如生物堿，黃酮，皂苷等活性物質(zhì))有關(guān)，從而使抗體脫落或抑制抗體結(jié)合，最終原因有待深入研究。

4.4本研究為中藥材檢測(cè)中黃曲酶毒素免疫親和柱的重復(fù)利用研究建立一種方法，對(duì)于不同品種使用后的親和柱是否可重復(fù)利用需要具體考察，如回收率無明顯降低，即可以重復(fù)利用，從而大大降低試驗(yàn)成本。

[1] 王瑩,柳家鵬.黃曲霉毒素M1免疫親和柱的制備及使用條件優(yōu)化.中國奶牛,2011,1: 44.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010附錄IX V, 61.

[3] 歐洲藥典委員會(huì).歐洲藥典.歐洲藥品質(zhì)量管理局，2010.

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[5] 馮旭,孔維軍,楊美華.中藥中真菌毒素檢測(cè)方法的最新研究進(jìn)展.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2012(5):1944.

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