HPLC 法測定骨質增生散中補骨脂素與異補骨脂素的含量

朱艷紅 包長龍

內蒙古自治區(qū)通遼市食品藥品檢驗所，內蒙古 通遼 028000

骨質增生散是由白花蛇舌草、烏梢蛇、補骨脂、乳香、沒藥、槲寄生、西紅花、熟地黃、杜仲、牛膝十味藥組成的復方制劑。功能主治為各部位骨質增生。補骨脂為該方中主要成份［1］之一，具有溫腎助陽、腰膝冷痛、腎虛作喘功效。對本方的臨床療效有重要作用，以補骨脂中主要有效成分補骨脂素與異補骨脂素為定量監(jiān)控指標可有效地控制產(chǎn)品的質量。本文采用HPLC法測定其中補骨脂素與異補骨脂素的含量，方法簡單、準確、重現(xiàn)性好?？勺鳛橘|量控制的方法。

1 儀器與試劑

島津LC－10AT高效液相色譜儀，SPD－10Avp檢測器、SIL－HTA自動進樣器、CLASS－VP工作站組成。甲醇為色譜純，水為高純水。補骨脂素 (中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用。批號:110739－200613)與異補骨脂素 (中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用。批號:110738－200309)。骨質增生散 (批號:20070608、20081003、20091002)由通遼市科左中旗蒙醫(yī)院制劑室提供。

2 方法和結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18柱 (250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇－水 (45:55)，柱溫:40℃，檢測波長為206nm，流速為1.0mL/min，進樣量10μL。理論板數(shù):按補骨脂素峰計算應不低于3000，補骨脂素峰與異補骨脂素峰與相鄰色譜峰的分離度大于2.5。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取補骨脂素、異補骨脂素對照品適量，加甲醇制成每 1ml分別含 0.02015mg、0.02114mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液 取骨質增生散粉末約1.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理 (功率300W，頻率50kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 按照處方比例并以相同工藝制備缺補骨脂的陰性樣品，按“2.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.5 干擾實驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，結果:陰性對照溶液色譜中，在與補骨脂素對照品與異補骨脂素對照品以及供試品色譜圖相對應的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)。故認為陰性對照無干擾，色譜圖見圖1。

2.6 線性關系考察

精密吸取“2.2”項下對照品溶液2、6、8、10、15、20、30μL分別進樣。以峰面積為縱坐標 (Y)，以對照品進樣量為橫坐標 (X)，繪制標準曲線。補骨脂素進樣量在0.02442～0.36624μg范圍內線性關系良好。異補骨脂素進樣量在0.02808～0.4212μg范圍內線性關系良好?；貧w方程分別為:

2.7 精密度試驗

取“2.2”項下的對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，補骨脂素色譜峰面積的RSD(n=6)為1.5%。異補骨脂素色譜峰面積的RSD(n=6)為1.3%。

圖1 HPLC色譜圖

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析測定。結果補骨脂素與異補骨脂素含量和的平均值 (n=6)為0.47mg·g－1，RSD為1.5%。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8，12，24h按上述色譜條件測定。測得補骨脂素的平均峰面積為848530，RSD(n=6)為1.3%;異補骨脂素平均峰面積為790053，RSD(n=6)為1.2%。結果表明供試品溶液室溫放置24h內穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品約0.7g，共6份，分別精密加入補骨脂素與異補骨脂素對照品溶液適量，按“2.3”項下方法操作，測定含量，并計算回收率。結果見表1。補骨脂素平均回收率 (n=6)為100.3%。異補骨脂素平均回收率 (n=6)為102.5%。

2.11 樣品測定

取骨質增生散，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，記錄色譜峰面積，計算含量。結果見表2。

表1 骨質增生散中補骨脂素的回收率

表2 骨質增生散中異補骨脂素的回收率

表3 骨質增生散中補骨脂素與異補骨脂素的含量和測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 測定波長的選擇

配制一定濃度的補骨脂素與異補骨脂素對照品溶液，分別在200～500nm波長內進行全掃描，補骨脂素與異補骨脂素在206nm處均有較強的紫外吸收。實驗選擇206nm進行測定。

3.2 提取方法的考察

根據(jù)補骨脂素、異補骨脂素性質，結合本品劑型的特點曾先后采用取本品加甲醇超聲30分鐘、40分鐘、50分鐘，及加甲醇索氏提取2小時的方法提取供試品，供試品含量測定結果基本相同，前一種提取方法簡便省時，故選定加甲醇超聲30分鐘制備供試品溶液。

3.3 據(jù)文獻［2－6］采取補骨脂素與異補骨脂素含量的和作為補骨脂藥材的質量標準，故本研究也采用兩組分的和來做質量研究。

3.4 本文建立了一種準確可靠、專屬性強、簡單快捷的定量方法，通過對補骨脂素、異補骨脂素的含量測定，達到控制該制劑質量的目的。

［1］蘇子仁，徐必達，劉慶思.補骨脂素、異補骨脂素在骨康提取精制過程中化學轉化的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，1997，3(6):1.

［2］陸蓓，吳韶銘.HPLC法測定益腎靈顆粒中補骨脂素和異補骨脂素的含量［J］.中國藥品標準，2002，3(4):23.

［3］王錦紅，孫傳梅.高效液相色譜法測定長壽長樂補酒中補骨脂素和異補骨脂素含量［J］.中國藥業(yè)，2006，15(11):42.

［4］李學松，范興東.補腎益腦膠囊中補骨脂素和異補骨脂素的含量測定［J］.中成藥，2006，28(6):810.

［5］常新全，丁麗霞.中藥活性成分析手冊［M］.學苑出版社，2002:1120－1120.

［6］中國藥典［S］.一部，2010:174－174.