璇機(jī)化積膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李 姣， 常增榮， 傅欣彤

(1.北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 100035;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

璇機(jī)化積膏為國(guó)際傳統(tǒng)醫(yī)藥研究院研制的貼膏劑，由香附、木香、五靈脂、牽牛子等藥味與適宜的基質(zhì)和基材制成。為控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量，對(duì)處方中木香、香附、牽牛子進(jìn)行了薄層色譜鑒別，并采用高效液相色譜法測(cè)定了制劑中α-香附酮。所建立的方法具有分離效果好、重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地控制本品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測(cè)器 (PDA)型;硅膠G預(yù)制板 (煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所);硅膠G預(yù)制板 (青島海洋化工廠分廠);MN-硅膠G預(yù)制板TLC-plate SIL G-25。

1.2 對(duì)照品及對(duì)照藥材 去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品 (批號(hào)1525-200103)、α-香附酮對(duì)照品 (批號(hào)110748-200507)、咖啡酸對(duì)照品 (批號(hào)110885-200102)。香附對(duì)照藥材 (批號(hào)121059-200505)、牽牛子對(duì)照藥材 (批號(hào)121024-200604)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。璇機(jī)化積膏樣品3批(批號(hào)分別為20100616，20100621，20100816)，由國(guó)際傳統(tǒng)醫(yī)藥研究院提供;甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 木香中去氫木香內(nèi)酯的薄層鑒別 取本品1片，除去蓋襯，剪成小塊，加甲醇30 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過(guò)，濾液加中性氧化鋁5 g，充分振搖1 min，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL，取上清液，作為供試品溶液。另取不含木香的陰性樣品制劑，同法制成木香陰性樣品溶液。再取去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(20∶1)為展開(kāi)劑，展距為12 cm，噴顯色劑5%香草醛硫酸溶液后，熱風(fēng)加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。缺木香陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 璇機(jī)化積膏中木香的TLC圖譜

2.2 香附的薄層色譜鑒別 取本品3貼，除去蓋襯，剪碎，置250 mL圓底燒瓶中，加水100 mL，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分并溢流入燒瓶時(shí)為止，再加乙酸乙酯1 mL，加熱回流至沸，并保持微沸2 h，放冷，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液。取不含香附的空白制劑，同法制成陰性樣品溶液。取香附對(duì)照藥材1 g，置250 mL圓底燒瓶中，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取α-香附酮對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(8.5∶1.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈 (254 nm)下檢視觀察。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)。缺香附陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 璇機(jī)化積膏中香附的TLC圖譜

2.3 牽牛子的薄層色譜鑒別 取本品3貼，除去蓋襯，剪碎，置燒杯中，加水70 mL，煎煮20 min，放冷，濾過(guò)，濾液加鹽酸調(diào)節(jié)至pH值為1～2，用乙酸乙酯30 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取不含牽牛子的陰性樣品制劑，同法制成陰性樣品溶液。另取牽牛子對(duì)照藥材2 g，加水70 mL，煎煮20 min，放冷，離心，取上清液，加鹽酸調(diào)節(jié)至pH值為1～2，用乙酸乙酯30 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取咖啡酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸(93∶9∶4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視觀察。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。缺牽牛子陰性樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

圖3 璇機(jī)化積膏中牽牛子的TLC圖譜

3 香附中α-香附酮的HPLC法測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Gemini 5μm110?C18(4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水 (55∶5∶40);柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。理論板數(shù)按α-香附酮峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 取α-香附酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含5 μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取本品5片，除去蓋襯，剪除不含藥部分的底襯，將含藥部分對(duì)折 (以防混勻及取樣過(guò)程黏連)，稱定總質(zhì)量，剪碎，混勻，取約1片的量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯20 mL，加熱回流30 min，取出，加甲醇50 mL，振搖均勻，置水浴上繼續(xù)回流10 min，放冷，濾過(guò)，濾液置100 mL量瓶中，用甲醇分次洗滌藥渣及濾器，洗液并入量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10 mL，置具塞錐形瓶中，加堿性氧化鋁 (100～200目)3 g，振搖2 min，置冷水浴中放置15 min后，取上清液，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及制劑制備工藝制備不含香附的陰性樣品，再按3.3項(xiàng)下方法制備，即得。

3.5 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定，結(jié)果陰性樣品在α-香附酮相應(yīng)保留時(shí)間處未見(jiàn)色譜峰，表明陰性樣品對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。見(jiàn)圖4。

圖4 α-香附酮測(cè)定HPLC圖譜

3.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取α-香附酮對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為 1.098 mg/mL)0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、4.0 mL，分別置100 mL量瓶中，各加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄依法測(cè)定峰面積，以α-香附酮對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為:Y=2 576 661X+460(r=1.000 0)，表明α-香附酮對(duì)照品在0.010 98 μg ～0.439 2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.7 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液 (批號(hào)20100616)，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果α-香附酮峰面積RSD為0.96%。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液 (批號(hào)20100616)，按定量測(cè)定方法，分別在0、2、4、6、11、19、28 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果α-香附酮峰面積RSD為1.09%，表明供試品溶液在配制后28 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品20片，除去蓋襯，稱定質(zhì)量，剪碎，取約1片的質(zhì)量 (共取6份)，精密稱定，依法測(cè)定。結(jié)果α-香附酮含量重復(fù)性良好，RSD為2.65%，方法重復(fù)性良好。

3.10 加樣回收率試驗(yàn) 取約半片的量 (共取6份)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入用乙酸乙酯配制的質(zhì)量濃度為0.230 6mg/mL的α-香附酮對(duì)照品溶液1.0mL，再加入乙酸乙酯19 mL，按供試品溶液同法制備，測(cè)定。結(jié)果α-香附酮對(duì)照品平均回收率為99.02%，RSD為2.88%，見(jiàn)表1。

3.11 樣品測(cè)定按上述測(cè)定方法，對(duì)測(cè)定3批璇機(jī)化積膏樣品，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

4.1 木香的薄層鑒別［1-3］中，貼劑用甲醇回流提取后，溶液中有部分脫敏膠輔料，致使點(diǎn)樣困難，加中性氧化鋁可吸附脫敏膠及一些其他雜質(zhì)。木香中主要含有倍半萜內(nèi)酯類成分去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯，木香烴內(nèi)酯對(duì)熱不穩(wěn)定，在本制劑中曾同時(shí)對(duì)去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果供試品在木香烴內(nèi)酯相應(yīng)位置上未檢出清晰的薄層斑點(diǎn)，故僅以去氫木香內(nèi)酯為對(duì)照。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 樣品中α-香附酮測(cè)定結(jié)果(n=3)

4.2 木香的薄層鑒別中曾對(duì)展距進(jìn)行考察，結(jié)果展距為12 cm左右時(shí)，分離效果最好，故確定展距為12 cm，另對(duì)本薄層鑒別的耐用性進(jìn)行了考察，考察項(xiàng)目為3個(gè)不同廠家的薄層板、不同展開(kāi)溫度 (室溫25℃和低溫6℃)、濕度 (相對(duì)濕度45%和75%)，結(jié)果表明不同廠家薄層板、不同的溫濕度條件下本薄層鑒別均能獲得較好的分離效果。

4.3 貼膏劑的質(zhì)量控制研究［4-10］中，最大問(wèn)題是檢測(cè)成分的提取和凈化，本品為含親脂性基質(zhì)的貼劑，有較強(qiáng)的黏附性，為有效提取α-香附酮及盡可能少的帶入基質(zhì)，對(duì)提取溶劑進(jìn)行預(yù)篩選，分別采用甲醇、乙醇、異丙醇、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷提取，結(jié)果乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯能較好溶解藥膏，但同時(shí)貼膏的賦形劑也較多溶出，用甲醇為溶劑提取液顏色較淺，表明甲醇不能較好滲透進(jìn)本貼劑中，提取效果較差，同時(shí)，由于α-香附酮具有揮發(fā)性，供試品不宜采用蒸發(fā)等濃縮過(guò)程，故采用乙酸乙酯提取后加甲醇使賦形劑沉淀析出的提取方法。為進(jìn)一步除去殘留的賦形劑及制劑中其他黃酮等成分的干擾，又采用堿性氧化鋁處理凈化樣品。

4.4 參照文獻(xiàn)的方法［11-13］，α-香附酮定量測(cè)定的流動(dòng)相曾采用①甲醇-水 (75∶25)，②甲醇-水 (70∶30)，③甲醇-水 (65∶35)，④甲醇-水 (60∶40)，⑤乙腈-水 (60∶40)，⑥乙腈-水 (55∶45)，⑦乙腈-水 (45∶55)體積流量為1.0 mL/min，⑧甲醇-乙腈-水 (55∶5∶40)，體積流量為1.0，柱溫分別采用30℃與40℃，結(jié)果流動(dòng)相⑧甲醇-乙腈-水 (55∶5∶40)，柱溫40℃，分離效果較好，故采用甲醇-乙腈-水 (55∶5∶40)為流動(dòng)相，柱溫40℃。

4.5 采用本文色譜條件用歸一化法計(jì)算，α-香附酮對(duì)照品純度為96.08%。

4.6 分別采用不同品牌色譜柱 (1)Phenomenex Gemini 5μm110?C18(4.6 mm ×250 mm)，(2)COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ (5μm，250 mm ×4.6 mm)， (3)YMC Packed ProC18(5 μm，250 mm ×4.6 mm)， (4)Inertsil ODS-3(5 μm，250 mm×4.6 mm)，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果α-香附酮峰在各種色譜柱均分離良好，空白無(wú)干擾，不同色譜柱間測(cè)定α-香附酮的RSD為2.42%，表明本HPLC方法有較好的耐用性。

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