血凝抑制試驗在檢測應(yīng)用中常見的問題及對策

敖義鵬，何強治，周志鵬，屈富波，招昌君

陜西省城固縣畜牧獸醫(yī)工作站，陜西 城固 723200

新城疫、禽流感等有血凝素(HA)的病毒能凝集人或動物紅細(xì)胞，稱為血凝現(xiàn)象，血凝現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體抑制稱為血凝抑制試驗，這是一種利用抗原抗體的特異性反應(yīng)來測定抗原或抗體的檢測技術(shù)，該技術(shù)是目前WTO 進(jìn)行全球禽流感監(jiān)測普遍采用的試驗方法[1]，具體就是制備1%的禽無抗紅細(xì)胞懸液，測定抗原效價，然后根據(jù)抗原效價配制4 IU 抗原，再用4 IU 抗原測定抗體，如果待檢樣品中有抗體，抗體會與抗原結(jié)合，紅細(xì)胞就會沉淀于微量反應(yīng)板孔底，傾斜微量反應(yīng)板時，紅細(xì)胞就會出現(xiàn)流淌現(xiàn)象，如待檢樣品中沒有抗體，則抗原就會與紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，傾斜反應(yīng)板時，紅細(xì)胞就不會發(fā)生流淌現(xiàn)象，根據(jù)這一方法判定抗原或抗體效價高低。

1 常見問題

1.1 紅細(xì)胞懸液制備問題

在紅細(xì)胞懸液制備時，常見問題主要有：供制備紅細(xì)胞懸液的禽的選擇不符合要求，如供制備紅細(xì)胞的禽為非無抗禽，供樣禽數(shù)量不符合要求，紅細(xì)胞溶血、配制濃度不達(dá)標(biāo)等。

1.2 抗原配制問題

抗原效價測定不準(zhǔn)確，其他相關(guān)因素控制不嚴(yán)引起抗原效價測定結(jié)果失真。

1.3 操作規(guī)范問題

移液槍頭不暢，移液器未經(jīng)校核定量，操作不規(guī)范（未按規(guī)定時間、劑量和順序操作），操作前試劑沒有混勻和預(yù)溫，實驗用器械未經(jīng)嚴(yán)格清洗消毒造成的污染等。

1.4 結(jié)果判定問題

試驗條件不成立，不符合判定標(biāo)準(zhǔn)，不在規(guī)定時間內(nèi)判定結(jié)果，對判定依據(jù)把握不準(zhǔn)確等。

2 對 策

2.1 規(guī)范制備紅細(xì)胞

1）非免疫雞的選擇：供制備1%紅細(xì)胞的雞，必須是未免疫新城疫、禽流感疫苗、未發(fā)生相應(yīng)疫病的公雞，至少2～3 只。

2）防止溶血：采血時避免外源污染，采血針頭應(yīng)選擇較大號的，抽吸時用力不要過大，采雞血前先吸取3～5 mL 稀釋液可有效防止采樣過程中的溶血或血液凝固（特別是高溫情況下，雞血凝固速度較快），避免酒精接觸雞血或紅細(xì)胞，采集的雞血應(yīng)該溶于預(yù)先準(zhǔn)備好的經(jīng)過滅菌處理的PBS 液中，并輕輕混勻，在離心制備紅細(xì)胞前不能長期靜置，防止血液凝固。異物也容易引起血液凝固。

3）制備1%雞紅細(xì)胞：洗滌紅細(xì)胞時，應(yīng)先混勻紅細(xì)胞，取上層紅細(xì)胞懸液用于離心，避免凝集血塊夾雜其中；紅細(xì)胞洗滌要徹底，一般至少3～5 次，充分去除其他非紅細(xì)胞成分；離心速度一般1 800～2 500 r/min、5～8 min，初次離心選擇較低速度，防止高速離心造成紅細(xì)胞堆積過緊實出現(xiàn)粘連，隨著洗滌次數(shù)的增加，離心速度依次增加、時間延長；制備的紅細(xì)胞體積符合要求，若離心速度低、時間短，紅細(xì)胞因夾雜過多洗滌液、紅細(xì)胞壓積不實，則制備的紅細(xì)胞濃度會小于目標(biāo)濃度；在實際操作中，往往需采集2～3 只公雞血液用于制備1%的雞紅細(xì)胞，有時也會出現(xiàn)紅細(xì)胞部分溶血現(xiàn)象，只要對紅細(xì)胞進(jìn)行充分洗滌，仍可制備出符合要求的紅細(xì)胞；判定紅細(xì)胞是否溶血的技巧是將制備好的1%的雞紅細(xì)胞懸液靜置后，看上清液是否澄清，若清澈說明合格，若呈紅色說明紅細(xì)胞有溶血現(xiàn)象[2]，應(yīng)棄去重新制備。

4）紅細(xì)胞制備效果評判依據(jù)：離心紅細(xì)胞時若洗滌液逐步變清，表明紅細(xì)胞制備比較成功；將制備的紅細(xì)胞移入PBS 稀釋液時，有明顯的云霧狀擴(kuò)散現(xiàn)象，表明紅細(xì)胞制備較好。如紅細(xì)胞經(jīng)離心后，上清液始終呈紅色，數(shù)次離心后仍呈紅色，表明紅細(xì)胞有溶血，則制備的紅細(xì)胞不可用；如果紅細(xì)胞加入稀釋液中呈紅色，且經(jīng)過數(shù)小時仍呈紅色，表明紅細(xì)胞有溶血現(xiàn)象，不可用；制備的紅細(xì)胞若出現(xiàn)凝血塊，紅細(xì)胞不可用。

1%雞紅細(xì)胞應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，確需延長時間使用時，應(yīng)在2～8 ℃下保藏，時間一般不超過3 d。在使用1%雞紅細(xì)胞前，應(yīng)先觀察上清液是否澄清，若上清液渾濁或容器底部紅細(xì)胞平鋪不均勻、有結(jié)塊現(xiàn)象等，則不可用。

2.2 精準(zhǔn)操作

1）正確制備紅細(xì)胞懸液是精準(zhǔn)測定抗原效價的前提。1%雞紅細(xì)胞制備的準(zhǔn)確性，影響抗原和抗體效價的測定，若制備的紅細(xì)胞濃度增大，則抗原、抗體效價測定時會被降低，因此必須準(zhǔn)確配制1%雞紅細(xì)胞懸液。

2）準(zhǔn)確配制4 IU 抗原。每次試驗時，都要對抗原進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化測定，4 IU 抗原盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，用測定抗原效價的同批次1%的紅細(xì)胞進(jìn)行試驗檢測，防止不同批次的1%的紅細(xì)胞因濃度差異而影響抗體效價準(zhǔn)確測定。按照血凝抑制試驗操作步驟進(jìn)行4IU 抗原配制，完成配制后，應(yīng)對4 IU 抗原再進(jìn)行一次抗原效價測定（回歸試驗），若4 IU 抗原效價為2 log2，試驗有效，表明4 IU 抗原配制準(zhǔn)確，否則應(yīng)重新配制[3]，4 IU 抗原配制濃度高了易出現(xiàn)樣品抗體假陰性，反之易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此必須精準(zhǔn)配制4IU 抗原。

3）待檢血清必須符合檢測要求。待檢血清必須清亮，無溶血、無果凍樣凝固、無腐敗變質(zhì)、無紅細(xì)胞等物質(zhì)摻雜。若血清中含有紅細(xì)胞，在進(jìn)行抗體效價測定時會出現(xiàn)比實際值高的現(xiàn)象。要嚴(yán)防樣品腐敗變質(zhì)，血清或抗體的主要成分是蛋白質(zhì)，如儲運不當(dāng)，可導(dǎo)致其變質(zhì)變性，從而影響檢測結(jié)果。為防止禽血清出現(xiàn)果凍樣凝固，盡可能采集青年禽血樣，采樣宜在禽進(jìn)食前進(jìn)行，采集的禽血清以自然析出最佳，確需離心時應(yīng)靜置2 h 以上再進(jìn)行離心。供樣動物機(jī)體狀況對結(jié)果也有影響，若動物脫水、血液濃稠度高等對抗體濃度也有影響。

4）準(zhǔn)確定量。如稀釋液、紅細(xì)胞懸液、抗原、樣品等配制濃度必須準(zhǔn)確、使用前充分混勻，使用時準(zhǔn)確量取，對反應(yīng)時間和結(jié)果判定時間要嚴(yán)格控制。在使用多道移液槍時，操作人員要注意觀察移液器吸頭液面高度，若出現(xiàn)不一致，可能是滴頭堵塞或是移液器出現(xiàn)故障，應(yīng)及時排除影響。

5）嚴(yán)格比對。對待檢樣品進(jìn)行檢測前，一定要做好“3 個對照”即陽性對照、陰性對照和空白（稀釋液）對照，只有3 個對照成立，檢測結(jié)果才有效。

2.3 科學(xué)研判結(jié)果

1）判定標(biāo)準(zhǔn)：抗原效價測定時的判定標(biāo)準(zhǔn)是“能使紅細(xì)胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度”，樣品抗體效價測定時的判定標(biāo)準(zhǔn)是“以完全抑制4 單位抗原的血清最高稀釋度”[4]，上述2個判定標(biāo)準(zhǔn)必須準(zhǔn)確把控，不得用“50%凝集”判定。同時判定紅細(xì)胞沉淀還是凝集時，一定要結(jié)合紅細(xì)胞均勻分布于稀釋液體系還是沉淀于孔底、形狀、色澤以及傾斜反應(yīng)板觀察時的紅細(xì)胞流動狀態(tài)，如流淌速度、長度和數(shù)量等綜合研判。

2）正確判定：判定結(jié)果時，應(yīng)將反應(yīng)板傾斜45～60°進(jìn)行觀察，紅細(xì)胞完全凝集時，均勻布于反應(yīng)孔中，有時紅細(xì)胞凝集時會出現(xiàn)片狀凝集甚至皺縮成團(tuán)（超凝）現(xiàn)象，易與紅細(xì)胞的沉淀現(xiàn)象混淆，可通過3 種方法鑒別：一是察顏色：紅細(xì)胞完全凝集或出現(xiàn)超凝時，紅細(xì)胞均勻分布于反應(yīng)孔中略呈灰色，如果因超凝形成可見凝集物時的凝集物顏色往往呈灰色或灰褐色，與正常沉淀的紅細(xì)胞的鮮紅色形成鮮明對比；二是觀狀態(tài)：紅細(xì)胞完全凝集時，紅細(xì)胞呈均勻分布狀態(tài)，且在反應(yīng)孔底內(nèi)呈連續(xù)、整齊、均勻分布，偶爾也會出現(xiàn)凝集片、甚至凝集片狀物邊緣不整齊或出現(xiàn)皺縮（超凝）現(xiàn)象；紅細(xì)胞沉淀時，會在反應(yīng)孔底出現(xiàn)紐扣狀沉淀，且有向孔底集中趨勢；在PBS 液對照孔結(jié)果正確的情況下，將血凝板傾斜，從背側(cè)觀察，結(jié)果更加清晰[5]；三是看規(guī)律：試驗中，樣品是按照對倍規(guī)律稀釋的，沉淀或凝集反應(yīng)也是有規(guī)律的，加入紅細(xì)胞后，同一樣品的對倍稀釋孔會出現(xiàn)由沉淀到凝集或者由凝集到沉淀的有規(guī)律狀態(tài)，如果出現(xiàn)個別孔結(jié)果異常，表明試驗操作不當(dāng)，應(yīng)重新進(jìn)行檢測。當(dāng)傾斜反應(yīng)板時，沉淀的紅細(xì)胞對照孔會出現(xiàn)“流淚”現(xiàn)象，且紅細(xì)胞流淌速度、長度和數(shù)量正常；出現(xiàn)超凝的反應(yīng)孔一般不會出現(xiàn)紅細(xì)胞流淌，或者凝集物流淌極為緩慢；要注意樣品孔與紅細(xì)胞對照孔紅細(xì)胞的狀態(tài)對比，一般陰性時則表現(xiàn)同步流淌，且流淌速度、數(shù)量和線形基本一致，反之亦然。

2.4 嚴(yán)控試驗條件

1）溫度和時間：該試驗一般宜在15～25 ℃條件下進(jìn)行，HA 和HI 試驗中加入紅細(xì)胞后判讀結(jié)果的時間一般為30～40 min，具體參照紅細(xì)胞對照孔，對照孔完全沉淀時要迅速判讀結(jié)果。溫度高則反應(yīng)速度加快，判讀時間縮短，但溫度過高（超過37 ℃），凝集的紅細(xì)胞容易洗脫，紅細(xì)胞很快沉淀下來，導(dǎo)致試驗不成立[6]；溫度低，則反應(yīng)速度減緩，判讀時間延長。同時要適時掌握判讀時間，判讀時間過早，出現(xiàn)凝集不全，判讀時間過遲，會出現(xiàn)洗脫現(xiàn)象，亦會影響結(jié)果的準(zhǔn)確判定。

2）樣品質(zhì)量：血清樣品應(yīng)澄明、無污染、無雜質(zhì)、無紅細(xì)胞，否則會影響實驗結(jié)果；注意消除非特異性凝集因子影響，盡可能采集同種家禽的血制備紅細(xì)胞懸液。

3）試劑貯用：試劑保藏、運輸必須在適宜的溫度范圍內(nèi)，嚴(yán)防高溫、反復(fù)融凍、曝曬、劇烈震蕩等不利因素對試劑效價的影響，試劑、1%雞紅細(xì)胞、PBS 液等使用前都要充分混勻并預(yù)溫后使用[7]，抗原和抗體都要現(xiàn)配現(xiàn)用，確需延長使用時間，一般應(yīng)在2～8 ℃條件下保藏，不超過3 d，否則影響試驗結(jié)果。

4）試驗環(huán)境：所有試劑盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，確需延長使用時間的，一定要按要求規(guī)范保藏；所有操作應(yīng)在無菌環(huán)境中進(jìn)行；容器、稀釋液等均應(yīng)經(jīng)嚴(yán)格滅菌、消毒。

5）操作規(guī)范：移液器、天平等定量工具要定期校核；血凝板選用90°板，不得用110°板，否則影響試驗結(jié)果；配制PBS 液所用試劑磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀等4 種試劑構(gòu)成穩(wěn)定的緩沖體系，確保試驗結(jié)果的穩(wěn)定呈現(xiàn)，一般不宜用生理鹽水等代替[8]；對投入試驗的所用器械、PBS 液等要嚴(yán)格消毒，防止污染；在進(jìn)行抗原效價測定時，應(yīng)該做3 個重復(fù)，取至少2 個測定結(jié)果一致的數(shù)值作為抗原效價測定值；待檢樣品對倍稀釋要規(guī)范，判定方法是：同一待檢樣品對倍稀釋后，顏色逐步變淡，均勻過渡，否則可能是漏加或重復(fù)加樣造成。