基于Wnt/β-連環(huán)素通路探討補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠的影響

王 健 張 馳

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，沈陽，110032)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OS)是一種全身骨代謝障礙性疾病，以骨量減少、骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加等為主要的病理改變[1]，容易引發(fā)骨折而致殘、致死，給患者造成很大痛苦。OS主要分為絕經(jīng)后、繼發(fā)性以及特發(fā)性3種，其中以絕經(jīng)后OS最為常見。該病好發(fā)于50歲以上人群，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球骨質(zhì)疏松患者約2億，美國絕經(jīng)后女性中30%左右患OS[2]，我國作為老年人口最多的國家，OS患病率不斷上升，50歲以上女性患病率已經(jīng)高達(dá)20.7%，而這些患者中50%有可能出現(xiàn)骨折[3]。雌孕激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙磷酸鹽等骨吸收抑制劑，以及氟制劑、甲狀旁腺激素等骨形成促進(jìn)劑，以及骨化三醇、鈣劑等骨礦化藥物是臨床上治療OS的主要藥物[4]，但長期使用不良反應(yīng)明顯。因此，國內(nèi)醫(yī)學(xué)界將新藥研究的重點(diǎn)放在了安全性相對(duì)較高的中藥制劑。補(bǔ)骨脂是治療OS的常用補(bǔ)益中藥，具有較好的抗骨質(zhì)疏松作用[5]，但究竟該藥何種成分如何發(fā)揮作用目前尚未明確。本研究從對(duì)Wnt/β-連環(huán)素(β-Catenin)信號(hào)通路的影響出發(fā)，探討補(bǔ)骨脂主要活性成分補(bǔ)骨脂素對(duì)去勢(shì)大鼠OS的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取12周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)健康雌性SD大鼠78只，體質(zhì)量240～280 g，平均體質(zhì)量(262.64±10.93)g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滇)K2014-0002。該研究經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：20170311)。將大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4只，飼養(yǎng)室內(nèi)安靜，溫度設(shè)定為19～23 ℃，相對(duì)濕度設(shè)定為45%～55%，定時(shí)通風(fēng)換氣，晝夜節(jié)律為12 h/12 h，飼以普通標(biāo)準(zhǔn)飼料和無菌過濾水，大鼠在籠內(nèi)自由活動(dòng)，每周更換墊料2～3次并嚴(yán)格消毒。

1.1.2 藥物 補(bǔ)骨脂素(安徽永純生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：YC-0139)，CAS號(hào)：66-97-7，純度：用高效液相色譜檢測(cè)含量≥98%，規(guī)格：10 mg/支，使用時(shí)用二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)溶解，雙蒸水稀釋配制成濃度為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL的補(bǔ)骨脂素溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；阿侖膦酸鈉片杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)：20170321)，規(guī)格：10 mg/片，使用時(shí)研碎成末，用DMSO溶解，雙蒸水稀釋配制成濃度為0.2 mg/mL的阿侖膦酸鈉溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；注射用青霉素鈉(桂林南藥股份有限公司，批號(hào)：20170402)，規(guī)格：每支80萬單位。

1.1.3 試劑與儀器 DMSO(北京凱瑞基生物科技有限公司，批號(hào)：201700526)；戊巴比妥鈉(湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司，批號(hào)：20170418)；大鼠護(hù)骨因子(Osteoprotegerin，OPG)、骨鈣蛋白(Osteocalcin，BGP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(無錫市東林科技發(fā)展有限責(zé)任公司，批號(hào)：20170602/20170722)；OPG、BGP免疫組化試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司，批號(hào)：20170704/20170629)；二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20170421)；總RNA抽提試劑盒(Trizol法)(上?？道噬锟萍加邢薰?，批號(hào)：20170317)；cDNA第一鏈合成試劑盒(深圳子科生物科技有限公司，批號(hào)：20170519)；低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 6，Lrp6)、糖原合酶激酶-3β(Glycogen Synthase Kinase-3,GSK-3β)、β-連環(huán)素(β-catenin)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)上游引物、下游引物合成(無錫英紐瑞生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20170427、20170409、20170418、20170329、20170506)。小動(dòng)物雙能X射線骨密度儀(MEDIKORS公司，韓國，型號(hào)：InAlyzer型)，Micro-CT小動(dòng)物活體影像系統(tǒng)(PerkinElmer公司，美國，型號(hào)：Quantum GX型)，離心機(jī)(Thermo Scientific公司，美國，型號(hào)：Sorvall ST 40R型)，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫吸附分析儀(Tecan公司，瑞士，型號(hào)：Freedom EVO 75型)，核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf公司，德國，型號(hào)：BioPhotometer D30型)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國，型號(hào)：iQ5型)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將所有大鼠編號(hào)，之后按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組13只及造模組65只。所有大鼠均禁食12 h，不禁水，稱重后給予0.2%戊巴比妥鈉溶液10 mL/g，腹腔注射以麻醉大鼠，麻醉滿意后將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，下腹部常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，于腹白線處作長度為2 cm的縱切口，逐層打開腹腔，造模組暴露兩側(cè)卵巢組織并切除，將卵巢周圍的血管以及輸卵管結(jié)扎；對(duì)照組大鼠僅暴露卵巢而不行切除術(shù)；依次縫合傷口，消毒。所有大鼠給予青霉素，每天10萬單位，腹腔注射，連續(xù)7 d以預(yù)防感染。手術(shù)12周后，采用InAlyzer型小動(dòng)物雙能X射線骨密度儀測(cè)定大鼠4、5腰椎及左、右股骨骨密度(Bone Mineral Density，BMD)，造模組BMD值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即為骨質(zhì)疏松模型建立成功[6]。實(shí)驗(yàn)過程中意外死亡或造模失敗的大鼠及時(shí)予以補(bǔ)充。然后將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、阿侖膦酸鈉組及補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組，每組13只。

1.2.2 給藥方法 模型組及對(duì)照組分別給予雙蒸水5 mL/kg灌胃；阿侖膦酸鈉組給予0.2 mg/mL阿侖膦酸鈉溶液5 mL/kg灌胃，1次/周；補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組分別給予0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL的補(bǔ)骨脂素溶液5 mL/kg灌胃。各組大鼠均給藥12周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 大鼠BMD檢測(cè) 末次給藥第2天，稱重后0.2%戊巴比妥鈉溶液15 mL/g，腹腔注射以麻醉大鼠，采用In Alyzer型小動(dòng)物雙能X射線骨密度儀檢測(cè)大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD。

1.2.3.2 Micro-CT測(cè)定大鼠骨形態(tài)學(xué)指標(biāo) BMD檢測(cè)完成后，采用Quantum GX型Micro-CT小動(dòng)物活體影像系統(tǒng)掃描大鼠右側(cè)股骨，掃描參數(shù)為：電壓60 kV，功率40 W，4幀，每轉(zhuǎn)0.72°；用配套軟件進(jìn)行整體和局部重建，截取二維、三維及局部骨小梁圖片，同時(shí)分析測(cè)定骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁數(shù)量(Tb.N)。

1.2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清OPG、BGP水平 Micro-CT檢測(cè)完成后，打開腹腔，自腹主動(dòng)脈取血4 mL，置于含有肝素的抗凝管內(nèi)，1 200×g離心10 min，分離血清，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)備檢；取凍存的血清，迅速解凍并恢復(fù)至室溫，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用Freedom EVO 75全自動(dòng)酶聯(lián)免疫吸附分析儀，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清OPG、BGP水平[7]。

1.2.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠骨組織OPG、BGP水平 處死大鼠，取雙側(cè)股骨組織，其中左股骨組織用10%中性甲醛進(jìn)行固定，然后采用脫鈣劑進(jìn)行脫鈣[8]，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，制成厚度為5 μm的石蠟切片→常規(guī)采用二甲苯脫蠟→梯度濃度乙醇逐級(jí)水化→3%過氧化氫處理20 min，使內(nèi)源性過氧化氫酶消除→磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)。洗片3次，5 min/次→胰蛋白酶處理切片30 min→PBS洗片3次，5 min/次→根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒，采用1∶1 000稀釋的兔抗OPG、BGP一抗處理切片，室溫2 h→PBS洗片3次，5 min/次→1∶2 000稀釋的二抗處理切片，室溫30 min→PBS洗片3次，5 min/次→試劑盒內(nèi)的卵白素-生物素-酶復(fù)合物染色(ABC)試劑處理切片1 h→PBS洗片3次，5 min/次→用DAB顯色試劑盒使切片顯色→常規(guī)脫水、透明、中性樹脂封固。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察，OPG、BGP表達(dá)陽性的細(xì)胞被染成棕黃色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)采集圖像，用Image J軟件分析OPG、BGP蛋白表達(dá)的平均光密度值(IOD)[7]。

1.2.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)大鼠骨組織Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表達(dá)水平 右股骨組織用生理鹽水浸濕，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)→將凍存的股骨組織剪碎后液氮研磨成粉→加入TRIzol溶液，充分勻漿10 min→按照RNA抽提試劑盒的說明操作提取總RNA→用焦碳酸二乙酯水溶解RNA→采用BioPhotometer D30型核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA濃度和純度→按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明操作，把RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA→于冰上配制PCR液(含SYBR熒光染料10 μL+Lrp6 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、Runx2 mRNA以及內(nèi)參GAPDH上、下游引物各0.4 μL+cDNA模板2 μL+滅菌蒸餾水2 μL)→采用iQ5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行引物擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，40個(gè)循環(huán)(95 ℃，15 s→60 ℃，15 s→72 ℃，32 s)→獲得Lrp6 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、Runx2 mRNA以及內(nèi)參GAPDH生成溶解曲線，計(jì)算Lrp6 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、Runx2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量[9]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD均較高，且補(bǔ)骨脂素低濃度組<補(bǔ)骨脂素中濃度組<補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD比較

2.2 各組大鼠Tb.Sp、Tb.Th及Tb.N比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠Tb.Sp顯著升高，Tb.Th、Tb.N明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠Tb.Th、Tb.N均較高，且補(bǔ)骨脂素低濃度組<補(bǔ)骨脂素中濃度組<補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠Tb.Sp均較低，且補(bǔ)骨脂素低濃度組>補(bǔ)骨脂素中濃度組>補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖1。

表2 各組大鼠Tb.Sp、Tb.Th及Tb.N比較

圖1 各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)Micro-CT觀察結(jié)果

2.3 各組大鼠血清OPG、BGP水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清BGP水平顯著升高，OPG水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠血清OPG水平均較高，且補(bǔ)骨脂素低濃度組<補(bǔ)骨脂素中濃度組<補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠血清BGP水平均較低，且補(bǔ)骨脂素低濃度組>補(bǔ)骨脂素中濃度組>補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清OPG、BGP水平比較

2.4 各組大鼠骨組織OPG、BGP表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠骨組織BGP表達(dá)水平顯著升高，OPG表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠股骨組織OPG表達(dá)水平均較高，且補(bǔ)骨脂素低濃度組<補(bǔ)骨脂素中濃度組<補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠股、骨組織BGP表達(dá)水平均較低，且補(bǔ)骨脂素低濃度組>補(bǔ)骨脂素中濃度組>補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖2、3。

表4 各組大鼠股、骨組織OPG、BGP表達(dá)水平比較

圖2 各組大鼠骨組織OPG表達(dá)結(jié)果(免疫組織化學(xué)染色，×400)

圖3 各組大鼠骨組織OPG表達(dá)結(jié)果(免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.5 各組大鼠骨組織Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠骨組織GSK-3β mRNA表達(dá)水平顯著升高，骨組織Lrp6、β-catenin、Runx2 mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織Lrp6、β-catenin、Runx2 mRNA表達(dá)水平均較高，且補(bǔ)骨脂素低濃度組<補(bǔ)骨脂素中濃度組<補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織GSK-3β mRNA表達(dá)水平較低，且補(bǔ)骨脂素低濃度組>補(bǔ)骨脂素中濃度組>補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 各組大鼠骨組織Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表達(dá)水平比較

圖4 各組大鼠骨組織Lrp6、GSK-3β、β-catenin、Runx2 mRNA表達(dá)結(jié)果

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，OS屬于“骨痿”“腰痛”“骨痹”“骨枯”等范疇[10]，屬于本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛為肝腎氣血虧虛，標(biāo)實(shí)為痰飲、瘀血、氣滯，腎主骨生髓，腎精虧虛則骨髓生長乏源，骨骼失于濡養(yǎng)，致骨枯骨痿，腎虛日久出現(xiàn)瘀血、氣滯等，可影響骨的氣血運(yùn)行，進(jìn)一步加重病情，骨治療上應(yīng)以補(bǔ)腎為主，兼以活血行氣。補(bǔ)骨脂屬于補(bǔ)益藥，味辛苦，性大溫，歸腎、脾經(jīng)，有補(bǔ)腎壯陽、溫脾止瀉等功效，臨床應(yīng)用廣泛。劉振海等[11]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂常作為中藥復(fù)方中的一味藥用于肝腎不足型OS的治療。現(xiàn)代藥理研究顯示，補(bǔ)骨脂內(nèi)含有香豆素類、單萜酚類、黃酮類等多種活性成分，具有升高白細(xì)胞延緩老年癡呆進(jìn)程、改善細(xì)胞免疫功能、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)功能、抗菌抗病毒等多種藥理作用[12]。補(bǔ)骨脂素為補(bǔ)骨脂中的呋喃香豆素類化合物，被認(rèn)為是補(bǔ)骨脂內(nèi)抗骨質(zhì)疏松的主要有效成分，楊琳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素能通過上調(diào)骨組織轉(zhuǎn)化生長因子-β的表達(dá)水平，來促進(jìn)骨形成過程，發(fā)揮對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松雌鼠的治療作用。邢貞武[14]的體外研究則發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素能夠激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的Notch信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而影響絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)展。由此可見，補(bǔ)骨脂素可以通過多種途徑發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，但具體機(jī)制尚未完全明確，需要更全面地進(jìn)行研究。

本研究采用不同濃度的補(bǔ)骨脂素對(duì)去勢(shì)OS大鼠模型進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠第4腰椎及左、右股骨BMD及骨組織Tb.Th、Tb.N均較高，Tb.Sp均低于模型組，且藥物濃度越高，變化幅度越大，BMD是評(píng)價(jià)OS治療效果的主要指標(biāo)，Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp等骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)則可反映骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的變化，該結(jié)果表明補(bǔ)骨脂素能夠有效增加OS大鼠BMD，同時(shí)改善骨組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)和骨強(qiáng)度，且補(bǔ)骨脂素濃度越高作用效果越好。血清骨代謝相關(guān)指標(biāo)研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠血清及骨組織OPG水平高于模型組，BGP水平低于模型組，且補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組改變最為明顯，骨質(zhì)疏松的發(fā)生是骨形成與骨吸收失衡的結(jié)果，BGP由成骨細(xì)胞合成分泌，為骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志，能夠反映骨更新率，絕經(jīng)后OS屬于高轉(zhuǎn)換型，故該病發(fā)生后BGP處于較高水平；OPG是由成骨細(xì)胞分泌的糖蛋白，抑制破骨細(xì)胞分化、成熟并誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制骨吸收，加速骨形成，發(fā)揮骨保護(hù)作用[15]。該結(jié)果表明高濃度的補(bǔ)骨脂素能夠有效調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收過程，保護(hù)骨組織。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要途徑，能影響成骨細(xì)胞活性和功能，參與骨形成和骨代謝過程[16-17]，在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過程中也起到重要作用。Lrp6、GSK-3β和β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的主要分子，一般認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活后，細(xì)胞膜上的Wnt能夠與Lrp6特異性結(jié)合，形成的復(fù)合體可以促使GSK-3β磷酸化并喪失活性，無法促進(jìn)β-catenin磷酸化，從而引起細(xì)胞內(nèi)β-catenin積聚，然后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，控制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，激活Wnt下游靶基因Runx2，Runx2為骨形成和發(fā)育的必要基因[18-21]，能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)其成熟。若Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制，則成骨細(xì)胞分化受到影響，可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組及阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織Lrp6、β-catenin、Runx2 mRNA表達(dá)水平高于模型組，GSK-3β mRNA表達(dá)水平低于模型組，且補(bǔ)骨脂素高濃度組和阿侖膦酸鈉組變化最明顯，表明補(bǔ)骨脂素能通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，這可能是補(bǔ)骨脂素發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制之一。

綜上所述，補(bǔ)骨脂素能劑量依賴性地提高OS大鼠的BMD，提高血清及骨組織BGP水平，降低BGP水平，增加骨組織骨小梁厚度和數(shù)量，降低骨小梁分離度，其作用可能與激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。