具有降血壓功能乳酸菌的篩選及其益生作用

王雅麗，李雪龍，余 萍，閔祥博，矯艷平*，李東紅

（1.江西仁仁健康產(chǎn)業(yè)有限公司，江西 樟樹 331200；2.遠(yuǎn)大生命科學(xué)（遼寧）有限公司，遼寧 沈陽 110171）

高血壓是指以體循環(huán)動(dòng)脈血壓（收縮壓和/或舒張壓）增高為主要特征，伴或不伴心、腦、腎等器官功能或器質(zhì)性損傷的心血管綜合征[1-2]。目前臨床中針對(duì)高血壓患者多采用常規(guī)降血壓藥物進(jìn)行治療，但此類藥物通常需長期應(yīng)用才可見明顯效果，且患者經(jīng)長期用藥后會(huì)面臨較多的毒副作用與不良反應(yīng)，因而探索相對(duì)安全、無副作用的治療方式顯得尤為重要。近年來，諸多研究表明，高血壓和腸道菌群的失調(diào)具有直接關(guān)系，而且口服益生菌制品可通過改善腸道菌群進(jìn)而明顯降低血壓[3]。此外，高血壓的控制與多種代謝途徑有關(guān)，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin convertingenzyme，ACE）的調(diào)節(jié)是一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因素[4-5]。ACE是從人體組織和體液中發(fā)現(xiàn)的一種二肽羧肽酶，通過將血管緊張素I轉(zhuǎn)化成血管緊張素Ⅱ來提高血壓[6]，在人體心血管系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用。

益生菌是一類對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生有益作用的活性微生物，可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡以及腸道微生物的代謝活動(dòng)[7-8]。研究表明，益生菌在發(fā)酵過程中通過其胞外蛋白酶、肽酶（羧肽酶、氨肽酶）的水解作用，將食物蛋白（如乳蛋白）中具有降壓活性的肽片段釋放出來，它們能與ACE活性中心結(jié)合，競爭性地抑制ACE活性，使血管緊張素Ⅰ不能轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，并催化緩激肽水解成為失活片段，從而起到降血壓的作用[9-10]。因此，具有降血壓功能的益生菌篩選與研究成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點(diǎn)。

本試驗(yàn)以體外ACE抑制率為考察指標(biāo)，采用ACEKit-WST試劑盒[11-12]篩選ACE活性抑制能力較強(qiáng)的菌株，從而獲得降血壓功能菌株，并考察菌株的耐受性，以期為菌株的進(jìn)一步應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）HCS01-013：中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.19510；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）（菌株編號(hào)HOD02-001、HEL07-034、HEX12-005）；羅伊氏乳桿菌（Lactobacillusreuteri）（菌株編號(hào)ARD-12、AOD-17、ADF-23）；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）（菌株編號(hào)AMA-01、AME-03）；瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）（菌株編號(hào)BDL-01、BHL-15、BFL-21）：本公司菌種庫保存。

1.1.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉、胃蛋白酶（酶活≥3 000 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（酶活≥5 000 U/g）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：生工生物工程（上海）股份有限公司；脫脂乳：飛鶴乳業(yè)有限公司；ACEKit-WST試劑盒：日本同仁化學(xué)研究所。本研究所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基[13]：酵母蛋白胨12 g，牛肉粉4 g，酵母粉3 g，磷酸二氫鉀2 g，乙酸鈉3 g，葡萄糖25 g，七水合硫酸鎂0.58 g，四水合硫酸錳0.25 g，吐溫800.6 g，番茄汁10 mL，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH至6.2，115 ℃滅菌30 min；固體培養(yǎng)基瓊脂添加量2%。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-500BS恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TGL-16M低溫高速離心機(jī)：長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PHS-25酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DZKW-S-4恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；JA2003N電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；101-1ES電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；MDF-382E（CN）醫(yī)用低溫箱：松下冷鏈（大連）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將保藏于-80 ℃冰箱的試驗(yàn)菌株取出，室溫條件下解凍、混勻，取1環(huán)菌液于改良MRS固體培養(yǎng)基劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h；選取菌落形態(tài)、大小一致的單菌落接種至5 mL改良MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)17 h；將菌液全部接種至100 mL改良MRS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)17 h，得到活化3代后的菌液，待用[14]。

將上述得到的3代菌液以3%的接種量，接種至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%的脫脂乳中[15]，37 ℃培養(yǎng)20 h，測定pH，并調(diào)節(jié)至6.0±0.02。取適量培養(yǎng)物，于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，再次將pH調(diào)整至6.0±0.02；取上清液1 mL，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取離心后的上清液為待測樣品[16]。

1.3.2 ACE抑制率檢測

本試驗(yàn)為篩選具有ACE抑制率高的菌株，采用ACEKit-WST試劑盒對(duì)12株供試菌株ACE的抑制率進(jìn)行檢測，按照表1添加量分別在酶標(biāo)板中加入待測樣品、去離子水、底物緩沖液和酶工作液，37 ℃反應(yīng)1 h后，按照試劑盒說明書配制指示劑工作液，加入指示劑工作液，室溫條件下（20～25 ℃）反應(yīng)10 min（見表1），立即在波長450 nm處測定吸光度值[17]。

表1 各孔添加溶液的體積及反應(yīng)條件Table 1 Volume and reaction conditions of solution addition in each well

1.3.3 模擬胃、腸液試驗(yàn)

取上述1.3.1制得的菌液振蕩搖勻，取菌懸液10 mL離心（5 000×g、10 min、5 ℃）獲得菌泥，用PBS沖洗3次，獲得的菌泥重懸于10 mL模擬胃液中，37 ℃條件下消化3 h，分別于0 h、3 h取樣，按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》中的方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；將傳代三次的菌液振蕩搖勻，取菌懸液10 mL離心（5 000×g、10 min、5 ℃）獲得菌泥，用PBS沖洗3次，獲得的菌泥重懸于10 mL的人工腸液中，37 ℃條件下培養(yǎng)，于0、2 h、4 h分別取樣測活菌數(shù)[18-19]，計(jì)算菌株存活率。

1.3.4 耐酸試驗(yàn)

將傳代3次的菌液按照10%的接種量分別接種于空白對(duì)照、pH2.0和pH3.0的基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基中。37 ℃靜置培養(yǎng)，于17 h取樣，用滅菌的生理鹽水進(jìn)行一系列的10倍稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1 000 μL進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度3次重復(fù)，37 ℃靜置培養(yǎng)36～48 h后計(jì)數(shù)。

1.3.5 耐膽鹽試驗(yàn)

將活化3次的菌液按照10%的接種量分別接種于空白對(duì)照及不同膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、0.5%、1.0%、1.5%的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，于17 h取樣，用滅菌的生理鹽水進(jìn)行系列10倍稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1 000 μL進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度3次重復(fù)，37 ℃靜置培養(yǎng)36～48 h后計(jì)數(shù)。

1.3.6 計(jì)算公式

ACE酶抑制率計(jì)算公式如下：

式中：A450（樣品）為加入待測樣品及酶液的反應(yīng)液在波長450 nm處的吸光度值；A450（blank1）為加入去離子水及酶液的反應(yīng)液在波長450 nm處的吸光度值；A450（blank2）為加入去離子水的反應(yīng)液在波長450 nm處的吸光度值。

胃腸液內(nèi)菌株存活率計(jì)算公式如下：

式中：N1表示人工胃腸液中培養(yǎng)不同時(shí)間后取樣計(jì)數(shù)測得的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示空白對(duì)照組，即0 h時(shí)測得的活菌數(shù)，CFU/mL。存活率為取對(duì)數(shù)值后的比例。

耐酸試驗(yàn)菌株存活率計(jì)算公式如下：

式中：N2表示不同pH條件培養(yǎng)后取樣計(jì)數(shù)測得的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示空白對(duì)照試驗(yàn)測得的活菌數(shù)，CFU/mL。存活率為取對(duì)數(shù)值后的比例。

耐膽鹽試驗(yàn)菌株存活率計(jì)算公式如下：

式中：N3表示不同膽鹽濃度條件培養(yǎng)后取樣計(jì)數(shù)測得的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示空白對(duì)照試驗(yàn)測得的活菌數(shù)，CFU/mL。存活率為取對(duì)數(shù)值后的比例。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。差異顯著性采用SPSS 19.0分析處理，P＜0.05表示顯著影響，P＜0.01 表示極顯著影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株發(fā)酵液ACE抑制率比較

由圖1可知，12株試驗(yàn)菌株中有4株菌的ACE抑制率都在40%以上，表現(xiàn)出較好的ACE抑制作用，分別是鼠李糖乳桿菌HOD02-001、鼠李糖乳桿菌HCS01-013、鼠李糖乳桿菌HEX12-005、嗜酸乳桿菌AMA-01；其中鼠李糖乳桿菌HCS01-013的ACE抑制率為61.54%，明顯高于其他菌株，因此進(jìn)一步對(duì)其耐受性進(jìn)行研究。3株羅伊氏乳桿菌對(duì)ACE的抑制水平較為接近且普遍偏低，平均抑制率為21.16%，而瑞士乳桿菌的平均抑制率為36.09%。王睿等[20]研究利用堿性蛋白酶酶解雙孢菇蛋白產(chǎn)生的ACE抑制率最大，此時(shí)ACE抑制率可達(dá)43.75%；朱啟鵬等[21]應(yīng)用粉碎、超聲獲得生姜、枸杞、梔子的混合醇提物，以麥芽糊精、變性淀粉、兩者混合分別與明膠作為復(fù)合包埋壁材，利用噴霧干燥制成微膠囊微膠囊經(jīng)胃腸消化后其中ACE抑制率為49.64%。

圖1 不同菌株發(fā)酵液ACE抑制率比較Fig.1 Comparison of ACE inhibition rates in fermentation broth of different strains

2.2 鼠李糖乳桿菌HCS01-013模擬胃、腸液試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模擬胃液試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，與對(duì)照菌株相比，鼠李糖乳桿菌HCS01-013菌株在模擬胃液中的存活能力較強(qiáng)，經(jīng)3 h處理，活菌對(duì)數(shù)值變化趨勢(shì)較小，仍可達(dá)到9.14以上，且存活率達(dá)99.9%。說明鼠李糖乳桿菌HCS01-013在胃內(nèi)有較高的存活率，為發(fā)揮益生作用提供基礎(chǔ)。

表2 鼠李糖乳桿菌HCS01-013模擬胃液試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of simulated gastric juice tests of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013

2.2.2 模擬腸液試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，鼠李糖乳桿菌HCS01-013菌株在模擬腸液中的活菌對(duì)數(shù)值略趨于一致，4 h后仍可達(dá)到9.1以上，此時(shí)存活率為99.7%，表明鼠李糖乳桿菌HCS01-013菌株在模擬腸液中的存活能力較強(qiáng)，能夠以較高的活性進(jìn)入腸液環(huán)境并存活。

表3 鼠李糖乳桿菌HCS01-013模擬腸液試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of simulated intestinal juice tests of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013

2.3 菌株HCS01-013的耐酸環(huán)境能力測定結(jié)果

由表4可知，在pH 3.0的條件下，菌株HCS01-013的存活率為88.85%。在pH 2.0的條件下，活菌數(shù)雖有所下降，但存活率仍達(dá)71.95%，說明鼠李糖乳桿菌HCS01-013的耐酸性較好。

表4 鼠李糖乳桿菌HCS01-013在不同pH溶液中的活菌數(shù)及存活率Table 4 Viable count and survival rate of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013 in different pH solution

2.4 菌株HCS01-013的耐膽鹽能力測定結(jié)果

由表5可知，在0.3%的膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)環(huán)境下，菌株HCS01-013的存活率為99.67%，當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升到1.5%時(shí)，活菌數(shù)略下降，鼠李糖乳桿菌HCS01-013存活率為96.79%，說明其耐膽鹽能力較強(qiáng)。

表5 鼠李糖乳桿菌HCS01-013不同濃度膽鹽溶液中的活菌數(shù)及存活率Table 5 Viable count and survival rate of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013 in bile salt solution of different concentration

3 討論

試驗(yàn)表明，鼠李糖乳桿菌HCS01-013能夠有效抑制ACE的活性，具有較強(qiáng)的降血壓功能，同時(shí)在模擬人體胃腸道環(huán)境下有較強(qiáng)的耐受能力，在耐酸和耐膽鹽試驗(yàn)中菌株存活率較高，能夠通過耐受胃腸道環(huán)境到達(dá)腸道發(fā)揮降血壓作用。ACE是使血壓升高的關(guān)鍵性酶，而益生菌的降血壓主要在于能夠通過代謝產(chǎn)生蛋白酶，進(jìn)而降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的肽段對(duì)ACE產(chǎn)生抑制作用[22-23]。還有研究表明，某些益生菌能夠產(chǎn)生γ-氨基丁酸，通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，作用于脊髓的血管運(yùn)動(dòng)中樞，能有效的促進(jìn)血管擴(kuò)張，從而起到降血壓的作用[24]。此外，吳正均等[25]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LC2W的細(xì)胞自溶物對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠具有顯著的降壓作用，而這種降壓作用主要來自于細(xì)胞自溶物的多糖一肽聚糖復(fù)合物。試驗(yàn)僅從益生菌發(fā)酵乳對(duì)ACE活性的抑制這一方向入手，研究鼠李糖乳桿菌HCS01-013的降血壓功能，后續(xù)研究可以從γ-氨基丁酸和菌體自溶物兩個(gè)方向進(jìn)行摸索試驗(yàn)，進(jìn)一步探究鼠李糖乳桿菌HCS01-013的降血壓機(jī)制。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過測定12種菌株發(fā)酵液的ACE抑制率，得到鼠李糖乳桿菌HCS01-013的ACE抑制率最高為61.54%。其在模擬胃液環(huán)境中存活率達(dá)99.9%；在模擬腸液環(huán)境4 h后存活率為99.7%；在pH2.0的條件下存活率仍達(dá)71.95%；膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.5%時(shí)，存活率為96.79%，說明鼠李糖乳桿菌HCS01-013能夠在胃液和腸道中發(fā)揮活性作用，且降血壓能力較強(qiáng)，具有較高的降血壓應(yīng)用價(jià)值以及開發(fā)前景。