膽鹽在肝移植術(shù)后缺血性膽道病變中的作用及研究進(jìn)展

劉漢林 代鑫 肖奕君 吳畏

近幾十年來(lái)隨著器官移植技術(shù)不斷發(fā)展，肝移植已成為治療終末期肝病的有效手段。但是肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥一直是影響肝移植受者長(zhǎng)期生存和生活質(zhì)量的最主要原因之一，其發(fā)生率為25%～38%，在活體肝移植的受者中可高達(dá)64%，病死率可高達(dá)19%[1]。而在肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥中，缺血性膽道病變（ischemic-type biliary lesion，ITBL）是最難處理的膽道并發(fā)癥之一。ITBL是指肝移植術(shù)后供肝的膽道樹(shù)出現(xiàn)非吻合口性的狹窄和擴(kuò)張，肝內(nèi)膽道樹(shù)受損，最終導(dǎo)致膽道機(jī)械性梗阻和繼發(fā)性感染[2]，其又稱(chēng)為“非吻合口膽道狹窄”“移植物膽道病”“缺血性膽道損傷”“缺血相關(guān)膽道病變”“缺血性膽道炎”等[1,3]。進(jìn)行性膽汁淤積和血管性膽道炎是ITBL兩個(gè)主要的表現(xiàn)特征。目前臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，疏水性膽鹽可加重肝移植術(shù)后ITBL，而親水性膽鹽則具有細(xì)胞保護(hù)作用[4]。本文將對(duì)新近研究文獻(xiàn)做一綜述，力圖從膽鹽細(xì)胞毒性的角度分析其致病原因，從而為未來(lái)ITBL的診斷和治療研究理清思路。

1 膽鹽與缺血性膽道病變

1.1 膽鹽/磷脂比例失衡可加重ITBL

膽鹽可與磷脂形成微膠粒降低其細(xì)胞毒性，此外磷脂本身對(duì)膽鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也有抑制作用。因此，維持適當(dāng)?shù)哪扄}/磷脂比例對(duì)于保護(hù)膽道上皮細(xì)胞至關(guān)重要。Geuken等[5]發(fā)現(xiàn)，人原位肝移植術(shù)后早期膽鹽/磷脂比例增高，并且與膽道損傷呈正相關(guān)。Yska等[6]在對(duì)豬無(wú)心跳供肝移植的研究中發(fā)現(xiàn)，供肝熱缺血時(shí)間延長(zhǎng)引起術(shù)后膽鹽/磷脂比例增高可以導(dǎo)致膽道損傷。Chen等[7]報(bào)道，冷保存時(shí)間延長(zhǎng)可導(dǎo)致肝移植術(shù)后膽汁中疏水性膽鹽比例增加，并有可能引起膽道損傷。李萌等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Mdr2等位基因缺失的小鼠完全不能分泌卵磷脂，引起肝移植術(shù)后膽汁中的膽鹽/磷脂比例失衡，從而導(dǎo)致膽道損傷。此外，Wang等[9]發(fā)現(xiàn)敲除Mdr2基因（編碼磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的小鼠無(wú)法分泌磷脂，出現(xiàn)疏水性膽鹽的增加，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的膽管樹(shù)損傷。以上研究提示，膽汁中膽鹽/磷脂比例升高，導(dǎo)致膽汁中游離性疏水性膽鹽增加，可增加膽汁中膽鹽的毒性作用，從而引起ITBL的發(fā)生。因此，對(duì)膽磷脂分泌進(jìn)行主動(dòng)調(diào)控可能是治療和預(yù)防肝移植術(shù)后ITBL的一個(gè)新的途徑。

1.2 親水性/疏水性膽鹽比例失衡在ITBL中的作用

膽鹽作為膽汁的主要成分之一，包括疏水性膽鹽和親水性膽鹽。親水性膽鹽主要包括熊去氧膽酸、豬脫氧膽酸、α-鼠膽酸和β-鼠膽酸等。疏水性膽鹽主要包括膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸等。研究證實(shí)，膽鹽的細(xì)胞毒性與其疏水性程度有關(guān)[4]，并且疏水性越強(qiáng)，其細(xì)胞毒性就越大。

近年來(lái)的研究也開(kāi)始關(guān)注移植肝缺血-再灌注過(guò)程中膽汁及其成分對(duì)膽道系統(tǒng)的影響[10]。有研究證實(shí)，在供肝切取灌注前從靜脈緩慢注入親水性的熊去氧膽酸和去氫膽酸對(duì)膽管上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。此外研究還發(fā)現(xiàn)，供者術(shù)前靜脈注射親水性膽鹽牛磺酸脫氧膽酸鹽可以改善術(shù)后移植肝功能，增加膽汁流量[11]。由此可知，親水性膽鹽的預(yù)處理可以增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，進(jìn)而增加移植肝對(duì)冷保存或再灌注損傷的耐受能力，減輕肝移植術(shù)后的缺血-再灌注損傷。在Falasca等[12]的研究中也證實(shí)，在人肝獲取和冷藏過(guò)程中使用?；蛆Z脫氧膽酸對(duì)移植肝的缺血-再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，供肝冷缺血-再灌注損傷可引起膽汁中親水性膽鹽比例降低，疏水性膽鹽比例相對(duì)升高，而親水性/疏水性膽鹽比例的失衡與ITBL的嚴(yán)重程度相關(guān)。因此，親水性/疏水性膽鹽平衡可能是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制，一旦這種平衡被打破則有可能對(duì)肝臟和膽道造成潛在的危害，主動(dòng)調(diào)控親水性/疏水性膽鹽的比例，可能是減輕ITBL的策略之一。

1.3 膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用

肝細(xì)胞攝取血漿內(nèi)膽鹽、各種有機(jī)物質(zhì)、電解質(zhì)和水排入毛細(xì)膽管腔，形成膽汁，其中膽鹽、磷脂和膽固醇的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)需要依賴(lài)于肝細(xì)胞膜上的肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Hoekstra[13]等研究發(fā)現(xiàn)，完全阻斷大鼠肝臟的動(dòng)脈血供，可以導(dǎo)致大鼠肝細(xì)胞膜的Na+依賴(lài)性的?；撬?鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膽鹽輸出泵和Mdr2的表達(dá)水平均下降。由此可知，移植肝缺血-再灌注或者冷保存損傷將會(huì)影響肝細(xì)胞膜和膽管細(xì)胞膜上膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)或活性改變，從而導(dǎo)致膽汁各種成分（膽鹽、磷脂、膽汁酸）分泌的不平衡，引起膽汁成分變化。此外，Cheng等[14]研究發(fā)現(xiàn)冷保存和再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞膜上頂側(cè)Na+依賴(lài)性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體與基底側(cè)有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白差異性表達(dá)，膽管細(xì)胞內(nèi)膽鹽積聚，加重ITBL。由此可見(jiàn)，膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的正常表達(dá)對(duì)于維持膽鹽的成分及細(xì)胞內(nèi)、外膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的平衡至關(guān)重要，其活性或表達(dá)的改變所導(dǎo)致的膽汁成分變化及細(xì)胞內(nèi)膽鹽蓄積可能是造成肝移植術(shù)后ITBL的重要機(jī)制之一。因此，有效調(diào)節(jié)肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)可能是防治ITBL的有效措施。

2 碳酸氫鹽與缺血性膽道病變

2.1 碳酸氫鹽分泌缺陷介導(dǎo)膽管細(xì)胞損傷

目前認(rèn)為，膽管細(xì)胞分泌碳酸氫根離子（HCO3－）在其細(xì)胞表面形成“碳酸氫鹽傘”可能是抵抗膽鹽毒性的主要機(jī)制之一（圖1）。疏水性膽鹽可誘導(dǎo)多種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞毒性，包括處于低微摩爾濃度疏水性膽鹽中的肝細(xì)胞[15]。與此形成鮮明對(duì)比的是，人膽管上皮細(xì)胞暴露于高毫摩爾濃度的疏水性膽鹽中，但在生理?xiàng)l件下卻能免受疏水性膽鹽的毒性損傷[16]。一方面，膽汁中分泌的HCO3－可能與膽管細(xì)胞所分泌的黏蛋白在膽管上皮細(xì)胞表面形成了一種黏液/HCO3－保護(hù)傘，保護(hù)膽管細(xì)胞免受膽汁中毒性物質(zhì)的損傷；另一方面，HCO3－的分泌可有效阻止膽汁中甘氨酸結(jié)合膽鹽的質(zhì)子化，而非質(zhì)子化的膽鹽不能通過(guò)彌散作用進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致膽管細(xì)胞疏水性膽鹽的毒性損傷。研究發(fā)現(xiàn)，人膽汁中HCO3－和H2O分泌量占總膽汁流量的25%～40%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)嚙齒類(lèi)動(dòng)物[17]。因此，由遺傳、內(nèi)源性或外源性因素引起的這種碳酸氫鹽傘的受損或者缺陷可能導(dǎo)致各種類(lèi)型慢性膽管病，而若能主動(dòng)調(diào)節(jié)HCO3－的分泌，維持膽汁中HCO3－的正常生理濃度，可能對(duì)減輕ITBL具有重要意義。

圖1 膽管細(xì)胞分泌膽汁碳酸氫鹽的主要機(jī)制Figure 1 The main mechanism of bile bicarbonate secretion by bile duct cells

在人和大鼠膽管細(xì)胞中，陰離子交換蛋白（anion exchanger，AE）2與頂膜Cl－通道結(jié)合，被認(rèn)為是HCO3－分泌的主要介質(zhì)[18]。AE2是膽管上皮細(xì)胞中表達(dá)的主要AE蛋白，特別是在中小膽管的管腔膜上[19]。AE2是一種Na+非依賴(lài)性的Cl－/HCO3－陰離子交換器，它通過(guò)質(zhì)膜交換Cl－和HCO3－，并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH值。此外，AE2調(diào)節(jié)膽汁HCO3－的分泌，并在頂端膽管細(xì)胞管腔上形成膽汁碳酸氫鹽傘，保護(hù)膽管上皮細(xì)胞免受疏水性膽鹽細(xì)胞毒性的損害[17]。在另一項(xiàng)研究中同樣發(fā)現(xiàn)，在pH值=7.4時(shí)，永生化膽管細(xì)胞AE2基因敲除后，0.75 mm鵝脫氧膽酸鹽和2 m m糖醛酸去氧膽酸鹽誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞分別增加3倍和2倍[20]。當(dāng)膽鹽暴露過(guò)程中pH值升高至8.0時(shí)，可將AE2基因敲除細(xì)胞從膽鹽毒性中解救出來(lái)。由此推測(cè)，當(dāng)AE2活性降低時(shí)膽管上皮細(xì)胞HCO3－分泌減少，一方面導(dǎo)致細(xì)胞外碳酸氫鹽傘保護(hù)屏障的破壞，促進(jìn)膽鹽質(zhì)子化而不受控制地彌散入膽管上皮細(xì)胞；另一方面，HCO3－分泌缺陷導(dǎo)致其在膽管細(xì)胞內(nèi)積聚引起細(xì)胞內(nèi)pH值升高，致使有毒的非極性疏水性膽鹽在膽管上皮細(xì)胞內(nèi)積聚，加重膽管細(xì)胞的損傷。

2.2 碳酸氫鹽激活可溶性腺苷酸環(huán)化酶導(dǎo)致膽管細(xì)胞損傷

研究發(fā)現(xiàn)，AE2下調(diào)不僅使H69膽管細(xì)胞對(duì)膽鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（bile salt induced apoptosis，BSIA）敏感，而且使H69膽管細(xì)胞對(duì)依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也有敏感性[21]。此研究提示AE2下調(diào)可能對(duì)膽管細(xì)胞凋亡產(chǎn)生廣泛影響，并表明可能存在其他影響膽管細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。因此推測(cè)，除AE2的下調(diào)允許更多的膽鹽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使膽管細(xì)胞對(duì)凋亡刺激敏感外，細(xì)胞內(nèi)碳酸氫鹽滯留（即由碳酸氫鹽反應(yīng)因子介導(dǎo)）也會(huì)使膽管細(xì)胞對(duì)凋亡刺激敏感。

在各種細(xì)胞內(nèi)酸堿感受器中，可溶性腺苷酸環(huán)化酶（soluble adenylyl cyclase，sAC）似乎是最有可能的候選因子，因?yàn)樗梢员患?xì)胞內(nèi)的碳酸氫鹽直接刺激。sAC首次在成年大鼠睪丸的胞漿部分被檢測(cè)到[22]。最初認(rèn)為sAC只在睪丸表達(dá)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)其也表達(dá)于其他組織，包括肝臟、膽管細(xì)胞以及活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞[23-25]。sAC是一種進(jìn)化上保守的碳酸氫鹽感受器，能夠感知碳酸氫鹽的增加，并提高細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性。首先，來(lái)自AE2缺陷[（a，b）（-/-）]小鼠的成纖維細(xì)胞具有堿化的細(xì)胞內(nèi)pH值（由于碳酸氫鹽分泌減少），細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平較高，sAC在信使RNA和蛋白質(zhì)水平上都有較高的表達(dá)。其次，AE2（a，b）（-/-）小鼠由于生精小管和附睪細(xì)胞凋亡增加而不育，這是sAC表達(dá)最豐富的地方[26]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，推測(cè)sAC的激活可能加速BSIA。同樣，Chang等[24]的研究也證實(shí)，抑制sAC不僅能逆轉(zhuǎn)AE2耗竭的H69膽管細(xì)胞易損性的增加，而且還能完全抑制BSIA。因此，有理由認(rèn)為在AE2表達(dá)降低的ITBL患者中，除膽鹽外，其他凋亡誘導(dǎo)因素（如細(xì)胞內(nèi)碳酸氫鹽的滯留）也可能導(dǎo)致膽管細(xì)胞凋亡的增加。此外，sAC在其他模型中也被證實(shí)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的刺激性缺血或酸中毒以及心肌細(xì)胞的刺激性缺血-再灌注損傷[27-28]。

因此，在AE2下調(diào)的背景下，我們提出以下關(guān)于碳酸氫鹽可能參與肝移植術(shù)后ITBL發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)（圖2）。一方面，碳酸氫鹽分泌受損（由于AE2表達(dá)減少）削弱了保護(hù)性的“碳酸氫鹽傘”，促進(jìn)膽鹽質(zhì)子化，導(dǎo)致質(zhì)子化的疏水性膽鹽通過(guò)直接彌散作用穿過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入膽管細(xì)胞，發(fā)揮其毒性效應(yīng)；另一方面，蓄積在細(xì)胞內(nèi)的碳酸氫鹽可誘導(dǎo)sAC表達(dá)并激活sAC，從而促進(jìn)BSIA。

圖2 在AE2下調(diào)情況下sAC參與膽管細(xì)胞損傷的機(jī)制假說(shuō)Figure 2 Mechanistic hypothesis of the involvement of sAC in cholangiocyte injury in the context of AE2 downregulation

3 小 結(jié)

綜上所述，肝移植術(shù)后ITBL嚴(yán)重影響了肝移植受者術(shù)后的長(zhǎng)期生存和生活質(zhì)量，也是導(dǎo)致手術(shù)失敗和再次移植的重要原因。本文首次綜述了膽鹽細(xì)胞毒性以及碳酸氫鹽傘在肝移植術(shù)后ITBL發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，深入分析了AE2表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路在肝移植術(shù)后ITBL發(fā)病機(jī)制中的可能作用，展現(xiàn)了膽汁成分調(diào)節(jié)及HCO3－分泌調(diào)節(jié)在肝移植術(shù)后ITBL預(yù)防及治療中的潛在價(jià)值和重要性。在臨床上，除了改進(jìn)外科手術(shù)技術(shù)外，應(yīng)繼續(xù)探索肝移植術(shù)后膽汁成分變化及HCO3－分泌缺陷的生物學(xué)機(jī)制，為尋找肝移植術(shù)后ITBL敏感預(yù)測(cè)指標(biāo)及干預(yù)靶點(diǎn)提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為制定肝移植術(shù)后ITBL防治策略開(kāi)辟新的途徑。