HPLC法測定補骨脂藥材中補骨脂素和異補骨脂素

李俊娟， 李 軍

(1.伊川中醫(yī)院，河南洛陽 471300;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029)

補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實。具有溫腎助陽，溫脾止瀉的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明補骨脂具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、增強免疫等多種藥理活性［1］。補骨脂中的主要化學(xué)成分為香豆素和黃酮類化合物［2-5］，其中所含的呋喃香豆素類成分補骨脂素(psoralen)及異補骨脂素 (isopsoralen)為補骨脂的主要有效成分，研究表明其對小鼠肉瘤、艾氏腹水瘤等多種瘤細胞的生長具有顯著的抑制作用［6-7］。雖然對含補骨脂素和異補骨脂素中成藥中兩種成分定量測定的方法研究較多，但利用HPLC法對補骨脂原藥材中補骨脂素和異補骨脂素的定量測定方法研究的比較少［8-12］。本實驗利用HPLC法對補骨脂藥材中的補骨脂素及異補骨脂素的定量測定方法進行了系統(tǒng)的研究。

1 儀器及試劑

1.1 儀器及試劑 Waters 600 HPLC色譜系統(tǒng):waters 717自動進樣器、真空脫氣、四元梯度泵、柱溫箱;2996 DAD檢測器;Alltima C18高效液相色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。BP110S電子分析天平;超聲波清洗器;補骨脂素和異補骨脂素對照品購自中國生物制品藥品檢定所 (批號分別為:07399907;07389907)，純度利用HPLC面積歸一化法測定大于98.0%，甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑為分析純。

1.2 藥材 10批藥材分別采自河南、陜西、重慶、四川等地和購于香港藥材市場，經(jīng)伊川中醫(yī)院李俊娟主管藥師鑒定為豆科植物補骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Alltima C18高效液相色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇-水 (50∶50);體積流量1.0 mL/min;柱溫25℃;檢測波長246 nm;進樣量20 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定補骨脂素、異補骨脂素對照品2.5 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇溶解，用甲醇稀釋至刻度，制備成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，避光放置備用。

2.3 檢出限的測定 精密吸取補骨脂素和異補骨脂素對照品貯備液適量，進行梯度稀釋后，精密吸取各稀釋液20 μL進行分析，以信噪比不小于3∶1為標(biāo)準(zhǔn)，測定補骨脂素的檢出限為0.065 ng/mL，異補骨脂素的檢出限為0.053 ng/mL。

2.4 定量限的測定 精密吸取補骨脂素和異補骨脂素對照品貯備液適量，進行梯度稀釋后，精密吸取各稀釋液10 μL進行分析，以信噪比不小于10∶1為標(biāo)準(zhǔn)，測定補骨脂素的定量限為0.145 ng/mL，異補骨脂素的定量限為0.127 ng/mL。

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取4.0 mL補骨脂素、異補骨脂素對照品貯備液于10 mL量瓶中，加入甲醇定容，混勻，制備成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的混合對照品貯備液，精密吸取混合對照品貯備液50、200、300、500、750 μL，置于1 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備成分別含補骨脂素、異補骨脂素為0.01、0.04、0.06、0.10、0.15 mg/mL的混合對照品溶液，精密吸取對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀進行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果表明補骨脂素、異補骨脂素在0.010～0.150 mg/mL范圍內(nèi)線性良好?；貧w方程分別為:補骨脂素，y=78 335x-169 974(r2=0.999 6);異補骨脂素，y=74 076x-123 199(r2=0.999 3)。

2.6 提取方法考察 精密稱取4份粉碎后的補骨脂藥材0.3 g，加入適量甲醇，分別加熱回流提取1.5 h，索氏回流提取4 h，冷浸提取12 h和超聲提取30 min(2次)，提取液減壓蒸干溶劑，殘渣用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度。各提取液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，精密吸取續(xù)濾液20 μL，注入液相色譜儀進行分析，以補骨脂素和異補骨脂素為考察指標(biāo)，結(jié)果表明超聲提取法對補骨脂素和異補骨脂素的提取效率佳，并且方法簡單快捷，故選用超聲提取法進行提取。

2.7 提取溶劑考察 精密稱取5份粉碎后的補骨脂藥材0.3 g，分別加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇和水20 mL，超聲提取30 min后，4 500 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL的量瓶中。藥渣用相應(yīng)溶劑重復(fù)提取一次，合并上清液于50 mL量瓶中，用相應(yīng)溶劑進行稀釋至刻度。各提取液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，精密吸取續(xù)濾液20 μL，注入液相色譜儀進行分析，以補骨脂素和異補骨脂素為考察指標(biāo)，結(jié)果表明50%甲醇對補骨脂素和異補骨脂素的提取效率最佳。

2.8 樣品溶液的制備 精密稱取粉碎后的補骨脂藥材0.3 g，加入50%甲醇20 mL，進行超聲提取30 min后，4 500 r/min條件下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL的量瓶中。藥渣同法重復(fù)提取一次，合并上清液于50 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，混勻。提取液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，精密吸取續(xù)濾液20 μL，注入液相色譜儀進行分析。

2.9 精密度考察 精密吸取混合對照品溶液 (60 mg/L)20 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)分析5次，以補骨脂素和異補骨脂素的峰面積為考察指標(biāo)，補骨脂素和異補骨脂素的RSD分別為1.32%和1.38%。

2.10 穩(wěn)定性考察 精密稱取采集于河南新鄉(xiāng)的補骨脂藥材0.3 g，按照樣品溶液制備項下制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液20 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h測定，以補骨脂素和異補骨脂素的峰面積為指標(biāo)，計算RSD分別為1.37%和1.42%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)測定穩(wěn)定。

2.11 重復(fù)性考察 精密稱取6份采集于河南新鄉(xiāng)的補骨脂藥材0.3 g，按照樣品溶液制備項下制備、進樣20 μL，記錄補骨脂素和異補骨脂素的峰面積值，計算補骨脂素和異補骨脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，RSD分別為0.41%和1.23%。

2.12 加樣回收率考察 精密稱取6份采集于河南新鄉(xiāng)的補骨脂藥材0.3 g，分別精密加入對照品補骨脂素和異補骨脂素各2.8 mg，按照樣品溶液制備項下制備，依法測定。計算補骨脂素和異補骨脂素的平均回收率分別為97.8%和103.1%，RSD分別為0.89%和1.13%。

2.13 樣品測定 精密稱取不同來源的補骨脂藥材0.3 g各3份，按照樣品溶液制備項下制備，測定補骨脂素和異補骨脂素，測定結(jié)果見表1，分析色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液 (A)和樣品溶液 (B)HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference substanles(A)and Psoraleae Fructus extract

表1 不同來源補骨脂藥材測定結(jié)果Tab.1 Contents of psoralen and isopsoralen in Psoraleae Fructus from different sources

3 小結(jié)與討論

補骨脂為臨床常用中藥材，補骨脂素和異補骨脂素為其主要的活性成分，利用HPLC法對其中的補骨脂素和異補骨脂素進行測定，以前文獻報道利用甲醇為溶劑，超聲提取法提取效果最佳［9］;也有報道利用50%甲醇為溶劑，冷浸法提取效果最佳［13］。本實驗通過對不同比例含水甲醇作為溶劑的提取效率進行了考察，發(fā)現(xiàn)50%甲醇為溶劑，超聲提取30 min(兩次)能夠?qū)⑺幉闹械难a骨脂素和異補骨脂素提取完全。對于分析流動相的選擇，文獻報道中利用甲醇-酸水為流動相，才能達到理想的分離效果［12］。本實驗選用50%甲醇水為流動相，等度洗脫，在保留時間15～20 min間，補骨脂素和異補骨脂素就達到了理想分離，分析周期短，分離度好。本實驗通過對提取方法、提取溶劑、檢測限和定量限等指標(biāo)參數(shù)的詳細考察，建立了快速分析補骨脂藥材中補骨脂素和異補骨脂素含有量的方法，該方法具有靈敏度高、可重復(fù)性強、回收率佳等特點，為補骨脂藥材及成藥的質(zhì)量控制和臨床用藥的安全有效提供了必要的參考。

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