補骨脂有效成分在大鼠血清、肝、腎中的測定

張 昀，張 瑜

(河南大學藥學院，河南開封 475001)

補骨脂是常用中藥之一，具有溫補脾腎、壯陽止瀉之功效，目前已從中分離鑒定出三十余種化合物。現(xiàn)代藥理研究表明，補骨脂具有抑制分離破骨細胞、抑制人胃癌細胞的生長、抗氧化、抗菌抗病毒、增強免疫力等作用［1-12］。補骨脂藥材中主要活性成分為補骨脂素和異補骨脂素［13-15］，其定量測定已收載于《中國藥典》2010年版［16］。因此，本實驗旨在建立一種同時測定大鼠血清、肝臟、腎臟中補骨脂素和異補骨脂素的量的方法，為兩者在體內(nèi)的分布規(guī)律及藥代動力學研究奠定基礎。

1 儀器及試劑

AE200S電子分析天平 (上海梅特勒-托利多儀器有限公司);Agilent 1260型高效液相色譜儀;氯霉素 (中國藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品批號130303-200614);補骨脂素對照品 (批號110739-201115，供含量測定用，中國食品藥品檢定院);異補骨脂素對照品 (批號110738-201012，供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院);甲醇、乙腈為色譜純 (均為天津四友精細化學品有限公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18(2)高效液相色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為水(A)-乙腈 (B)(65∶35)，梯度洗脫 (0～10 min，35%B→45%B;10～25 min，45%B→50%B)，體積流量1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長295 nm(0～10 min，氯霉素)，246 nm(10～25 min，補骨脂素、異補骨脂素)，進樣量20 μL。圖譜見圖1。

圖1 對照品溶液和樣品溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.2 對照品貯備液的配制 精密稱取補骨脂素、異補骨脂素對照品分別至10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，儲存于4℃冰箱待用。

2.3 內(nèi)標標準溶液的配制 精密稱取氯霉素對照品至25 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，儲存于4℃冰箱待用。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 血清供試品溶液 精密吸取內(nèi)標溶液20 μL置具塞離心管中，于緩和氮氣流下吹干溶劑，加入血清樣品 200 μL，乙酸乙酯-正己烷 (8 ∶1)800 μL，渦旋 2 min，低溫離心 10 min(12000 r/min)，分取上層有機相置另一試管中，于緩和氮氣流下吹干溶劑，殘渣用100 μL甲醇溶解，即得。

2.4.2 肝臟供試品溶液 稱取肝臟相同部位0.3 g，加生理鹽水0.5 mL，10000 r/min勻漿，離心10 min(5000 r/min)，取上清液200 μL置于氮氣吹干的含有20 μL內(nèi)標標準液的具塞離心管中，加入乙酸乙酯-正己烷 (8∶1)800 μL，渦旋2 min，低溫離心10 min(12000 r/min)，取上層有機相置另一試管中，緩和氮氣流下吹干溶劑，殘渣用100 μL甲醇溶解，即得。

2.4.3 腎臟供試品溶液的制備 稱取腎臟相同部位0.5 g，加生理鹽水0.5 mL，10000 r/min勻漿，離心10 min(5000 r/min)，取上清液200 μL置于氮氣吹干的含有20 μL內(nèi)標標準液的具塞離心管中，加入乙酸乙酯-正己烷 (8∶1)800 μL，渦旋2 min，低溫離心10 min(12000 r/min)，取上層有機相置另一試管中，氮氣流下吹干溶劑，殘渣用100 μL甲醇溶解，即得。

2.5 線性關系考察 精密吸取內(nèi)標溶液20 μL及一定體積的標準溶液于離心管中，于氮氣流吹干溶劑，加入空白血清200 μL，配制補骨脂素、異補骨脂素質(zhì)量濃度均為10、6、3、1、0.5、0.1 mg/L的系列血清樣品溶液，按“2.4.1”項下操作，建立血清標準曲線。精密吸取內(nèi)標溶液20 μL及一定體積的標準溶液于離心管中，于緩和氮氣流吹干溶劑，加入空白肝勻漿200 μL，配制補骨脂素、異補骨脂素質(zhì)量濃度均為10、6、3、1、0.5、0.1 mg/L的系列肝臟樣品溶液，按“2.4.2”項下操作，建立肝臟標準曲線。精密吸取內(nèi)標溶液20 μL及一定體積的標準溶液于離心管中，于氮氣流吹干溶劑，加入空白腎勻漿200 μL，配制補骨脂素、異補骨脂素質(zhì)量濃度均為10、6、3、1、0.5、0.1 mg/L的系列腎臟樣品溶液，按“2.4.3”項下操作，建立腎臟標準曲線。分別以各樣品中補骨脂素、異補骨脂素的質(zhì)量濃度為橫坐標，補骨脂素、異補骨脂素與內(nèi)標峰面積之比為縱坐標，求得補骨脂素在血清、肝臟、腎臟中的線性回歸方程分別為 Y=1.2467X+0.2028，r=0.9813;Y=1.6294X－0.0372，r=0.9901;Y=1.3354X+0.1379，r=0.9928。異補骨脂素在血清、肝臟、腎臟中的線性回歸方程分別為Y=1.0984X+0.3472，r=0.9916;Y=1.5961X+0.0104，r=0.9924;Y=1.1278X－0.1495，r=0.9926。結果表明，補骨脂素、異補骨脂素在0.1～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6 日內(nèi)日間精密度試驗 大鼠空白血清中加入已知量的補骨脂素、異補骨脂素對照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.1”項下操作，結果補骨脂素日內(nèi)精密度RSD(n=6)依次為3.62%、3.81%、10.54%，異補骨脂素為3.59%、3.67%、11.04%;補骨脂素日間精密度RSD(n=3)值依次為7.56%、7.07%、11.32%，異補骨脂素為7.34%、7.49%、9.67%。大鼠空白肝勻漿液中加入已知量的補骨脂素、異補骨脂素對照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.2”項下操作，結果補骨脂素日內(nèi)精密度RSD(n=6)依次為3.96%、3.72%、10.63%，異補骨脂素為3.79%、4.02%、10.83%;補骨脂素日間精密度 RSD(n=3)依次為6.37%、6.89%、11.24%，異補骨脂素為6.74%、6.97%、10.86%。大鼠空白腎勻漿液中加入已知量的補骨脂素和異補骨脂素對照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.3”項下操作，結果補骨脂素日內(nèi)精密度RSD(n=6)依次為4.53%、4.62%、11.65%，異補骨脂素為4.38%、4.69%、10.86%;補骨脂素日間精密度RSD(n=3)依次為7.24%、7.58%、12.31%，異補骨脂素為7.85%、8.04%、12.08%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一血清樣品，分別于0、2、6、12、24 h進樣，測得補骨脂素 RSD為4.59%，異補骨脂素RSD為4.96%，說明該樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 大鼠空白血清中加入已知量的補骨脂素、異補骨脂素對照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.1”項下操作，結果平均回收率(n=6)依次為補骨脂素97.84%(3.54%)，93.08%(4.36%)，90.69%(5.21%);異補骨脂素97.12% (3.76%)，93.22%(3.82%)，89.68%(5.47%)。大鼠空白肝勻漿液中加入已知量的補骨脂素、異補骨脂素對照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.2”項下操作，結果平均回收率 (n=6)值依次為補骨脂素 98.79% (2.97%)，97.60%(3.52%)，91.25% (4.03%);異補骨脂素97.97%(4.40%)，96.55%(5.86%)，90.71%(5.28%)。大鼠空白腎勻漿液中加入已知量的補骨脂素、異補骨脂素對照品，分別制成高、中、低質(zhì)量濃度的樣品，按“2.4.3”項下操作，結果平均回收率(n=6)值依次為補骨脂素96.80%(4.92%)，96.56%(5.09%)，92.30%(5.76%);異補骨脂素98.79%(4.94%)，96.22%(5.29%)，91.34%(5.67%)。結果表明，該方法切實可行。

2.9 樣品測定 精密稱取補骨脂藥材粉末 (過四號篩)，按3.0 g/kg大鼠灌胃給藥，1 h后眼眶取血，按“2.4”項下方法操作，制備血清、肝、腎供試品，內(nèi)標法計算各供試品中補骨脂素、異補骨脂素的量。結果，血清中補骨脂素為6.96 mg/L、異補骨脂素為1.67 mg/L;肝臟中補骨脂素為4.98 mg/L、異補骨脂素為0.76 mg/L;腎臟中補骨脂素為2.04 mg/L、異補骨脂素為0.29 mg/L。

3 討論

本實驗建立了大鼠體內(nèi)補骨脂中主要成分補骨脂素、異補骨脂素的同時檢測方法。采用常用的紫外檢測器，操作簡單可行。對不同色譜柱進行了對比，補骨脂素與異補骨脂素均達到了基線分離，分離度良好。實驗中對血清、肝、腎不同預處理方法做了初步考察，篩選了不同的萃取溶劑，丙酮、三氯甲烷等回收率低或有干擾，對不同配比的乙酸乙酯-正己烷進行考察，其中乙酸乙酯-正己烷(8∶1)提取效果最好，回收率高。故確定最佳萃取溶劑為乙酸乙酯-正己烷 (8∶1)。

通過預試驗發(fā)現(xiàn)，空白血清、肝勻漿液、腎勻漿液在補骨脂素、異補骨脂素相同的保留時間內(nèi)沒有干擾。但是，如果大鼠有脂肪肝或高脂血癥，則在補骨脂素和異補骨脂素相同的保留時間有干擾。因此，在選擇大鼠時應注意檢測血脂水平。對不同年齡的大鼠也進行了考察，發(fā)現(xiàn)24月齡大鼠，在補骨脂素、異補骨脂素相同的保留時間內(nèi)有干擾，2月齡大鼠沒有干擾。估計是老齡動物的基礎代謝物質(zhì)與青年動物不同造成的。對于雌鼠與雄鼠，預試驗發(fā)現(xiàn)對補骨脂素和異補骨脂素的代謝速度不一樣，具體差異尚需藥代動力學進一步研究。綜上所述，在測定補骨脂在體內(nèi)分布及代謝時，應選用4月齡左右的大鼠，雌雄各半，同時給予低脂飼料。

本實驗建立了一種快速分析大鼠體內(nèi)血清、肝、腎中補骨脂藥材有效成分補骨脂素和異補骨脂素含量的方法。該方法具有高靈敏度、操作簡單等特點，為補骨脂藥代動力學研究以及在體內(nèi)各組織的分布，提供了必要的參考。

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