高效液相色譜法測定復(fù)方胰酶片中膽酸和牛磺豬去氧膽酸的含量

唐 娜,宋 莉,賈麗華,戴 涌,張 莉

(1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,西安 710065; 2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院,西安 710003)

復(fù)方胰酶片是胰酶和豬膽膏制成的腸溶衣片,可促進(jìn)蛋白質(zhì)、淀粉及脂肪的消化,增強(qiáng)食欲,用于治療消化不良、食欲不振等[1-2]?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法中主要是對胰酶進(jìn)行了有效控制,而缺少對另一主要成分豬膽膏的有效控制。豬膽膏是豬膽去皮取汁,過濾,濾液濃縮成干膏而制得,其具有清熱潤燥、止咳平喘、解毒等作用[3],豬膽膏的生產(chǎn)工藝簡單,所含成分久放易發(fā)酵變質(zhì),進(jìn)而導(dǎo)致有效成分降低。膽汁酸是膽汁的主要成分,約占膽汁總量的50%～70%,主要由膽酸、?；秦i去氧膽酸等組成。文獻(xiàn)報(bào)道多采用薄層色譜掃描法、紫外分光光度法和酸堿滴定法等測定膽酸等的含量[4-10],但目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道復(fù)方胰酶片中膽酸和?；秦i去氧膽酸的測定方法。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對豬膽膏中的膽酸采用了反復(fù)回流等提取方法,操作復(fù)雜,容易造成樣品損失,不能有效測定膽酸的含量。為了更好地控制藥品質(zhì)量,保證臨床用藥安全有效,本工作以豬膽膏所含有效成分膽酸和牛磺豬去氧膽酸為指標(biāo),建立了高效液相色譜法測定復(fù)方胰酶片中由原料豬膽膏引入的膽酸和?；秦i去氧膽酸含量的方法,以期提高對豬膽膏所含有效成分的質(zhì)量控制。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配G7115A型二極管陣列檢測器、EMPOWRE色譜工作站;AE-240型電子分析天平;Millipore型超純水機(jī)。

膽酸對照品儲備溶液:2.50 g·L－1,稱取膽酸對照品適量,加甲醇溶解并定容,配制成質(zhì)量濃度為2.50 g·L－1(即每1 mL中約含膽酸2.50 mg)的對照品儲備溶液。

牛磺豬去氧膽酸對照品儲備溶液:0.50 g·L－1,稱取牛磺豬去氧膽酸對照品適量,加甲醇溶解并定容,配制成質(zhì)量濃度為0.50 g·L－1(即每1 mL中約含?；秦i去氧膽酸0.50 mg)的對照品儲備溶液。

膽酸對照品溶液系列:移取膽酸對照品儲備溶液適量,加甲醇溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度分別為0.25,0.50,1.00,1.50,2.50 g·L－1(即 每1 mL各 含膽酸0.25,0.50,1.00,1.50,2.50 mg)的對照品溶液系列。

牛磺豬去氧膽酸對照品溶液系列:移取?；秦i去氧膽酸對照品儲備溶液適量,加甲醇溶解并稀釋制成 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 0.05,0.10,0.15,0.20,0.50 g·L－1(即每1 mL各含?；秦i去氧膽酸0.05,0.10,0.15,0.20,0.50 mg)的對照品溶液系列。

膽酸對照品(批號100078-201415,純度98.9%);?；秦i去氧膽酸對照品(批號111943-201802,純度96.8%);復(fù)方胰酶片3批均由某廠家提供。

甲醇和乙腈均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

十八烷基硅烷鍵合硅膠SunShell HFC18-30色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.6μm)測定膽酸,十八烷基硅烷鍵合硅膠Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)測定牛磺豬去氧膽酸;流動相為體積比35∶65的乙腈-0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)磷酸溶液的混合液;流量為1 mL·min－1;檢測波長為192 nm;柱溫為40℃;進(jìn)樣量為10μL。

1.3 試驗(yàn)方法

取本品10片,研細(xì),分別稱取樣品0.3,0.5 g,加甲醇適量溶解,超聲提取30 min,冷卻,用甲醇分別定容至50,25 mL,搖勻,過濾,取續(xù)濾液分別作為測定膽酸和?；秦i去氧膽酸的供試品溶液,按色譜條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件測定膽酸對照品溶液、?；秦i去氧膽酸對照品溶液,色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the reference substance solutions

2.2 檢測波長的選擇

膽酸和?；秦i去氧膽酸的吸收均為紫外末端吸收,試驗(yàn)采用二極管陣列檢測器在190～400 nm內(nèi)進(jìn)行波長掃描,又分別選定192,200,205,210 nm的波長進(jìn)行測定。結(jié)果顯示:在波長200,205,210 nm處,目標(biāo)峰響應(yīng)低;在波長192 nm處,膽酸和?；秦i去氧膽酸的響應(yīng)較高。因此,試驗(yàn)選擇192 nm作為膽酸和?；秦i去氧膽酸的檢測波長。

2.3 流動相的選擇

試驗(yàn)比較了甲醇和磷酸二氫鈉溶液、乙腈和磷酸溶液2種流動相體系對目標(biāo)物分離效果的影響。結(jié)果顯示:以甲醇和磷酸二氫鈉溶液為流動相進(jìn)行洗脫時,膽酸和?；秦i去氧膽酸色譜峰的峰形差;而以乙腈和磷酸溶液為流動相進(jìn)行洗脫時,膽酸和?；秦i去氧膽酸色譜峰的峰形較好,靈敏度高。試驗(yàn)最終選擇體積比35∶65的乙腈-0.1%磷酸溶液的混合液為流動相。

2.4 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察了Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、SunShell HFC18-30 色 譜 柱(100 mm×4.6 mm,2.6μm)的分離效果。結(jié)果顯示,Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)在測定膽酸時,存在保留時間過長、色譜峰前沿等問題,而對?；秦i去氧膽酸的分離效果比較好。因此,試驗(yàn)選擇SunShell HFC18-30色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.6μm)測定膽酸,而Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)測定?；秦i去氧膽酸。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗(yàn)方法測定對照品溶液系列,記錄色譜圖。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。膽酸和?；秦i去氧膽酸的線性范圍、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

以儀器的3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限(3S/N),結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.6 精密度試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法測定對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,并計(jì)算所得峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of test for precision(n＝6)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法測定對照品溶液,膽酸在放置0,2,4,6,8,21,29 h時進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,計(jì)算膽酸峰面積的RSD,結(jié)果為0.41%;牛磺豬去氧膽酸在放置0,2,4,5,26 h時進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,計(jì)算?；秦i去氧膽酸峰面積的RSD,結(jié)果為3.4%。

2.8 回收試驗(yàn)

稱取復(fù)方胰酶片樣品適量,分別加入膽酸和?；秦i去氧膽酸對照品溶液,按照試驗(yàn)方法平行測定6份,計(jì)算其回收率,結(jié)果見表3。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of test for recovery(n＝6)

由表3可知:膽酸和?；秦i去氧膽酸的回收率分別為91.9%和102%,RSD 分別為2.2%和1.5%。

2.9 樣品分析

取3批供試品,分別按照試驗(yàn)方法測定其中膽酸和?；秦i去氧膽酸的含量,結(jié)果見表4。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of samples

本工作建立了高效液相色譜法測定復(fù)方胰酶片中膽酸和?；秦i去氧膽酸的方法。該方法能有效測定復(fù)方胰酶片中膽酸和?；秦i去氧膽酸的含量,操作簡便、快速,靈敏度高、重現(xiàn)性好,能夠有效控制復(fù)方胰酶片的質(zhì)量。