以甘油為底物鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的誘變選育

顧生輝，朱 莉，詹曉北，吳劍榮

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院 教育部糖化學(xué)與糖生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

以甘油為底物鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的誘變選育

顧生輝，朱 莉，詹曉北，吳劍榮

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院 教育部糖化學(xué)與糖生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

通過誘變選育，將銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）RG-14利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂產(chǎn)量由13.6 g/L提高到16.5 g/L。突變株經(jīng)過5次連續(xù)傳代培養(yǎng)，菌株仍維持穩(wěn)定的鼠李糖脂產(chǎn)量，表明該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)分析誘變后菌株發(fā)酵甘油生產(chǎn)鼠李糖脂的組成，結(jié)果顯示鼠李糖脂由Rha-C8-C8、Rha-C8-C10、Rha-C10-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12組成，其中單、雙鼠李糖脂的相對豐度分別為54.8%和45.2%。當(dāng)以工業(yè)粗甘油代替精甘油為底物時，該菌株鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到14.2 g/L，表明其具有較好的應(yīng)用潛力。

銅綠假單胞菌；鼠李糖脂；亞硝基胍誘變；粗甘油

鼠李糖脂是一種研究較為廣泛的陰離子生物表面活性劑，一般由1～2個鼠李糖與1～2個β-羥基脂肪酸連接組成。鼠李糖脂可以作為乳化劑、乳化穩(wěn)定劑、破乳劑、保濕劑和防腐劑等應(yīng)用于食品、日化工業(yè)、農(nóng)業(yè)及環(huán)保等領(lǐng)域［1］。相對于化學(xué)表面活性劑，鼠李糖脂具有低毒性和良好的生物降解性等優(yōu)點。同時，鼠李糖脂的抑菌特性也使其具有成為環(huán)境友好滅菌劑的潛力［2-3］。雖然近年來鼠李糖脂的研究引起了廣泛關(guān)注，但其生產(chǎn)受限于較高的底物成本和昂貴的提取純化工藝［4］。

鼠李糖脂發(fā)酵一般以油料作為底物，例如Zhu等［5］以大豆油為底物，通過兩階段pH調(diào)控手段在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，產(chǎn)量達(dá)到70.56 g/L。但以植物油等作為底物發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂時，發(fā)酵液乳化嚴(yán)重，同時由于游離脂肪酸、單甘油酯和甘油二脂等副產(chǎn)物的存在，鼠李糖脂的分離純化過程復(fù)雜且成本較高。高昂的底物成本和復(fù)雜的分離提取工藝使得尋找一種廉價易得且分離純化方便的替代C源成為研究熱點。目前世界范圍內(nèi)生物柴油產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展使其生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物甘油大量積累，每生產(chǎn)10 t生物柴油就會產(chǎn)生約1 t粗甘油；同時利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的下游提取過程也較為簡單，甘油發(fā)酵鼠李糖脂時的發(fā)酵液只需經(jīng)過簡單的離心或過濾除去菌體即可得到澄清透明的鼠李糖脂發(fā)酵液。因此，以甘油作為鼠李糖脂發(fā)酵的替代C源極具前景。但是目前甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量較低，工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)還難以實現(xiàn)［6-7］，如Silva等［8］利用甘油為唯一C源發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量僅達(dá)到8.0 g/L。

作為一種常用的菌株改良方法，誘變選育被應(yīng)用于鼠李糖脂生產(chǎn)菌株的改良。沈薇等［9］利用紫外誘變及紫外、LiCl復(fù)合誘變成功將P.aeruginosa BS-03鼠李糖脂產(chǎn)量從4.1 g/L提高到6.8 g/L。Lotfabada等［10］通過γ-線誘變獲得1株突變株，鼠李糖脂產(chǎn)量是出發(fā)株的1.5倍。本文中筆者所選用的菌株經(jīng)歷過低溫常壓等離子誘變和低溫常壓等離子加LiCl復(fù)合誘變，對誘變劑已具有一定的抗性。所以將使用公認(rèn)誘變效果顯著的亞硝基胍（NTG）作為誘變劑，通過誘變選育的方法來提高甘油發(fā)酵鼠李糖脂的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa RG-14），購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3.0，NaCl 5.0，胰蛋白胨5.0；pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油 40.0，NaNO36.0，KH2PO41.0，Na2HPO4·12H2O 1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.1；pH 7.0。

藍(lán)色凝膠篩選培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3.0，NaCl 5.0，胰蛋白胨5.0，瓊脂20.0，十六烷基三甲基溴化銨0.001，亞甲基藍(lán)0.02。

1.1.3 試劑

NTG溶液：在通風(fēng)櫥中稱取100 mg NTG于棕色瓶中，加1 mL丙酮使其溶解，溶解后加磷酸鹽緩沖液19 mL，配制成5 g/L NTG溶液。

蒽酮-硫酸試劑：取0.2 g蒽酮溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)75%H2SO4溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

1.2.1 鼠李糖脂高產(chǎn)菌株誘變篩選

從斜面培養(yǎng)基中挑取1環(huán)P.aeruginosa RG-14，接種至50 mL種子培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后，8 000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水沖洗2次，制成菌懸液（細(xì)胞密度控制在108～109個/mL），加入一定量NTG溶液，37℃誘變處理0.5 h，大量稀釋終止反應(yīng)后涂布于篩選平板。

誘變后在篩選平板上挑取產(chǎn)生變色較大的菌株進行初篩，再通過搖瓶發(fā)酵后測定發(fā)酵液中鼠李糖脂濃度進行復(fù)篩。

1.2.2 致死率及突變率測定

按誘變處理方法，用不同濃度的NTG溶液處理菌懸液，處理時間0.5 h，稀釋并涂布于篩選平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，計數(shù)，計算致死率。以出發(fā)菌株鼠李糖脂產(chǎn)量±10%計算正負(fù)突變率。

1.2.3 突變株遺傳穩(wěn)定性測定

對挑選出的菌株連續(xù)傳代5次，分別進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定鼠李糖脂產(chǎn)量、生物量和發(fā)酵結(jié)束時的pH。

1.2.4 鼠李糖脂含量及生物量的測定

發(fā)酵液8 000 r/min離心20 min，取1 mL上清液用3 mL乙醚萃取3次，收集乙醚相，蒸干乙醚后加水復(fù)溶得到樣品。取1 mL適當(dāng)稀釋后的樣品，加5 mL蒽酮-硫酸試劑，沸水浴10 min，冷卻至室溫后在620 nm下測定OD620，測得鼠李糖含量，乘以系數(shù)3即得到鼠李糖脂含量。發(fā)酵液離心后得到的菌體于105℃烘干至恒質(zhì)量，確定其生物量［11］。

1.2.5 鼠李糖脂的提取

發(fā)酵液8 000 r/min離心20 min，取上清液加入3倍體積乙醚分別萃取3次，收集乙醚相，蒸干乙醚后加水復(fù)溶即得到鼠李糖脂粗品［11］。

1.2.6 鼠李糖脂組成分析

使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析發(fā)酵所得鼠李糖脂組成［12］。本實驗中所使用的質(zhì)譜儀為美國 Bruker Daltonics公司UltrafleXtreme型MALDI-TOF質(zhì)譜儀。使用N2激光（波長337 nm），基質(zhì)為2，5-二羥基苯甲酸，控制軟件為 flexControl，分析軟件為flexAnalysis versison 3.3，實驗方法為RP200-1500（反射模式為正離子）。

1.2.7 粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂研究

以甘油含量為95%的市售粗甘油（購于河北隆海生物科技有限公司）發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，與精甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂進行比較，探索以粗甘油作為底物發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的可能性。

2 結(jié)果與討論

2.1 以甘油為底物的鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的誘變選育

選取NTG誘變選育，NTG終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/L，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出：隨著NTG濃度的增加，致死率也逐漸增加。當(dāng)NTG質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，致死率達(dá)到98%。在NTG質(zhì)量濃度為0.1 g/L時，正負(fù)突變率均相對較低，所篩得的鼠李糖脂高產(chǎn)菌株產(chǎn)量增加幅度也相對較少。隨著誘變劑量的增加，正負(fù)突變率均有明顯的增加。當(dāng)NTG質(zhì)量濃度為0.4 g/L時，正突變率達(dá)到了38.3%。繼續(xù)增加NTG濃度，正突變率下降，負(fù)突變率急劇上升。在NTG質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，正突變率為18.3%，負(fù)突變率高達(dá)70.2%，但此時菌株鼠李糖脂產(chǎn)量的變化幅度也較大。對經(jīng)過質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/L NTG處理過的突變株進行篩選，從250株突變株中篩得1株鼠李糖脂高產(chǎn)菌株P(guān).aeruginosa RG-18，產(chǎn)量達(dá)到16.5 g/L，較出發(fā)菌株13.6 g/L的鼠李糖脂產(chǎn)量提高了21.3%。

表1 不同NTG濃度誘變效果比較Table 1 Evaluation of NTG-induced mutation

2.2 突變株遺傳穩(wěn)定性

對P.aeruginosa RG-18進行5次傳代，分別進行發(fā)酵培養(yǎng)并檢測鼠李糖脂產(chǎn)量、生物量和發(fā)酵結(jié)束pH，每次實驗進行4次重復(fù)，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果如表2所示。由表2可知：突變株經(jīng)過5次連續(xù)傳代培養(yǎng)，菌株仍維持穩(wěn)定的鼠李糖脂產(chǎn)量，表明該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

表2 遺傳穩(wěn)定性測試Table 2 Genetic stability test

2.3 鼠李糖脂組成

微生物發(fā)酵生產(chǎn)得到的鼠李糖脂通常以混合物形式存在。銅綠假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂一般具有4種結(jié)構(gòu)，分別是Rha-C10、Rha-Cl0-C10、Rha2-C10和Rha2-C10-C10。但實際上，根據(jù)含有鼠李糖的個數(shù)，β-羥基羧酸的個數(shù)、長度以及不飽和度的不同，目前已發(fā)現(xiàn)約60種不同結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂。研究表明：影響發(fā)酵生產(chǎn)所得的鼠李糖脂混合物組成的主要因素有菌種本身、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間。其中菌種本身是發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的基礎(chǔ)，對產(chǎn)物組成具有非常重要的影響。鼠李糖脂混合物的組成對其性質(zhì)也有很大的影響，組成上微小的變化都可能改變其理化性質(zhì)。比如單鼠李糖脂更不易溶解，具有更低的臨界膠束濃度；而雙鼠李糖脂具有更好的抑菌效果［13］。

目前，鼠李糖脂混合物結(jié)構(gòu)測定的方法主要有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）以及紅外光譜（IR）。本實驗中筆者利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜MALDI-TOF-MS確定鼠李糖脂結(jié)構(gòu)，并利用不同結(jié)構(gòu)鼠李糖脂的相對豐度估算其含量，結(jié)果如圖1、圖2和表3所示。從圖1中可以看出，P.aeruginosa R-14所產(chǎn)鼠李糖脂質(zhì)譜圖中最高峰出現(xiàn)在m/z 673.4和695.4處，分別代表了主要產(chǎn)物Rha2-C10-C10的［M+Na］+和［M-H+Na2］+加合離子。其他含量較少的峰出現(xiàn)在m/z 527.3、553.3、555.3、559.6、645.3、699.4和701.4處，它們分別對應(yīng)產(chǎn)物Rha-C10-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C14、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12。同時，Rha-C10-C10、Rha2C8-C10、Rha2C10-C12∶1、Rha2-C10-C12所對應(yīng)的［M-H+Na2］+加合離子的峰分別出現(xiàn)在m/z 549.3、667.3、721.4和723.4處。

由圖 2可以看出：P.aeruginosa R-18與P.aeruginosa R-14所產(chǎn)鼠李糖脂質(zhì)譜圖有很大的不同。P.aeruginosa R-18所產(chǎn)鼠李糖脂質(zhì)譜圖中最高峰出現(xiàn)在m/z 527.2和673.2處，它們分別代表了鼠李糖脂中的2種主要成分Rha-C10-C10和Rha2C10-C10的［M+Na］+加合離子。其他含量較少的峰出現(xiàn)在m/z 471.1、499.1、553.2、555.2、645.2、699.2和701.2處，它們分別對應(yīng)產(chǎn)物Rha-C8-C8、Rha-C8-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12的［M+Na］+加合離子。同時在 m/z 549.1、695.2和723.2處觀察到Rha-C10-C10、Rha2-C10-C10和Rha2-C10-C12的［M-H+Na2］+加合離子。

圖1 出發(fā)菌株P(guān).aeruginosa RG-14產(chǎn)鼠李糖脂粗提物MALDI-TOF-MS圖譜Fig.1 MALDI-TOF-MS spectra of rhamnolipids produced by starting strain P.aeruginosa RG-14

圖2 NTG突變株P(guān).aeruginosa RG-18產(chǎn)鼠李糖脂粗提物MALDI-TOF-MS圖譜Fig.2 MALDI-TOF-MS spectra of rhamnolipids produced by mutant P.aeruginosa RG-18

表3 菌株P(guān).aeruginosa R-14和P.aeruginosa R-18產(chǎn)鼠李糖脂的MALDI-TOF-MS分析結(jié)果對比Table 3 Comparation of MALDI-TOF-MS analysis of rhamnolipids produced by P.aeruginosa RG-14 and P.aeruginosa RG-18

從表3可以看出：NTG誘變前后鼠李糖脂各組分相對豐度均有很大變化。與P.aeruginosa R-14所產(chǎn)的鼠李糖脂相比，P.aeruginosa R-18所產(chǎn)鼠李糖脂中相對豐度最高的組分由Rha2-C10-C10變?yōu)镽ha-C10-C10，同時多出了Rha-C8-C8和Rha-C8-C10 2種鼠李糖脂，并且少了組分Rha2C14。P.aeruginosa R-14所產(chǎn)鼠李糖脂中單鼠李糖脂相對豐度總和為19.8%，而P.aeruginosa R-18所產(chǎn)鼠李糖脂中單、雙鼠李糖脂相對豐度總和分別達(dá)到了54.8%和45.2%。單鼠李糖脂含量的大幅度提高意味著P.aeruginosa R-18所產(chǎn)鼠李糖脂具有更低的臨界膠束濃度。臨界膠束濃度是表面活性劑分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度，臨界膠束濃度越小，說明該表面活性劑達(dá)到界面飽和吸附所需的濃度越低，因此，較低濃度的該表面活性劑即能發(fā)揮乳化、起泡、增溶、潤濕等表面活性作用。臨界膠束濃度下降，說明與P.aeruginosa R-14相比，P.aeruginosa R-18所產(chǎn)鼠李糖脂更加高效。

2.4 粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂

在生物柴油的生產(chǎn)過程中，大量的粗甘油作為副產(chǎn)物積累下來。但是，由于甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂產(chǎn)量較低以及過去甘油價格較高，關(guān)于利用粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的研究較少，粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量也較低。Syldatk等［14］利用粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂產(chǎn)量僅為8.5 g/L。本研究中，筆者驗證突變株P(guān).aeruginosa RG-18利用粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的可能性，結(jié)果見圖3。由圖3可知：精甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量為16.5 g/L，而粗甘油發(fā)酵鼠李糖脂產(chǎn)量為14.2 g/L，粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂時生物量只有4.6 g/L，而以精甘油為底物時生物量最高時達(dá)到5.2 g/L。生物柴油工業(yè)中作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的粗甘油中除了甘油外還含有甲醇、未反應(yīng)的脂肪酸等雜質(zhì)，同時無機鹽離子濃度也較高，這些均可能對微生物的生長及微生物合成鼠李糖脂產(chǎn)生抑制作用。想要進一步提高粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量，首先需要找出粗甘油中對微生物生長和鼠李糖脂合成產(chǎn)生抑制作用的成分，從而開發(fā)出去除這種有害成分的粗甘油處理工藝或者篩選出對這種有害物質(zhì)不敏感的菌株，達(dá)到減少甚至消除這種抑制作用的目的。

圖3 P.aeruginosa RG-18利用精甘油與粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的過程曲線Fig.3 Time curves of rhamnolipids fermentation by P.aeruginosa RG-18 with pure glycerol and crude glycerol as subtrates

3 結(jié)論

對P.aeruginosa RG-14進行NTG誘變，通過藍(lán)色凝膠平板初篩及發(fā)酵復(fù)篩，獲得鼠李糖脂高產(chǎn)菌株RG-18，以甘油為C源發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，產(chǎn)量由誘變前的13.6 g/L提高到16.5 g/L，這是目前以甘油為唯一C源發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的最高產(chǎn)量。突變株以甘油為底物發(fā)酵的鼠李糖脂混合物中共含有9種鼠李糖脂，Rha-C8-C8、Rha-C8-C10、Rha-C10-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12，其中單、雙鼠李糖脂的相對豐度分別為54.8%和45.2%。利用工業(yè)粗甘油代替精甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到14.2 g/L，表明該菌株具有良好的實際應(yīng)用的潛力。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Mutating rhamnolipids high-yielding strain with glycerol as substrate

GU Shenghui，ZHU Li，ZHAN Xiaobei，WU Jianrong
（Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry&Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Through mutation，rhamnolipids yield of Pseudomonas aeruginosa RG-14 increased from 13.6 g/L to 16.5 g/L.After 5 rounds of subculturing，rhamnolipids yield of the mutant stayed stable. Subsequently，MALDI-TOF-MS was applied to analyze the composition of rhamnolipids produced by the mutant.The results showed that the rhamnolipids congener was comprised of Rha-C8-C8，Rha-C8-C10，Rha-C10-C10，Rha-C10-C12∶1，Rha-C10-C12，Rha2-C8-C10，Rha2-C10-C10，Rha2-C10-C12∶1 and Rha2-C10-C12.The relative abundance of mono-rhamnolipids and di-rhamnolipids were 54.8%and 45.2%，respectively.The mutant strain also could use crude glycerol besides refined glycerol，and the rhamnolipids yield reached 14.2 g/L，showing application potential of this strain.

Pseudomonas aeruginosa；rhamnolipid；NTG-induced mutation；crude glycerol

Q81

A

1672-3678（2015）01-0054-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.010

2014-02-11

國家科技支撐計劃（2011ABD23B00）

顧生輝（1988—），男，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士研究生，研究方向：生物工程；吳劍榮（聯(lián)系人），副教授，E-mail：kinowu@jiangnan.edu.cn