高效液相色譜法測(cè)定健脾益腎顆粒中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量

劉俊娥，劉俊紅，趙鐵彥

1.北京軍區(qū)總醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，北京 100700；2.山西省太原二六四醫(yī)院輸血科，山西太原 030001；3.山西省太原二六四醫(yī)院普外科，山西太原 030001

健脾益腎顆粒為中藥復(fù)方制劑，由補(bǔ)骨脂、黨參、枸杞子、女貞子、菟絲子和白術(shù)等多味中藥組成，具有健脾益腎的功效，能提高機(jī)體免疫力、抑制腫瘤的雙向調(diào)節(jié)作用，減輕放化療等副作用以及減輕脾腎虛弱所引起的疾病。補(bǔ)骨脂為處方中的君藥，其有效成分為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。文獻(xiàn)中多采用高效液相色譜法[1-2]、氣相色譜法[3]、薄層掃描法[4]和毛細(xì)管電泳法[5]等來(lái)測(cè)定其有效成分的含量。為了更有效地控制健脾益腎顆粒的質(zhì)量，本文采用高效液相色譜法測(cè)定健脾益腎顆粒中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，并進(jìn)行學(xué)研究，簡(jiǎn)便可靠，重復(fù)性好，能有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1200液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司，包括：四元泵、在線脫氣器、Chem station色譜工作站）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），健脾益腎顆粒（北京長(zhǎng)城制藥，批號(hào)：060233）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（53∶47）；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；流速：1 ml/min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含20.22 μg和20.50 μg的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取健脾益腎顆粒5 g，研細(xì)，精密稱取1 g，置具塞錐形瓶中，加入適量甲醇，超聲30 min，放冷，濾過(guò)，濾液置于25 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方組成，取不含補(bǔ)骨脂的諸藥，按“2.3”項(xiàng)下的方法制成陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品、陰性對(duì)照及供試品溶液色譜圖。結(jié)果表明，其他成分對(duì)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素測(cè)定無(wú)干擾。見圖1。

圖1 健脾益腎顆粒中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定的高效液相色譜

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取不同體積的上述補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的對(duì)照品混合溶液。按“2.1”色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得補(bǔ)骨脂素的回歸方程為Y=80.05X+1.452，r=0.9999；異補(bǔ)骨脂素的回歸方程為 Y=78.26X+2.653，r=0.9999。 表明，補(bǔ)骨脂素在 0.04010～0.20480 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，異補(bǔ)骨脂素在0.03422～0.21200 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液分別在 0、2、4、6、8 h測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量。補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量的RSD值分別為0.52%、0.67%。測(cè)定結(jié)果表明，供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量無(wú)明顯變化，被測(cè)組分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量的RSD值分別為0.38%、0.25%。測(cè)定結(jié)果表明，方法精密度良好。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批健脾益腎顆粒5份，制備方法同“2.3”項(xiàng)下方法，依次測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量。補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量的RSD值分別為0.82%、0.95%。測(cè)定結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密量取已知含量的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素供試品溶液，共5份，分別精密加入一定量的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液，制備方法同“2.3”項(xiàng)下方法，依次測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，計(jì)算回收率。其中回收率=（檢出補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂素量-樣品中補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂素量）/加入補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂素量×100%。結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的平均回收率分別99.8%、100.1%，RSD值分別1.00%、0.87%。測(cè)定結(jié)果見表1、2。

表1 補(bǔ)骨脂素加樣回收率試驗(yàn)（μg）

表2 異補(bǔ)骨脂素加樣回收率試驗(yàn)（μg）

2.10 樣品含量測(cè)定

取三批樣品，制備方法同“2.3”項(xiàng)下方法，連續(xù)進(jìn)樣5次，分別測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量。三批樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量見表3。

表3 樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定結(jié)果（n=5）

3 討論

通過(guò)對(duì)索氏提取法和超聲提取法的比較，結(jié)果表明，兩種方法測(cè)得的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量無(wú)明顯差異，因超聲提取法方便，可操作性強(qiáng)，所以本實(shí)驗(yàn)選用超聲提取法。同時(shí)通過(guò)預(yù)試，發(fā)現(xiàn)提取溶劑選擇甲醇比較合適。分別考察了甲醇-水、乙腈-水等不同比例的流動(dòng)相，結(jié)果顯示，乙腈-水（53∶47）為流動(dòng)相分離度更好，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適宜，所以確定乙腈-水（53∶47）為流動(dòng)相。

本研究所用的測(cè)量健脾益腎顆粒中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的定量分析方法，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為控制該制劑質(zhì)量的手段之一。

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