瑤藥定心藤揮發(fā)油的提取工藝及其GC-MS分析

曾 立， 向 榮， 尹文清， 歐陽恩鴻， 曾 燕

(1.邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，湖南邵陽 422000;2.廣西師范大學(xué)藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004)

定心藤M(fèi)appianthus iodoies系茶茱萸科Icacinaceae定心藤屬M(fèi)appianthus植物，為瑤醫(yī)常用藥材“十八鉆”之一［1］。瑤醫(yī)認(rèn)為“鉆”類藥物性能強(qiáng)勁鉆透、通達(dá)經(jīng)絡(luò)、透利關(guān)節(jié)，多為行氣止痛、散瘀消腫藥，是瑤族傳統(tǒng)治癌“打藥”［2］。因此，瑤醫(yī)常用其藤莖來除濕、消腫和消炎，還用來治療毒蛇咬傷及黃疸。作者曾對定心藤中化學(xué)成分進(jìn)行研究［1］，不曾得到確切的相對應(yīng)活性物質(zhì)，而定心藤中揮發(fā)油的提取和組分分析，國內(nèi)外還尚未見報道。

通常揮發(fā)油一般具有驅(qū)風(fēng)和局部刺激作用，另外還有廣泛的生物活性，臨床上主要用于止咳、平喘、祛痰、發(fā)汗、解表、鎮(zhèn)痛及抗菌消炎等功效［3］。這些都與定心藤的臨床應(yīng)用很相似，為了進(jìn)一步深入認(rèn)識定心藤的內(nèi)在化學(xué)成分，本研究擬通過正交試驗(yàn)探討定心藤中揮發(fā)油超臨界CO2的最佳提取工藝條件，并采用GC/MS聯(lián)用技術(shù)對揮發(fā)油中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對含有量。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為瑤族醫(yī)藥定心藤的進(jìn)一步開發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和儀器

石油醚 (60～90℃)，苯，KOH，甲醇 (以上試劑均為分析純級，廣東汕頭市西隴化工廠);所用水為二次蒸餾水;CO2為食品級 (≥99%);定心藤購自邵陽市中心大藥房，經(jīng)由楊林老師鑒定為茶茱萸科定心藤屬植物定心藤M(fèi)appianthus iodoies，標(biāo)本存放于邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系植物標(biāo)本室。

HA 130-50-01型超臨界萃取裝置 (江蘇南通華安科研儀器有限公司);Agilent6890-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);JA1003N型電子天平 (上海江岳電子科技有限公司);JB/T5520-91型電熱恒溫干燥箱 (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

2 方法

2.1 揮發(fā)油的提?。?］準(zhǔn)確稱取粉碎后的定心藤干燥藤莖350 g裝入料筒，放入萃取釜內(nèi)，打開冷循環(huán)制冷氣閥，設(shè)置萃取釜分離Ⅰ、分離Ⅱ的溫度，當(dāng)制冷設(shè)備停止工作時，打開高壓泵，并打開相應(yīng)閥門保持通路狀態(tài)，通過流量計(jì)調(diào)節(jié)CO2的流量;保持恒溫恒壓循環(huán)并維持適當(dāng)時間，萃取完畢，打開分離釜排料閥，收集提取物。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參閱相關(guān)資料，以定心藤揮發(fā)油的收率為考察指標(biāo)，選用萃取壓力 (A)、萃取溫度 (B)、萃取時間 (C)和CO2流量 (D)4個因素3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)［5］(見表1)，每個試驗(yàn)號平行做3次實(shí)驗(yàn)，得出定心藤揮發(fā)性成分的最佳提取工藝條件。

表1 因素水平

2.3 脂肪酸甲酯制備 采用酯交換法［6］:稱取20 mg萃取物，置入10 mL試管中，加石油醚-苯 (1∶1)溶液2 mL，振蕩溶解，再加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液2.0 mL，劇烈振蕩1 min，放入60℃水浴鍋靜置，試管取出后再加入水至刻度，取上層清液進(jìn)行測定。

2.4 GC/MS測定條件［7］氣相色譜條件:Agilent6890-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，HP-5msi毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250℃;升溫程序:設(shè)置初溫40℃保持4 min，以6℃/min速度升溫到200℃保持5 min，以8℃/min速度升溫到260℃保持20 min;載氣為99.999%高純氦氣，體積流量1 μL/min，進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣 。

質(zhì)譜條件:EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，柱前壓9.8 psi(1 psi=6.895 kPa)，掃描質(zhì)量范圍(m/z):35～550。

3 結(jié)果與討論

3.1 定心藤超臨界CO2萃取正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)表2的L9(34)正交試驗(yàn)分析可知，影響超臨界CO2流體萃取定心藤揮發(fā)性成分的主次因素為:A＞D＞C＞B。B因素為不顯著因素，綜合分析，超臨界CO2流體萃取定心藤中揮發(fā)性成分的最佳工藝為:A3B2C3D3，即萃取壓力45 MPa，萃取溫度40℃，萃取時間4 h，萃取體積流量30 L/h，在此條件下?lián)]發(fā)性成分的3次平均收率能達(dá)到1.217%。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

3.2 氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)果 利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)聯(lián)用法對定心藤超臨界CO2萃取物進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)鑒定。對總離子圖中的各色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)聯(lián)用儀的計(jì)算機(jī)N ISTO5譜庫進(jìn)行定性檢測，從定心藤揮發(fā)油中分離出85個峰。依據(jù)相似度的概率 (本研究只討論匹配度大于90%的物質(zhì))，結(jié)合人工譜圖解析，并查閱相關(guān)的文獻(xiàn)［8］，確認(rèn)了32種化合物，結(jié)果見表3。各組分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)是根據(jù)總離子流圖由計(jì)算機(jī)采用峰面積歸一化法計(jì)算而得。

從表3可知，超臨界CO2萃取所得定心藤揮發(fā)油中主要是脂肪烴、酯類、脂肪酸等類型化合物，已鑒定成分占揮發(fā)性成分總量的55.04%，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的組分是棕櫚酸甲酯，亞油酸甲酯，油酸甲酯，角鯊烯等。

3.3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用超臨界CO2萃取法具有環(huán)境友好、操作溫度低、有效成分不易破壞等優(yōu)點(diǎn)。在萃取過程中排除了一些化學(xué)成分遇氧易氧化或見光反應(yīng)的可能性，能真實(shí)、全面地反映定心藤中揮發(fā)性化學(xué)組分。

表3 定心藤中揮發(fā)油中化學(xué)成分

醫(yī)學(xué)研究表明，不飽和脂肪酸對人體具有重要的平衡調(diào)節(jié)作用，是不可缺少的物質(zhì)，在降血脂、抗腫瘤、營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)等方面起重要作用［9］。其中棕櫚酸與降低血清膽固醇、抑制血小板聚集的藥理作用是密切相關(guān)的［10］;而亞油酸具有防癌抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、降低膽固醇和逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化的作用［11］。角鯊烯［12］是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗疲勞、抗心血管疾病等功效。

瑤藥是中華民族特色醫(yī)藥的重要組成部分。由于各種原因，目前對于瑤醫(yī)藥的研究還局限于較低水平。本研究結(jié)果顯示，定心藤超臨界CO2提取揮發(fā)油中具有抗腫瘤活性成分，而在本研究的后續(xù)研究中，我們發(fā)現(xiàn)定心藤超臨界CO2提取揮發(fā)油具有清除自由基的功能［13］，這些研究結(jié)果為定心藤做為瑤族傳統(tǒng)治癌“打藥”［14］提供了一定的科學(xué)依據(jù)，但仍有許多問題需要進(jìn)一步研究。比如定心藤其中的活性物質(zhì)是否是角鯊烯、棕櫚酸、亞油酸其中之一或者是協(xié)同作用有待進(jìn)一步的藥理實(shí)驗(yàn)研究。

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