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    溫和灸足三里穴對自然衰老大鼠的腎臟保護(hù)作用及腎組織纖連蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)的影響

    2022-11-16 08:20:02趙舒羽劉文博吳煥淦崔云華張紓研殷之光劉世敏林亞瑩
    世界中醫(yī)藥 2022年12期
    關(guān)鍵詞:貨號周齡艾灸

    趙舒羽 劉文博 吳煥淦, 崔云華 張紓研 殷之光 戚 莉 劉世敏 林亞瑩 趙 琛 黃 艷,

    (1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海,200437;2 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海,200030;3 上海中醫(yī)藥大學(xué),上海,201203)

    隨著年齡增長,人體器官的結(jié)構(gòu)和功能都會發(fā)生相應(yīng)的改變,器官衰老是各種老年疾病發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ),腎臟是衰老相關(guān)組織損傷的典型靶器官[1]。研究發(fā)現(xiàn),在沒有高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化等衰老相關(guān)疾病的衰老人群中,腎臟也會發(fā)生多種結(jié)構(gòu)及功能變化,可以認(rèn)為這些變化是單純衰老所引起的腎臟改變[2]。

    臨床研究表明,艾灸具有良好的延緩衰老作用。足三里穴是重要的保健要穴,已有實驗研究證實,艾灸足三里穴可增加超氧化物歧化酶等酶類抗氧化劑的含量,降低丙二醛等代謝產(chǎn)物的含量,具有良好的抗衰老作用[3-5]。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn),艾灸足三里、腎俞、關(guān)元等穴可改善老年人衰老相關(guān)癥狀[6-7]。本研究基于自然衰老大鼠模型,率先對衰老典型器官-腎組織進(jìn)行靶向研究,以經(jīng)典的小鼠衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)作為腎臟衰老的生物學(xué)指標(biāo),通過觀察溫和灸足三里穴對自然衰老大鼠腎組織結(jié)構(gòu)與功能的影響,并進(jìn)一步觀察大鼠腎組織纖連蛋白(Fibronectin,F(xiàn)N)表達(dá)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-beta l,TGF-β1)基因轉(zhuǎn)錄情況,研究溫和灸足三里穴對腎臟衰老的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 動物 雄性清潔級SD大鼠(56周齡、36周齡),采購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[動物許可證號:SCXK(滬)2012-0002],本研究得到上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會的批準(zhǔn),并在此批準(zhǔn)下進(jìn)行(倫理審批號:PZSHUTCM190524004)。動物實驗觀察室明暗各12 h,室內(nèi)溫度為20~22 ℃,相對濕度為50%~70%,自由攝食與飲水。實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng),飲食和飲水均正常的動物方可用于實驗。實驗過程中對實驗動物的操作均符合動物福利的基本原則、3R原則等相關(guān)要求。

    1.2 試劑與儀器 戊巴比妥鈉(Sigma公司,美國,貨號:P3761);無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:10009218);多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:80096618);二甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:10023418);中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:10004160);十二水合磷酸氫二鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:200040618);磷酸二氫鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:200407008);氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:10019308);鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:80070560);細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天公司,貨號:C0602);無毒環(huán)保蘇木素-伊紅染液(南京建成科技有限公司,貨號:D006);Masson染色試劑盒(博士德生物公司,貨號:GP1032);大鼠Albumin定量ELISA試劑盒(司鼎生物科技有限公司,貨號:SDR005196T);即用型SABC三步法試劑盒(博士德生物公司,貨號:SA1054);抗纖連蛋白抗體(Anti-Fibronectin antibody)(上海艾博抗有限公司,貨號:ab23751)特制細(xì)艾條(南陽漢醫(yī)艾絨廠,直徑0.5 cm,長度12 cm);光學(xué)顯微鏡及分析軟件(OLYMPUS公司,日本,BX53);臺式高速離心機(jī)(Eppendorf公司,德國,5810R)。

    1.3 分組與模型制備 56周齡SD大鼠常規(guī)喂養(yǎng)至80周齡,建立自然衰老大鼠模型。56周齡大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為自然衰老組、艾灸足三里組,每組10只。另購36周齡對照組大鼠10只。自然衰老組大鼠飼養(yǎng)至80周齡,單純抓取,不進(jìn)行治療。艾灸足三里組大鼠14月齡開始進(jìn)行溫和灸干預(yù),穴位定位方法參考《實驗針灸學(xué)》(余曙光等主編,上??茖W(xué)技術(shù)出版社,2014年出版)中常用動物穴位定位及相關(guān)文獻(xiàn),采用直徑0.5 cm特制細(xì)艾條,溫和灸單側(cè)“足三里”穴,依據(jù)大鼠皮膚受熱程度調(diào)整高度,距離穴位皮膚2~4 cm,1次/d,20 min/次,左右兩側(cè)穴位交替進(jìn)行,共干預(yù)6個月。

    1.4 標(biāo)本采集與處理 全部干預(yù)結(jié)束后,大鼠禁食24 h(不禁水),放入大鼠代謝籠,編號收集尿液,離心(400×g,5 min)取得上清液,待檢。2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉(0.2 mL/100 g),剖開大鼠腹腔,干棉球鈍性分離腹膜及腸道組織,腹主動脈取血,離心(1 200×g,10 min)取上清,-80 ℃保存;于冰浴環(huán)境取大鼠雙側(cè)腎組織,將兩側(cè)腎臟分別十字剖開,分為8等份,左側(cè)迅速放入凍存管,-80 ℃保存;右側(cè)置于4%多聚甲醛,待測。

    1.5 觀察指標(biāo)

    1.5.1 一般狀況觀察 大鼠的精神狀態(tài)、皮毛狀況、活動情況、體質(zhì)量變化。

    1.5.2 SA-β-gal表達(dá)檢測 腎組織冰凍切片中加入適當(dāng)體積的SA-β-gal染色固定液,以充分蓋住組織為宜,室溫固定15 min;用1×磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)浸泡洗滌腎組織3次,每次5 min;吸除PBS,組織切片上加入適當(dāng)量的染色工作液;37 ℃孵育過夜;封片,4 ℃保存,光鏡下觀察并拍照。應(yīng)用Image-pro-pius圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。每張切片隨機(jī)選取3個視野檢測積分光密度(Intergal Optical Density,IOD)取均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

    1.5.3 組織病理學(xué)觀察

    1.5.3.1 蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色 采用HE染色法對大鼠腎組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。石蠟切片脫蠟至水;浸于蘇木精缸中90 s;流水沖洗10 min;浸于1%鹽酸乙醇中分化3 s;流水沖洗5 min;浸于伊紅缸中2 min,蒸餾水中泡去多余染色,中性樹膠封片,光鏡下觀察并拍照。

    1.5.3.2 Masson染色 采用Masson染色法對大鼠腎組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。石蠟切片脫蠟至水;40 ℃溫?zé)崴床F?次,60 s/次,蒸餾水濕潤玻片30 s;R1核染液染色30 s,倒掉,沖洗液沖洗30 s;R2漿染液染色30 s,倒掉,沖洗液沖洗30 s;R3分色液分色8 min,棄去分色液;R4復(fù)染液復(fù)染5 min,倒掉,無水乙醇沖洗干凈;中性樹膠封片,光鏡下觀察并拍照。

    1.5.4 24 h尿蛋白含量檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測各組大鼠24 h尿蛋白含量。將大鼠尿液與標(biāo)本稀釋液作1∶100稀釋,配制標(biāo)準(zhǔn)品液,用雙蒸水1∶20稀釋;每孔各添加100 μL標(biāo)準(zhǔn)品液,充分混勻反應(yīng)板,37 ℃靜置30 min,洗板;每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL,37 ℃靜置30 min,洗板;每孔加入底物工作液100 μL,置37 ℃暗處反應(yīng)15 min;每孔加入100 μL終止液混勻,30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光度。

    1.5.5 腎組織FN表達(dá)檢測 采用免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠腎組織FN表達(dá),烤片,依次置于二甲苯、梯度乙醇、0.01 mol/LPBS、3%過氧化氫溶液,正常山羊血清封閉液,室溫下孵育,添加一抗,4 ℃孵育過夜,加二抗,DAB顯色液,浸于蘇木精中復(fù)染、梯度乙醇、二甲苯、中性樹膠封片,待鏡下觀察。應(yīng)用Image-pro-pius圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。每張切片隨機(jī)選取3個視野檢測IOD,取均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

    1.5.6 腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)檢測 腎組織研磨,裂解,檢測總RNA濃度和純度。引物設(shè)計參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列,引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計,由華大基因公司合成。見表1。ABI ViiA 7 Real Time PCR System進(jìn)行Real-time Quantitative PCR圖像和數(shù)據(jù)采集,基因表達(dá)倍數(shù)采用2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    表1 基因引物信息

    2 結(jié)果

    2.1 溫和灸對自然衰老大鼠一般情況的影響 36周齡對照組大鼠活動敏捷,毛色潔白,反應(yīng)靈敏,飲食飲水無異常。自然衰老組大鼠隨著月齡的增長,活動欠靈活,毛發(fā)逐漸枯黃,精神不振,飲食飲水量減少。艾灸足三里組大鼠活動較靈活,毛發(fā)潤澤,色澤微黃,精力尚可,飲食飲水無異常,日?;顒泳胁煌潭雀纳?。

    2.2 各組大鼠腎組織SA-β-gal染色比較 鏡下觀察,大鼠腎組織各層內(nèi)均可看到SA-β-gal陽性表達(dá)。36周齡對照組腎組織中陽性表達(dá)染色較淡,出現(xiàn)陰性或弱陽性反應(yīng);自然衰老組腎組織中藍(lán)染面積較大,染色較深;艾灸足三里組腎組織中陽性表達(dá)較衰老組弱,藍(lán)染面積小,染色普遍偏淡。與36周齡對照組比較,自然衰老組、艾灸足三里組腎組織中SA-β-gal陽性表達(dá)顯著增加(P<0.05);與自然衰老組比較,艾灸足三里組腎組織中SA-β-gal陽性表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)果提示:80周齡自然衰老大鼠出現(xiàn)明顯的腎臟組織衰老,艾灸足三里穴可以改善腎臟衰老。見圖1、表2。

    表2 各組大鼠腎組織中SA-β-gal陽性表達(dá)

    圖1 各組大鼠腎組織SA-β-gal陽性表達(dá)(SA-β-gal染色,×200)

    2.3 溫和灸對自然衰老腎組織病理學(xué)的影響

    2.3.1 各組大鼠腎組織HE染色 36周齡對照組腎小球呈圓形或橢圓形,外周規(guī)整,分布密集,壁層上皮分布均勻,腎小球囊腔狹小,腎小管管腔規(guī)整;自然衰老組腎小球明顯膨大,可見積液,腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞密度增高,腎小球囊腔明顯擴(kuò)大,腎間質(zhì)出現(xiàn)少量炎細(xì)胞浸潤;艾灸足三里組腎小球輕度膨大,腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞密度輕度增高。見圖2。

    圖2 大鼠腎臟組織病理學(xué)觀察(HE染色,×200)

    2.3.2 各組大鼠腎組織Masson染色 膠原纖維染色呈藍(lán)色,36周齡對照組大鼠未見明顯膠原陽性染色;自然衰老組腎間質(zhì)中可見大量藍(lán)色膠原纖維;艾灸足三里組僅見血管周圍少許膠原組織。見圖3。

    圖3 大鼠腎臟組織Masson染色(Masson染色,×200)

    腎組織HE染色結(jié)果提示:自然衰老大鼠腎組織結(jié)構(gòu)損傷,腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化。艾灸足三里穴組能夠減輕自然衰老大鼠腎組織病理學(xué)改變,改善腎纖維化狀態(tài)。

    2.4 溫和灸對自然衰老大鼠24 h尿蛋白含量影響 與36周齡對照組比較,自然衰老組、艾灸足三里組24 h尿蛋白含量明顯增加(P<0.05);與自然衰老組比較,艾灸足三里組24 h尿蛋白含量明顯降低(P<0.05)。見表3。

    表3 各組大鼠24 h尿蛋白含量比較[M(P25,P75),mmol/L,n=10]

    2.5 溫和灸對自然衰老大鼠腎組織FN表達(dá)的影響 FN陽性表達(dá)染色呈棕黃色,在腎組織各層內(nèi)均可看到FN表達(dá)。36周齡對照組腎組織中FN陽性表達(dá)主要分布在腎小球系膜內(nèi),染色較淡,呈陰性或弱陽性反應(yīng);自然衰老組腎組織中FN表達(dá)較36周齡對照組增多,呈陽性反應(yīng);艾灸足三里組腎組織中FN蛋白陽性呈弱陽性反應(yīng),表達(dá)較衰老組明顯減弱。與36周齡對照組比較,自然衰老組、艾灸足三里組腎組織FN表達(dá)均顯著增加(P<0.01);與自然衰老組比較,艾灸足三里組腎組織FN表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖4,表4。

    圖4 各組大鼠腎組織中FN表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,×200)

    表4 各組大鼠腎組織中FN表達(dá)

    2.6 溫和灸對自然衰老大鼠腎組織中TGF-β1mRNA水平的影響 與36周齡對照組比較,自然衰老組、艾灸足三里組腎組織中TGF-β1mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05);與自然衰老組比較,艾灸足三里組腎組織中TGF-β1mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表5。

    表5 各組大鼠腎組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)[M(P25,P75),n=10]

    3 討論

    器官衰老是指個體生命進(jìn)程中,因體內(nèi)、體外因素引發(fā)的器官組成細(xì)胞的丟失和細(xì)胞外基質(zhì)聚集,導(dǎo)致器官整體功能下降、對損傷因素易感性增強和應(yīng)激反應(yīng)能力的下降[8]。隨著年齡的增長,腎臟的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)均會相應(yīng)地發(fā)生變化。在微觀結(jié)構(gòu)水平上,腎臟的衰老主要表現(xiàn)在出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化、基底膜增厚、腎小管萎縮和動脈硬化等病變[9]。本研究采用的自然衰老大鼠模型是抗衰老研究的理想動物模型,它能較精確且完整地反映機(jī)體衰老狀態(tài),符合人類衰老的特點。SA-β-gal是衰老研究的經(jīng)典指標(biāo),表達(dá)SA-β-gal被認(rèn)為是衰老細(xì)胞的特異性的標(biāo)志?;诖四P?,我們以經(jīng)典的SA-β-gal作為腎臟衰老的生物學(xué)指標(biāo),觀察36周齡(青年)大鼠和80周齡(老年)大鼠腎組織SA-β-gal的表達(dá),鏡下發(fā)現(xiàn),在大鼠腎組織各層內(nèi)均可看到SA-β-gal表達(dá),36周齡對照組大鼠腎組織中陽性表達(dá)染色較淡,呈陰性或弱陽性反應(yīng);自然衰老組大鼠腎組織中藍(lán)染面積較大,染色較深,提示80周齡組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的腎臟衰老表型。HE染色顯示,36周齡對照組大鼠腎小球呈圓形或橢圓形,外周規(guī)整,分布密集,壁層上皮分布均勻,腎小球囊腔狹小,腎小管管腔規(guī)整;自然衰老組大鼠腎小球明顯膨大,可見積液,腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞密度增高,腎小球囊腔明顯擴(kuò)大,腎間質(zhì)出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤。Masson染色鏡下觀察結(jié)果顯示,36周齡對照組大鼠腎組織未見明顯膠原纖維增生改變;自然衰老組腎間質(zhì)中可見大量藍(lán)色膠原纖維。2組大鼠腎組織病理染色及纖維化染色表現(xiàn)符合腎臟衰老的病理改變及既往研究[10-11]。隨著年齡增長,腎臟功能隨之改變,腎臟衰老與腎損傷之間存在線性關(guān)系。本實驗研究結(jié)果顯示,與36周齡對照組比較,自然衰老組大鼠24 h尿蛋白水平升高,提示衰老大鼠發(fā)生增齡性腎功能減退和腎纖維化病理學(xué)改變。

    腎纖維化是腎臟衰老過程中的重要病理變化,是導(dǎo)致增齡性腎功能減退的主要原因[12-13]。FN是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,具有結(jié)合纖維蛋白原和膠原的能力,在正常情況下呈現(xiàn)低表達(dá),在病理狀態(tài)下表達(dá)增多,其改變主要反映腎組織細(xì)胞外基質(zhì)的變化。同時,F(xiàn)N是腎纖維化的效應(yīng)因子,在纖維化的早期即可形成并廣泛沉積,是反映腎纖維化的直觀指標(biāo)之一[14-15]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β),屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族的多功能細(xì)胞因子,包括3個不同的哺乳動物同工型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)。TGF-β1在腎臟的表達(dá)最多,活性最強。已證實,TGF-β1是一種強效的致纖維化因子[16],也是腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要的誘導(dǎo)劑,在腎纖維化時表達(dá)增加,是目前抗纖維化治療的主要靶標(biāo)。本研究中,我們采用免疫組織化學(xué)法、實時定量PCR法分別檢測腎組織中FN表達(dá)、TGF-β1mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)與青年對照組大鼠比較,自然衰老組大鼠的腎間質(zhì)中可見大量藍(lán)色膠原纖維,腎組織中FN表達(dá)增加,TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄增強,TGF-β1mRNA表達(dá)增加。有報道,無論是原癌基因、應(yīng)激誘導(dǎo)衰老以及復(fù)制性衰老的人成纖維細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)TGF-β1分泌增加[17-18],衰老大鼠腎組織中也發(fā)現(xiàn)TGF-β1升高[19]。我們推測衰老過程中FN、TGF-β1分泌增多是衰老相關(guān)腎纖維化及腎功能減退的潛在原因。

    艾灸療法用于延緩衰老歷史悠久,古今醫(yī)家均證實了艾灸延緩衰老的有效性?!夺樉恼嫠琛吩唬骸叭镳B(yǎng)后天之氣,灸三里可使元氣不衰,故稱長壽之灸。”有研究對溫針灸關(guān)元、足三里穴延緩衰老的作用進(jìn)行觀察,結(jié)果顯示,溫針灸提高老年人血液的超氧化物歧化酶含量,具有明確的抗衰老作用[20]。廖運新等[21]為120例老年患者施灸,發(fā)現(xiàn)老年患者免疫功能得到明顯加強,各衰老指標(biāo)與灸前比較有顯著性差異。大鼠的動物實驗結(jié)果也支持了溫和灸干預(yù)衰老的有效性[22]。本研究發(fā)現(xiàn),溫和灸足三里穴有效降低模型大鼠腎組織衰老標(biāo)志物SA-β-gal的表達(dá),改善腎臟衰老。我們進(jìn)一步從腎組織結(jié)構(gòu)和功能觀察艾灸對腎臟衰老的影響,HE染色和Masson染色結(jié)果提示,溫和灸足三里穴改善了自然衰老大鼠的腎小球結(jié)構(gòu),減輕腎組織炎癥,明顯抑制了腎間質(zhì)纖維化。研究結(jié)果顯示,溫和灸足三里穴降低了衰老大鼠24 h尿蛋白含量,提示溫和灸足三里穴改善大鼠增齡性腎損傷。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,溫和灸足三里穴有效降低了衰老大鼠腎組織FN表達(dá)。實時定量PCR結(jié)果顯示,溫和灸足三里穴有效降低了衰老大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達(dá),提示抑制FN表達(dá)、TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄可能是溫和灸足三里穴發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用機(jī)制之一。

    中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為衰老是人體各項功能整體性下降的過程,這一過程可以理解為虛證,臟腑虛損是機(jī)體增齡性變化中的核心部分,不僅是衰老的特征表現(xiàn),也是衰老的重要原因。五臟虛損日久則因虛致實,產(chǎn)生痰、瘀等病理產(chǎn)物,以致虛實夾雜,加速機(jī)體衰老。盡管各種老年慢性疾病的表現(xiàn)各異,但均以其器官衰老及功能減退作為疾病發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此,研究器官衰老及保護(hù)衰老器官功能是減少老年慢性疾病發(fā)生的前提條件。足三里穴是足陽明胃經(jīng)之合穴,胃之下合穴,具有調(diào)理脾胃,補中益氣的作用?!毒霸廊珪吩疲骸拔笧樗戎?,得后天之氣也,人之始生,本乎精血之原,人之既生,由于水谷之養(yǎng),非精血無以立形體之基,非水谷無以成形體之壯?!笨梢姲淖闳镅ㄊ茄泳徦ダ系闹匾侄沃?。

    本實驗聚焦器官衰老角度探討艾灸延緩衰老的可能機(jī)制,發(fā)現(xiàn)溫和灸足三里穴能夠改善自然衰老大鼠腎結(jié)構(gòu)和減輕腎損傷,抑制腎組織FN表達(dá)、TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄,延緩腎臟衰老,實驗結(jié)果為艾灸延緩腎臟衰老的機(jī)制研究提供了初步證據(jù)。

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