提高乳酸菌耐膽鹽能力的研究

王保根，龐泳，陳思貝

（黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南駐馬店 463000）

乳酸菌作為一種優(yōu)良的益生元，在食品、養(yǎng)殖、保健和醫(yī)藥等方面得到了極大的推廣和應(yīng)用，尤其是在腸道微生物健康成為人們關(guān)注熱點的今天，益生菌的開發(fā)成為熱點研究內(nèi)容[1]。乳酸菌想要發(fā)揮其益生作用，就必須定植于人體內(nèi)環(huán)境[2]。這就要求乳酸菌能抵抗胃的強(qiáng)酸環(huán)境以及膽鹽的毒性作用[3]。乳酸菌自身產(chǎn)乳酸，對于酸性環(huán)境有一定的抗性；而對于含有膽鹽的環(huán)境，不同的乳酸菌表現(xiàn)出不同的抗性?？梢源_定的是，乳酸菌具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力，才能更好地在腸道發(fā)揮其益生作用[4]。

耐膽鹽能力是篩選乳酸菌的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，目前對于乳酸菌耐膽鹽能力的研究已有諸多報道，但是對于乳酸菌耐膽鹽的機(jī)制尚不完全清楚[5]。通過人為來提高乳酸菌耐膽鹽的能力，不僅可以更好地利用這些生物資源，也能幫助人們探究乳酸菌耐膽鹽的機(jī)制，以更好地發(fā)揮乳酸菌作為益生菌的作用，為人類的生產(chǎn)生活帶來福音。

1 乳酸菌的耐膽鹽機(jī)制

目前，人們對于乳酸菌耐膽鹽的機(jī)制了解得還不全面，通過篩選具有較強(qiáng)耐膽鹽能力的優(yōu)良乳酸菌，可以對耐膽鹽機(jī)制有一定的初步了解。目前的研究中，認(rèn)為乳酸菌的耐膽鹽機(jī)制大致可以分為3類：膽鹽水解酶的作用、細(xì)胞的自我保護(hù)作用以及相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。

膽鹽水解酶是一類廣泛存在于哺乳動物腸道微生物中的胞內(nèi)酶，由BSH基因編碼。乳酸菌作為腸道微生物的優(yōu)勢菌群之一，本身可表達(dá)膽鹽水解酶，進(jìn)行膽鹽修飾，將膽鹽水解成游離的膽汁酸和氨基酸，以此來抵御膽鹽對自身的毒性作用[6-9]。

從抑菌的機(jī)制來看，膽鹽能夠與細(xì)胞膜上的脂肪酸相互作用，改變了細(xì)胞膜的物理及化學(xué)性質(zhì)，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生變化，從而使菌體破裂死亡[10-12]。乳酸菌在含有膽鹽的環(huán)境中會發(fā)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，為維持細(xì)胞膜的正常生理功能，細(xì)胞膜的脂肪酸會發(fā)生變化，細(xì)胞膜表面蛋白的表達(dá)同樣發(fā)生變化；同時乳酸菌也會利用小分子糖類物質(zhì)，產(chǎn)生的ATP通過H+-ATP酶排出質(zhì)子來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)pH值的動態(tài)平衡，以防止細(xì)胞酸化，保護(hù)乳酸菌在膽鹽環(huán)境中的正常形態(tài)。

膽鹽脅迫會使蛋白質(zhì)折疊或變形，烏日娜[13]、安浩然[14]在含有膽鹽的環(huán)境中培養(yǎng)乳酸菌并分析其蛋白質(zhì)組的變化，發(fā)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了變化，推測其中多種蛋白質(zhì)在乳酸菌耐膽鹽方面發(fā)揮了重要作用。

2 提高乳酸菌株耐膽鹽能力的措施

2.1 馴化培養(yǎng)

Chou等[15]研究發(fā)現(xiàn)，用膽鹽選擇性馴化乳桿菌的膽鹽耐受性是有效的，經(jīng)過幾代膽鹽馴化后得到的乳桿菌，耐膽鹽能力比親代乳桿菌強(qiáng)。通過馴化，使乳酸菌長期生活在最佳生存范圍偏一側(cè)的環(huán)境條件下，久而久之就會導(dǎo)致乳酸菌耐受曲線的位置移動。張穎[16]對分離自乳液及乳制品中的27株植物乳桿菌進(jìn)行膽鹽馴化培養(yǎng)，最終得到了具有較強(qiáng)耐膽鹽能力的植物乳桿菌。

研究發(fā)現(xiàn)，對乳酸菌進(jìn)行耐膽鹽馴化培養(yǎng)是可行的，同時對乳酸菌進(jìn)行其他方面的馴化培養(yǎng)也有類似的效果。宋照軍等[17]通過耐硒篩選，確定嗜熱鏈球菌為耐硒菌種，以濃度梯度法對其進(jìn)行馴化，最終得到富硒菌種；馬新新[18]從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸菜汁中分離到32株乳酸菌，測定了其在不同糖濃度的MRS改良液體培養(yǎng)基中的生長狀況，篩選出了兩株耐高糖乳酸菌S5-1和S6-3，對其進(jìn)行耐高糖馴化，使兩株菌的耐糖能力分別提高至55%和50%；趙戎蓉[19]通過溫度梯度法對乳酸菌株進(jìn)行馴化，成功獲得耐60 ℃高溫的乳酸菌 ATCC 4356。

2.2 利用外源物質(zhì)

益生菌除自身具有一定的耐膽鹽能力外,與其同時使用的食物載體原料也會影響益生菌活性[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，一些谷物的提取物能明顯增強(qiáng)乳酸菌耐膽鹽的能力。

曾東等[22]將乳酸菌培養(yǎng)在含有玉米、豆粕、麥麩提取物以及1%膽鹽的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)乳酸菌的耐膽鹽能力明顯增強(qiáng)；靳志強(qiáng)等[23]將小米提取物添加到含有膽鹽的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)乳酸菌對膽鹽的抗性明顯提高。

他們推測，乳酸菌能夠利用這些外源物質(zhì)中的糖類物質(zhì)產(chǎn)生ATP，通過H+-ATP酶排出質(zhì)子來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)pH值的動態(tài)平衡，來防止細(xì)胞酸化。盡管不同的菌種在這些食物的提取液中，對膽鹽的抗性是有差別的，但可以肯定的是，對膽鹽的耐受性都有了一定程度的提高。

Kimoto等[24]將六株乳球菌接種在含有吐溫-80的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其對抗膽汁的能力增強(qiáng)。實驗中發(fā)現(xiàn)，在含有吐溫-80的肉湯培養(yǎng)基中，乳球菌細(xì)胞膜的脂肪酸組成模式存在差異：在含有吐溫-80的環(huán)境中生長的乳球菌，十六烷基脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸明顯降低，而十八碳烯酸含量明顯增加。

雖然目前尚不清楚在對抗膽汁中起關(guān)鍵作用的脂肪酸的種類，但是可以肯定的是，吐溫-80等非離子洗滌劑在一定程度上可以改變細(xì)菌脂肪酸的分布模式，從而使細(xì)胞膜的疏水性增強(qiáng)、通透性降低，以此來維持細(xì)胞的穩(wěn)定，提高對膽汁的耐受力，Boever[25]、Conway[26]等也有類似的發(fā)現(xiàn)。

2.3 分泌膽鹽水解酶（BSH）

膽鹽水解酶對結(jié)合型膽鹽的解離可以被看作一種解毒機(jī)制[27]，在乳酸菌消除膽鹽對其自身影響的各種機(jī)制中，攜有膽鹽水解酶（BSH）活性被認(rèn)為是乳酸菌為了適應(yīng)腸道中的膽汁環(huán)境而進(jìn)化出的一種應(yīng)對策略[28-29]。有研究表明，菌體分泌的膽鹽水解酶活力越髙，其在膽鹽環(huán)境中的存活率越高[30-31]。

膽鹽是由膽汁酸與?；撬?、甘氨酸結(jié)合形成的鈉鹽或鉀鹽，即牛磺酸結(jié)合膽鹽和甘氨酸結(jié)合膽鹽。膽鹽水解酶能夠水解這種結(jié)合型膽鹽，使膽酸和氨基酸鏈接的酰胺鍵打開，生成游離的膽汁酸和氨基酸。盡管目前仍不清楚膽鹽水解酶特異性識別膽鹽的具體部分，但無論是膽酸部分還是氨基酸，最終都是將其水解成對菌體影響較小的非結(jié)合型膽鹽。

結(jié)合型膽鹽會引起細(xì)菌表面疏水性及表面電勢等表面特征的變化，使得細(xì)胞膜通透性和流動性發(fā)生變化，鑲嵌在膜里面的酶系統(tǒng)發(fā)生紊亂，與之對應(yīng)的功能不能正常運轉(zhuǎn)。高濃度的結(jié)合型膽鹽甚至能夠直接溶解細(xì)胞膜中的脂質(zhì)，造成膜蛋白分離，使細(xì)胞死亡[32]。從這點來說，被水解后的非結(jié)合型膽鹽，膽酸部分雖然依舊可以通過反轉(zhuǎn)擴(kuò)散至細(xì)胞中對菌體造成毒性，但本身由于是弱酸，比結(jié)合型膽鹽對細(xì)菌本身造成的毒害要少很多。

隨著對膽鹽水解酶研究的加深，人們逐漸認(rèn)識到應(yīng)該將具有高膽鹽水解酶活性作為優(yōu)良乳酸菌的篩選標(biāo)準(zhǔn)。畢潔等[33]通過基因工程將兩個外源性膽鹽水解酶表達(dá)在乳酸乳球菌中，發(fā)現(xiàn)其對膽鹽的抗性大大增強(qiáng)。

當(dāng)然，膽鹽水解酶作為一種活性酶，其表達(dá)量越多，生成的膽酸也就越多。膽酸對于細(xì)菌本身是不利的，提高膽鹽水解酶的底物專一性、減少對細(xì)菌有害膽酸的生成，依舊是今后研究的一大方向。

2.4 包埋

腸道中食物的存在也影響著乳酸菌在腸道中的存活率。Hou等人[34]建立了一種乳酸菌保護(hù)技術(shù)，將細(xì)菌細(xì)胞包裹在人工芝麻油乳劑中，以對抗模擬胃腸道環(huán)境。這種純化芝麻油是由99%的石油、0.5%的磷脂、0.5%的蛋白質(zhì)在70 ℃加熱1 h后生成的。將脫脂乳培養(yǎng)的細(xì)菌包埋在芝麻油以及植物油組成的人工油乳劑中，發(fā)現(xiàn)在4～6℃環(huán)境下被包埋16 d的乳酸菌與未包埋相比存活率顯著上升（從0.023%到5.450%）。結(jié)果表明，人工芝麻油乳狀液可作為一種包封乳酸菌的生物膠囊。

3 結(jié)語

乳酸菌耐膽鹽機(jī)制是一個極其復(fù)雜的過程，從基因的表達(dá)到外源物質(zhì)的利用，乳酸菌通過一系列的手段來應(yīng)對膽鹽脅迫，以此來提高菌體本身對膽鹽的耐受性。

目前，市場上已經(jīng)存在很多乳酸菌益生產(chǎn)品，如酸奶、乳酸菌活菌膠囊等。雖然廠家標(biāo)注了活菌數(shù)，但有學(xué)者檢測過這些乳酸菌產(chǎn)品的活菌數(shù)，很多產(chǎn)品都是遠(yuǎn)小于廠家標(biāo)出的數(shù)值。即使活菌數(shù)達(dá)到廠家所標(biāo)注的數(shù)量，但每個人的腸胃環(huán)境又有著諸多區(qū)別，乳酸菌到達(dá)腸胃能否能發(fā)揮其益生作用還有待考究。

隨著益生菌在疾病治療方面的發(fā)展和對益生菌越來越高的要求，破解乳酸菌的耐膽鹽機(jī)制十分重要。探究乳酸菌耐膽鹽能力提高的過程事實上也是進(jìn)一步探索乳酸菌耐膽鹽機(jī)制的過程。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)的發(fā)展，研究者們將有更多的辦法來探究乳酸菌在腸道環(huán)境中一系列生理變化。相信在不久的將來，人們能夠更好地利用這些生物資源，充分發(fā)揮益生菌的益生作用，為人類造福。