顧生輝,朱 莉,詹曉北,吳劍榮
(江南大學(xué)生物工程學(xué)院 教育部糖化學(xué)與糖生物技術(shù)重點實驗室,江蘇 無錫 214122)
以甘油為底物鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的誘變選育
顧生輝,朱 莉,詹曉北,吳劍榮
(江南大學(xué)生物工程學(xué)院 教育部糖化學(xué)與糖生物技術(shù)重點實驗室,江蘇 無錫 214122)
通過誘變選育,將銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)RG-14利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂產(chǎn)量由13.6 g/L提高到16.5 g/L。突變株經(jīng)過5次連續(xù)傳代培養(yǎng),菌株仍維持穩(wěn)定的鼠李糖脂產(chǎn)量,表明該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)分析誘變后菌株發(fā)酵甘油生產(chǎn)鼠李糖脂的組成,結(jié)果顯示鼠李糖脂由Rha-C8-C8、Rha-C8-C10、Rha-C10-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12組成,其中單、雙鼠李糖脂的相對豐度分別為54.8%和45.2%。當(dāng)以工業(yè)粗甘油代替精甘油為底物時,該菌株鼠李糖脂產(chǎn)量達到14.2 g/L,表明其具有較好的應(yīng)用潛力。
銅綠假單胞菌;鼠李糖脂;亞硝基胍誘變;粗甘油
鼠李糖脂是一種研究較為廣泛的陰離子生物表面活性劑,一般由1~2個鼠李糖與1~2個β-羥基脂肪酸連接組成。鼠李糖脂可以作為乳化劑、乳化穩(wěn)定劑、破乳劑、保濕劑和防腐劑等應(yīng)用于食品、日化工業(yè)、農(nóng)業(yè)及環(huán)保等領(lǐng)域[1]。相對于化學(xué)表面活性劑,鼠李糖脂具有低毒性和良好的生物降解性等優(yōu)點。同時,鼠李糖脂的抑菌特性也使其具有成為環(huán)境友好滅菌劑的潛力[2-3]。雖然近年來鼠李糖脂的研究引起了廣泛關(guān)注,但其生產(chǎn)受限于較高的底物成本和昂貴的提取純化工藝[4]。
鼠李糖脂發(fā)酵一般以油料作為底物,例如Zhu等[5]以大豆油為底物,通過兩階段pH調(diào)控手段在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂,產(chǎn)量達到70.56 g/L。但以植物油等作為底物發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂時,發(fā)酵液乳化嚴(yán)重,同時由于游離脂肪酸、單甘油酯和甘油二脂等副產(chǎn)物的存在,鼠李糖脂的分離純化過程復(fù)雜且成本較高。高昂的底物成本和復(fù)雜的分離提取工藝使得尋找一種廉價易得且分離純化方便的替代C源成為研究熱點。目前世界范圍內(nèi)生物柴油產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展使其生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物甘油大量積累,每生產(chǎn)10 t生物柴油就會產(chǎn)生約1 t粗甘油;同時利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的下游提取過程也較為簡單,甘油發(fā)酵鼠李糖脂時的發(fā)酵液只需經(jīng)過簡單的離心或過濾除去菌體即可得到澄清透明的鼠李糖脂發(fā)酵液。因此,以甘油作為鼠李糖脂發(fā)酵的替代C源極具前景。但是目前甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量較低,工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)還難以實現(xiàn)[6-7],如Silva等[8]利用甘油為唯一C源發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量僅達到8.0 g/L。
作為一種常用的菌株改良方法,誘變選育被應(yīng)用于鼠李糖脂生產(chǎn)菌株的改良。沈薇等[9]利用紫外誘變及紫外、LiCl復(fù)合誘變成功將P.aeruginosa BS-03鼠李糖脂產(chǎn)量從4.1 g/L提高到6.8 g/L。Lotfabada等[10]通過γ-線誘變獲得1株突變株,鼠李糖脂產(chǎn)量是出發(fā)株的1.5倍。本文中筆者所選用的菌株經(jīng)歷過低溫常壓等離子誘變和低溫常壓等離子加LiCl復(fù)合誘變,對誘變劑已具有一定的抗性。所以將使用公認(rèn)誘變效果顯著的亞硝基胍(NTG)作為誘變劑,通過誘變選育的方法來提高甘油發(fā)酵鼠李糖脂的產(chǎn)量。
1.1 材料
1.1.1 出發(fā)菌株
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa RG-14),購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。
1.1.2 培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3.0,NaCl 5.0,胰蛋白胨5.0;pH 7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油 40.0,NaNO36.0,KH2PO41.0,Na2HPO4·12H2O 1.0,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01,MgSO4·7H2O 0.1;pH 7.0。
藍色凝膠篩選培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3.0,NaCl 5.0,胰蛋白胨5.0,瓊脂20.0,十六烷基三甲基溴化銨0.001,亞甲基藍0.02。
1.1.3 試劑
NTG溶液:在通風(fēng)櫥中稱取100 mg NTG于棕色瓶中,加1 mL丙酮使其溶解,溶解后加磷酸鹽緩沖液19 mL,配制成5 g/L NTG溶液。
蒽酮-硫酸試劑:取0.2 g蒽酮溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)75%H2SO4溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。
1.2 方法
1.2.1 鼠李糖脂高產(chǎn)菌株誘變篩選
從斜面培養(yǎng)基中挑取1環(huán)P.aeruginosa RG-14,接種至50 mL種子培養(yǎng)基,37℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后,8 000 r/min離心10 min,收集菌體,用生理鹽水沖洗2次,制成菌懸液(細(xì)胞密度控制在108~109個/mL),加入一定量NTG溶液,37℃誘變處理0.5 h,大量稀釋終止反應(yīng)后涂布于篩選平板。
誘變后在篩選平板上挑取產(chǎn)生變色較大的菌株進行初篩,再通過搖瓶發(fā)酵后測定發(fā)酵液中鼠李糖脂濃度進行復(fù)篩。
1.2.2 致死率及突變率測定
按誘變處理方法,用不同濃度的NTG溶液處理菌懸液,處理時間0.5 h,稀釋并涂布于篩選平板上,37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后,計數(shù),計算致死率。以出發(fā)菌株鼠李糖脂產(chǎn)量±10%計算正負(fù)突變率。
1.2.3 突變株遺傳穩(wěn)定性測定
對挑選出的菌株連續(xù)傳代5次,分別進行發(fā)酵培養(yǎng),測定鼠李糖脂產(chǎn)量、生物量和發(fā)酵結(jié)束時的pH。
1.2.4 鼠李糖脂含量及生物量的測定
發(fā)酵液8 000 r/min離心20 min,取1 mL上清液用3 mL乙醚萃取3次,收集乙醚相,蒸干乙醚后加水復(fù)溶得到樣品。取1 mL適當(dāng)稀釋后的樣品,加5 mL蒽酮-硫酸試劑,沸水浴10 min,冷卻至室溫后在620 nm下測定OD620,測得鼠李糖含量,乘以系數(shù)3即得到鼠李糖脂含量。發(fā)酵液離心后得到的菌體于105℃烘干至恒質(zhì)量,確定其生物量[11]。
1.2.5 鼠李糖脂的提取
發(fā)酵液8 000 r/min離心20 min,取上清液加入3倍體積乙醚分別萃取3次,收集乙醚相,蒸干乙醚后加水復(fù)溶即得到鼠李糖脂粗品[11]。
1.2.6 鼠李糖脂組成分析
使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析發(fā)酵所得鼠李糖脂組成[12]。本實驗中所使用的質(zhì)譜儀為美國 Bruker Daltonics公司UltrafleXtreme型MALDI-TOF質(zhì)譜儀。使用N2激光(波長337 nm),基質(zhì)為2,5-二羥基苯甲酸,控制軟件為 flexControl,分析軟件為flexAnalysis versison 3.3,實驗方法為RP200-1500(反射模式為正離子)。
1.2.7 粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂研究
以甘油含量為95%的市售粗甘油(購于河北隆海生物科技有限公司)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂,與精甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂進行比較,探索以粗甘油作為底物發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的可能性。
2.1 以甘油為底物的鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的誘變選育
選取NTG誘變選育,NTG終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/L,結(jié)果如表1所示。從表1可以看出:隨著NTG濃度的增加,致死率也逐漸增加。當(dāng)NTG質(zhì)量濃度為0.5 g/L時,致死率達到98%。在NTG質(zhì)量濃度為0.1 g/L時,正負(fù)突變率均相對較低,所篩得的鼠李糖脂高產(chǎn)菌株產(chǎn)量增加幅度也相對較少。隨著誘變劑量的增加,正負(fù)突變率均有明顯的增加。當(dāng)NTG質(zhì)量濃度為0.4 g/L時,正突變率達到了38.3%。繼續(xù)增加NTG濃度,正突變率下降,負(fù)突變率急劇上升。在NTG質(zhì)量濃度為0.5 g/L時,正突變率為18.3%,負(fù)突變率高達70.2%,但此時菌株鼠李糖脂產(chǎn)量的變化幅度也較大。對經(jīng)過質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/L NTG處理過的突變株進行篩選,從250株突變株中篩得1株鼠李糖脂高產(chǎn)菌株P(guān).aeruginosa RG-18,產(chǎn)量達到16.5 g/L,較出發(fā)菌株13.6 g/L的鼠李糖脂產(chǎn)量提高了21.3%。
表1 不同NTG濃度誘變效果比較Table 1 Evaluation of NTG-induced mutation
2.2 突變株遺傳穩(wěn)定性
對P.aeruginosa RG-18進行5次傳代,分別進行發(fā)酵培養(yǎng)并檢測鼠李糖脂產(chǎn)量、生物量和發(fā)酵結(jié)束pH,每次實驗進行4次重復(fù),計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,結(jié)果如表2所示。由表2可知:突變株經(jīng)過5次連續(xù)傳代培養(yǎng),菌株仍維持穩(wěn)定的鼠李糖脂產(chǎn)量,表明該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。
表2 遺傳穩(wěn)定性測試Table 2 Genetic stability test
2.3 鼠李糖脂組成
微生物發(fā)酵生產(chǎn)得到的鼠李糖脂通常以混合物形式存在。銅綠假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂一般具有4種結(jié)構(gòu),分別是Rha-C10、Rha-Cl0-C10、Rha2-C10和Rha2-C10-C10。但實際上,根據(jù)含有鼠李糖的個數(shù),β-羥基羧酸的個數(shù)、長度以及不飽和度的不同,目前已發(fā)現(xiàn)約60種不同結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂。研究表明:影響發(fā)酵生產(chǎn)所得的鼠李糖脂混合物組成的主要因素有菌種本身、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間。其中菌種本身是發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的基礎(chǔ),對產(chǎn)物組成具有非常重要的影響。鼠李糖脂混合物的組成對其性質(zhì)也有很大的影響,組成上微小的變化都可能改變其理化性質(zhì)。比如單鼠李糖脂更不易溶解,具有更低的臨界膠束濃度;而雙鼠李糖脂具有更好的抑菌效果[13]。
目前,鼠李糖脂混合物結(jié)構(gòu)測定的方法主要有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)以及紅外光譜(IR)。本實驗中筆者利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜MALDI-TOF-MS確定鼠李糖脂結(jié)構(gòu),并利用不同結(jié)構(gòu)鼠李糖脂的相對豐度估算其含量,結(jié)果如圖1、圖2和表3所示。從圖1中可以看出,P.aeruginosa R-14所產(chǎn)鼠李糖脂質(zhì)譜圖中最高峰出現(xiàn)在m/z 673.4和695.4處,分別代表了主要產(chǎn)物Rha2-C10-C10的[M+Na]+和[M-H+Na2]+加合離子。其他含量較少的峰出現(xiàn)在m/z 527.3、553.3、555.3、559.6、645.3、699.4和701.4處,它們分別對應(yīng)產(chǎn)物Rha-C10-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C14、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12。同時,Rha-C10-C10、Rha2C8-C10、Rha2C10-C12∶1、Rha2-C10-C12所對應(yīng)的[M-H+Na2]+加合離子的峰分別出現(xiàn)在m/z 549.3、667.3、721.4和723.4處。
由圖 2可以看出:P.aeruginosa R-18與P.aeruginosa R-14所產(chǎn)鼠李糖脂質(zhì)譜圖有很大的不同。P.aeruginosa R-18所產(chǎn)鼠李糖脂質(zhì)譜圖中最高峰出現(xiàn)在m/z 527.2和673.2處,它們分別代表了鼠李糖脂中的2種主要成分Rha-C10-C10和Rha2C10-C10的[M+Na]+加合離子。其他含量較少的峰出現(xiàn)在m/z 471.1、499.1、553.2、555.2、645.2、699.2和701.2處,它們分別對應(yīng)產(chǎn)物Rha-C8-C8、Rha-C8-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12的[M+Na]+加合離子。同時在 m/z 549.1、695.2和723.2處觀察到Rha-C10-C10、Rha2-C10-C10和Rha2-C10-C12的[M-H+Na2]+加合離子。
圖1 出發(fā)菌株P(guān).aeruginosa RG-14產(chǎn)鼠李糖脂粗提物MALDI-TOF-MS圖譜Fig.1 MALDI-TOF-MS spectra of rhamnolipids produced by starting strain P.aeruginosa RG-14
圖2 NTG突變株P(guān).aeruginosa RG-18產(chǎn)鼠李糖脂粗提物MALDI-TOF-MS圖譜Fig.2 MALDI-TOF-MS spectra of rhamnolipids produced by mutant P.aeruginosa RG-18
表3 菌株P(guān).aeruginosa R-14和P.aeruginosa R-18產(chǎn)鼠李糖脂的MALDI-TOF-MS分析結(jié)果對比Table 3 Comparation of MALDI-TOF-MS analysis of rhamnolipids produced by P.aeruginosa RG-14 and P.aeruginosa RG-18
從表3可以看出:NTG誘變前后鼠李糖脂各組分相對豐度均有很大變化。與P.aeruginosa R-14所產(chǎn)的鼠李糖脂相比,P.aeruginosa R-18所產(chǎn)鼠李糖脂中相對豐度最高的組分由Rha2-C10-C10變?yōu)镽ha-C10-C10,同時多出了Rha-C8-C8和Rha-C8-C10 2種鼠李糖脂,并且少了組分Rha2C14。P.aeruginosa R-14所產(chǎn)鼠李糖脂中單鼠李糖脂相對豐度總和為19.8%,而P.aeruginosa R-18所產(chǎn)鼠李糖脂中單、雙鼠李糖脂相對豐度總和分別達到了54.8%和45.2%。單鼠李糖脂含量的大幅度提高意味著P.aeruginosa R-18所產(chǎn)鼠李糖脂具有更低的臨界膠束濃度。臨界膠束濃度是表面活性劑分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度,臨界膠束濃度越小,說明該表面活性劑達到界面飽和吸附所需的濃度越低,因此,較低濃度的該表面活性劑即能發(fā)揮乳化、起泡、增溶、潤濕等表面活性作用。臨界膠束濃度下降,說明與P.aeruginosa R-14相比,P.aeruginosa R-18所產(chǎn)鼠李糖脂更加高效。
2.4 粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂
在生物柴油的生產(chǎn)過程中,大量的粗甘油作為副產(chǎn)物積累下來。但是,由于甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂產(chǎn)量較低以及過去甘油價格較高,關(guān)于利用粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的研究較少,粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量也較低。Syldatk等[14]利用粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂產(chǎn)量僅為8.5 g/L。本研究中,筆者驗證突變株P(guān).aeruginosa RG-18利用粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的可能性,結(jié)果見圖3。由圖3可知:精甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量為16.5 g/L,而粗甘油發(fā)酵鼠李糖脂產(chǎn)量為14.2 g/L,粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂時生物量只有4.6 g/L,而以精甘油為底物時生物量最高時達到5.2 g/L。生物柴油工業(yè)中作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的粗甘油中除了甘油外還含有甲醇、未反應(yīng)的脂肪酸等雜質(zhì),同時無機鹽離子濃度也較高,這些均可能對微生物的生長及微生物合成鼠李糖脂產(chǎn)生抑制作用。想要進一步提高粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量,首先需要找出粗甘油中對微生物生長和鼠李糖脂合成產(chǎn)生抑制作用的成分,從而開發(fā)出去除這種有害成分的粗甘油處理工藝或者篩選出對這種有害物質(zhì)不敏感的菌株,達到減少甚至消除這種抑制作用的目的。
圖3 P.aeruginosa RG-18利用精甘油與粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的過程曲線Fig.3 Time curves of rhamnolipids fermentation by P.aeruginosa RG-18 with pure glycerol and crude glycerol as subtrates
對P.aeruginosa RG-14進行NTG誘變,通過藍色凝膠平板初篩及發(fā)酵復(fù)篩,獲得鼠李糖脂高產(chǎn)菌株RG-18,以甘油為C源發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂,產(chǎn)量由誘變前的13.6 g/L提高到16.5 g/L,這是目前以甘油為唯一C源發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的最高產(chǎn)量。突變株以甘油為底物發(fā)酵的鼠李糖脂混合物中共含有9種鼠李糖脂,Rha-C8-C8、Rha-C8-C10、Rha-C10-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12,其中單、雙鼠李糖脂的相對豐度分別為54.8%和45.2%。利用工業(yè)粗甘油代替精甘油發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂產(chǎn)量達到14.2 g/L,表明該菌株具有良好的實際應(yīng)用的潛力。
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(責(zé)任編輯 管 珺)
Mutating rhamnolipids high-yielding strain with glycerol as substrate
GU Shenghui,ZHU Li,ZHAN Xiaobei,WU Jianrong
(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry&Biotechnology of the Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)
Through mutation,rhamnolipids yield of Pseudomonas aeruginosa RG-14 increased from 13.6 g/L to 16.5 g/L.After 5 rounds of subculturing,rhamnolipids yield of the mutant stayed stable. Subsequently,MALDI-TOF-MS was applied to analyze the composition of rhamnolipids produced by the mutant.The results showed that the rhamnolipids congener was comprised of Rha-C8-C8,Rha-C8-C10,Rha-C10-C10,Rha-C10-C12∶1,Rha-C10-C12,Rha2-C8-C10,Rha2-C10-C10,Rha2-C10-C12∶1 and Rha2-C10-C12.The relative abundance of mono-rhamnolipids and di-rhamnolipids were 54.8%and 45.2%,respectively.The mutant strain also could use crude glycerol besides refined glycerol,and the rhamnolipids yield reached 14.2 g/L,showing application potential of this strain.
Pseudomonas aeruginosa;rhamnolipid;NTG-induced mutation;crude glycerol
Q81
A
1672-3678(2015)01-0054-06
10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.010
2014-02-11
國家科技支撐計劃(2011ABD23B00)
顧生輝(1988—),男,江蘇鎮(zhèn)江人,碩士研究生,研究方向:生物工程;吳劍榮(聯(lián)系人),副教授,E-mail:kinowu@jiangnan.edu.cn