銅綠假單胞菌半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂

王盼盼，李成婕，何張?zhí)m，顧京賽，倪高玉，齊齊格，詹曉北，吳劍榮

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

鼠李糖脂是由銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)合成的一類陰離子生物表面活性劑，由1～2個鼠李糖和不同碳鏈長度的β羥基脂肪酸兩部分連接組成［1］，具有乳化、增溶、分散、凝聚、發(fā)泡等功能，而且毒性小、易于生物降解，因而在許多領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力［2］。鼠李糖脂發(fā)酵生產(chǎn)的碳源一般是植物油，例如Zhu等［3］以大豆油為底物，在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，產(chǎn)量達(dá)到70.56 g/L。但由此得到的鼠李糖脂的純化工藝復(fù)雜，形成的副產(chǎn)物如甘油單酯和甘油二酯會產(chǎn)生嚴(yán)重乳化現(xiàn)象［4］，增加下游提取成本，這也是鼠李糖脂一直未能得到廣泛應(yīng)用的主要原因。研究表明，甘油也可以用于鼠李糖脂發(fā)酵，而且甘油是生物柴油副產(chǎn)物，其量大且價格便宜［5］。然而與植物油發(fā)酵相比，甘油生產(chǎn)鼠李糖脂產(chǎn)量較低，泡沫問題更嚴(yán)重，較難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)［6-8］。

鼠李糖脂發(fā)酵過程是高好氧過程，其擴(kuò)大生產(chǎn)需要在機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中進(jìn)行，但是發(fā)酵過程中會產(chǎn)生嚴(yán)重的泡沫問題，阻礙鼠李糖脂生產(chǎn)。而固態(tài)發(fā)酵可以避免這種問題，但是對于細(xì)菌來說，溶氧需求量大，要求的水分活度高，可采用半固態(tài)發(fā)酵形式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，解決由于較低水分活度導(dǎo)致產(chǎn)品產(chǎn)量降低的問題［9］。

我國是油菜籽生產(chǎn)大國，產(chǎn)量居世界首位，其榨油后的菜籽粕是十分重要的植物蛋白資源，但是由于菜籽粕含有芥子苷，加之菜籽粕中的植酸和單寧是抗?fàn)I養(yǎng)成分，因此限制了菜籽粕在飼料中的應(yīng)用［10］，使部分菜籽粕被直接用于肥田。另外，菜籽粕中還含有部分油脂，是鼠李糖脂發(fā)酵優(yōu)選底物。本研究采用菜籽粕和麩皮為固態(tài)基質(zhì)，以甘油為碳源，采用半固態(tài)發(fā)酵的方式生產(chǎn)鼠李糖脂。這種方法獲得的鼠李糖脂，可以應(yīng)用于重金屬或有機(jī)物污染土壤的修復(fù)，或者用作生物農(nóng)藥抑制農(nóng)田病菌生長，另外還可促進(jìn)頁面肥料的吸收。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)AB93066，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，NaCl 5，酵母粉5，瓊脂 20，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基(g/L):甘油40，胰蛋白胨10，NaCl 5，酵母粉 5，pH 7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油 40，NaNO36，Na2HPO4·12H2O 1，KH2PO41，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0。

固態(tài)基質(zhì)(g):菜籽粕和麩皮共10.0 g(250 mL搖瓶加入 10 g 基質(zhì))［9］。

1.1.3 主要試劑

蒽酮-硫酸試劑:取0.2 g蒽酮溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)85%H2SO4溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用［11］;乙酸乙酯。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鼠李糖脂的半固態(tài)發(fā)酵

稱取菜籽粕和麩皮按一定的比例共10.0 g，加到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，121℃滅菌20 min，待冷卻后，接種，放到 37 ℃ 搖床 200 r/min 培養(yǎng)，發(fā)酵 12 d［6］，測鼠李糖脂的含量。

1.2.2 鼠李糖脂的提取及測定

發(fā)酵液加入去離子水100 mL，紗布過濾，重復(fù)過濾3次，收集濾液。將濾液8 000 r/min離心15 min，取上清液2 mL，調(diào)上清液的pH為2，加入3倍體積乙酸乙酯分別萃取3次，收集乙酸乙酯相，蒸干乙酸乙酯后加水復(fù)溶即得到鼠李糖脂粗品。取稀釋相應(yīng)倍數(shù)的鼠李糖脂1 mL，加入4 mL的蒽酮硫酸試劑，沸水浴15 min，冷卻，用分光光度計620 nm測吸光值［7］。

1.2.3 乳化能力(E24)的測定

在平底試管中加入5 mL被乳化物和5 mL的鼠李糖脂溶液(1 g/L)，混合液37℃預(yù)熱后高速漩渦振蕩2 min，乳化液37℃放置24 h后測定乳化相體積，并以乳化相體積與總體積比值(%)表示乳化能力［12］。

1.2.4 鼠李糖脂組成結(jié)構(gòu)的測定

本實(shí)驗(yàn)使用 MALDI-TOF MS(Ultrafle Xtreme，Bruker Daltonics，USA)測定發(fā)酵所得鼠李糖脂的組成［13］。使用基質(zhì)為2，5-二羥基苯甲酸，控制軟件為flex Control，分析軟件為 flex Analysis versison3.3，采用氮?dú)饧す猓ㄩL337 nm，實(shí)驗(yàn)方法為RP200-1500(反射模式:正離子)。

2 結(jié)果與討論

2.1 半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的發(fā)酵條件研究

2.1.1 裝液量對鼠李糖脂發(fā)酵的影響

微生物發(fā)酵的主要媒質(zhì)就是水，在固態(tài)發(fā)酵中，含水量較高，導(dǎo)致基質(zhì)多孔性降低，減少了基質(zhì)內(nèi)氣體的體積和氣體交換，難以通風(fēng)、降溫，增加了雜菌污染的危險;而含水量低，造成基質(zhì)膨脹程度低，微生物生長受抑制，尤其后期由于微生物生長及蒸發(fā)造成物料較干，微生物難以生長，產(chǎn)量降低［14］。利用銅綠假單胞菌生產(chǎn)鼠李糖脂是嚴(yán)格好氧發(fā)酵過程，因此采用菜籽粕為原料時，水分控制很重要。采用不同裝液量進(jìn)行半固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯觯罄钐侵S著裝量的增加液有所提高，在裝液量為50/250 mL時鼠李糖脂的產(chǎn)量最高，達(dá)到(14.3±0.29)g/L。隨后鼠李糖脂產(chǎn)量下降，其原因可能是裝液量太大，影響發(fā)酵液傳氧過程。

圖1 不同裝液量對鼠李糖脂發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of medium volumes on rhamnolipids fermentation in flasks

2.1.2 固態(tài)基質(zhì)比例對鼠李糖脂發(fā)酵的影響

固態(tài)發(fā)酵的一個突出優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)基簡單而且來源廣泛，多為便宜的天然基質(zhì)或工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的下腳料。固態(tài)發(fā)酵的原料可分為兩個部分:一是供給養(yǎng)分的營養(yǎng)料，如麩皮、豆粕等;二是促進(jìn)通風(fēng)的填充料，如稻殼、玉米皮、花生皮等［10］。麩皮，是小麥制面粉時的副產(chǎn)品，麩皮中不但含有淀粉、粗蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，而且具有較大的面積，有利于固態(tài)發(fā)酵過程中增強(qiáng)微生物所分泌酶的活力，提高原料利用率［15］。選擇不同的菜籽粕和麩皮的比例研究其對于鼠李糖脂的發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖2所示。可以看出，當(dāng)菜籽粕與麩皮的比例為5∶5時，鼠李糖脂的產(chǎn)量最高，達(dá)到(15.0±0.30)g/L。

圖2 不同的固態(tài)基質(zhì)比例對鼠李糖脂發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of the solid substrate ratio on rhamnolipids fermentation

2.1.3 接種量對鼠李糖脂發(fā)酵的影響

如圖3所示，在接種量為10%時，半固態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂產(chǎn)量最高，達(dá)到(16.0±0.32)g/L。

2.1.4 甘油濃度對鼠李糖脂發(fā)酵的影響

鼠李糖脂發(fā)酵的碳源一般選用植物油，但是甘油作為一種低碳醇的碳源，比不溶于水的碳源更容易被菌體吸收。優(yōu)化選取合適的甘油濃度，可以得到較高濃度的菌體和產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)選取不同甘油濃度進(jìn)行鼠李糖脂半固態(tài)發(fā)酵測試，結(jié)果如圖4所示。

圖3 接種量對鼠李糖脂發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of inoculums volumes on rhamnolipids fermentation

圖4 甘油質(zhì)量濃度對鼠李糖脂發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of different glycerol concent ration on rhamnolipids fermentation

可以看出，甘油濃度較低時，鼠李糖脂濃度較低，隨著甘油濃度的增加，鼠李糖脂的濃度也增加。當(dāng)甘油質(zhì)量濃度為50g/L時，鼠李糖脂的濃度最高，達(dá)到)(16.4±0.33)g/L。繼續(xù)增加甘油的濃度，鼠李糖脂的質(zhì)量濃度不但沒有增加，反而下降，這可能是因?yàn)楦视蜐舛葧黾优囵B(yǎng)基的滲透壓，會抑制菌體的生長，從而影響鼠李糖脂的生成。

2.1.5 NaNO3質(zhì)量濃度對鼠李糖脂發(fā)酵的影響

NaNO3是生產(chǎn)鼠李糖脂最好的氮源，如 Prieto等［16］在用P.aeruginosa LBM10生產(chǎn)鼠李糖脂研究中發(fā)現(xiàn)，盡管NH4NO3(0.4%)和NaNO3(0.85%)對生產(chǎn)鼠李糖脂沒有顯著差異，但是對鼠李糖脂乳化系數(shù)影響較大。尿素和銨硫酸鹽作為氮源效果也不如NaNO3好。培養(yǎng)基中碳和氮的比例(C/N)對微生物的生長和產(chǎn)物形成常有很大的影響，碳氮比不當(dāng)，會影響菌體吸收營養(yǎng)的平衡。如Lotfabad等［17］研究發(fā)現(xiàn)，以NaNO3為氮源時鼠李糖脂產(chǎn)量最高，并且當(dāng)C/N在10/1～30/1之間時，鼠李糖脂產(chǎn)量維持在較高水平，而當(dāng)碳氮比為40/1～50/1時，鼠李糖脂幾乎不再合成。其他研究證實(shí)碳氮比(C/N)為12.5～12.8時有利于鼠李糖脂肪的合成［18-19］。本研究用NaNO3作為氮源，在碳源濃度確定的條件下，優(yōu)化NaNO3的濃度，結(jié)果如圖5所示。可以看出，NaNO3濃度為4 g/L，即 C/N比為19.22時，也在 C/N比10/1～30/1之間，此時鼠李糖脂的含量最高，達(dá)到(18.7±0.37)g/L。

圖5 NaNO3質(zhì)量濃度對鼠李糖脂發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of different NaNO3 concentration on rhamnolipids fermentation

2.2 鼠李糖脂的性質(zhì)

2.2.1 鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)測定

鼠李糖脂結(jié)構(gòu)的測定方法有很多種，文中主要采用MALDI-TOF-MS圖譜分析鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。圖6-a表示液態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂的質(zhì)譜圖，可以發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂主要有一個明顯的最高峰，在m/z 673.4處，代表了 Rha2-C10-C10的［M+Na］+，其他的小峰分別在 m/z 499.3、527.3、553.3、555.30、559.4、645.3、699.4、701.4、729.4 等，分別代表的結(jié)構(gòu) 為 Rha-C8-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C14、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C12、Rha2-C10-C12、Rha2-C12-C12。另外，圖6-b表示半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的鼠李糖脂的質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂在m/z 527.3有一個明顯的最高峰，代表了 Rha-C10-C10的［M+Na］+，其他的小峰分別在 m/z 553.3、555.3、582.3、673.4、701.4等，分別代表的結(jié)構(gòu)為 Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C14、Rha2-C10-C10、Rha2-C10-C12。

圖6 兩種不同發(fā)酵方式生產(chǎn)的鼠李糖脂MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.6 MALDI-TOF mass spectrum of rhamnolipids produced by two different fermentation methods

對液態(tài)和半固態(tài)發(fā)酵獲得鼠李糖脂的相對豐度進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。我們發(fā)現(xiàn)液態(tài)發(fā)酵和半固態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂主要的結(jié)構(gòu)組成發(fā)生較大變化。半固態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂少了組分Rha-C8-C10、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C12∶1、Rha2-C12-C12，即雙鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)組分減少了，液態(tài)發(fā)酵中的單鼠李糖脂所有結(jié)構(gòu)的相對豐度之和為67.41%，雙鼠李糖脂的所有結(jié)構(gòu)的相對豐度之和為171.13%，說明在液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中雙鼠李糖脂所占的比重大。半固態(tài)發(fā)酵單鼠李糖脂所有結(jié)構(gòu)的相對豐度之和為140.35%，雙鼠李糖脂的所有結(jié)構(gòu)的相對豐度之和113.2%，說明在半固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中單鼠李糖脂所占的比重大。單鼠李糖脂的比重提高意味著鼠李糖脂更具有疏水性，形成膠束的能力變強(qiáng)，臨界膠束濃度小，也表明半固態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂比液態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂的表面活性更強(qiáng)。

表1 兩種不同發(fā)酵方式生產(chǎn)的鼠李糖脂MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果Table 1 Analysis of MALDI-TOF mass of rhamnolipids produced by two different fermentation methods

2.2.2 鼠李糖脂乳化能力(E24)測定

鼠李糖脂作為一種生物表面活性劑，具有乳化性、起泡性、浸濕等功能。測定鼠李糖脂的乳化能力能夠代表鼠李糖脂表面性能指標(biāo)。乳化能力的高低通過乳化系數(shù)來證明。通過對5種烴類物質(zhì)進(jìn)行乳化能力(E24)的測試，發(fā)現(xiàn)如圖7所示，半固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂的乳化系數(shù)一般在50%～70%左右，半固態(tài)發(fā)酵比液態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂乳化系數(shù)高，而且半固態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂對環(huán)己烷的乳化系數(shù)達(dá)到了86%。說明半固態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂稍高于液態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂的乳化能力，即表面活性要比液態(tài)發(fā)酵的好。Gudina等［20］研究鼠李糖脂農(nóng)工業(yè)副產(chǎn)品在強(qiáng)化采油和生物修復(fù)應(yīng)用時，測定鼠李糖脂的乳化系數(shù)(E24)為60%。本研究半固態(tài)發(fā)酵獲得鼠李糖脂的乳化能力與文獻(xiàn)報道接近。

圖7 兩種不同發(fā)酵方式生產(chǎn)的鼠李糖脂對烴類物質(zhì)的乳化能力Fig.7 Emulsification activity of rhamnolipids produced by two different fermentations on various hydrocarbons

3 結(jié)論

利用菜籽粕和麩皮，以甘油為唯一碳源，采用半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，通過單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵條件，將鼠李糖脂的產(chǎn)量從14.0 g/L提高到18.7 g/L，產(chǎn)量提高了33.4%。通過MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行相對豐度的分析，發(fā)現(xiàn)液態(tài)發(fā)酵單鼠李糖脂和雙鼠李糖脂的相對豐度為67.41%和171.13%，即液態(tài)發(fā)酵中雙鼠李糖脂所占的比重大;半固態(tài)發(fā)酵單鼠李糖脂和雙鼠李糖脂相對豐度為140.35%和113.2%，即半固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中單鼠李糖脂所占的比重變大，表面活性強(qiáng)。乳化能力測試(E24)表明半固態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂乳化系數(shù)在50%～70%之間，而且乳化系數(shù)比液態(tài)發(fā)酵的大，其乳化能力要強(qiáng)于液態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂。

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