重組人白細(xì)胞介素-12注射液蛋白純度反相高效液相色譜檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證

王彥娜，孟金，劉忠凱，王媛媛，吳明遠(yuǎn)，王建剛

康立泰生物醫(yī)藥（青島）有限公司，山東 青島 266001

白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，相對(duì)分子質(zhì)量約為75 000，由不同基因編碼的2個(gè)亞基P35和P40通過(guò)二硫鍵共價(jià)結(jié)合而成［1-2］。IL-12主要由巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生，作用于T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK），是連接天然免疫和獲得性免疫的功能性橋梁［3-6］，具有多種生物學(xué)功能，在免疫調(diào)節(jié)、抗感染和抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。重組人IL-12（recombinant human interleukin 12，rhIL-12）是入選“十三五”國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)的一類(lèi)生物新藥，已進(jìn)入腫瘤患者放化療后全血象恢復(fù)和腫瘤免疫治療的臨床階段［7-10］。rhIL-12在生產(chǎn)過(guò)程中易受各種理化條件的影響，其產(chǎn)品的質(zhì)量研究和控制尤為關(guān)鍵。

蛋白質(zhì)純度是重組蛋白質(zhì)藥物檢測(cè)的重要指標(biāo)之一，一般采用聚丙烯凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛細(xì)管電泳法等進(jìn)行檢測(cè)［11-14］。反相高效液相色譜法（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）較SDS-PAGE法檢測(cè)靈敏度更高、重復(fù)性更好［15］，其基本原理是用高壓輸液泵將流動(dòng)相泵入裝有填充劑的反相色譜柱中，色譜固相載體具有疏水性，可根據(jù)流動(dòng)相中分離物質(zhì)疏水性發(fā)生相互作用，從而使不同分子在反相柱中彼此分離。一些細(xì)胞因子類(lèi)的重組生物制藥注射液成品中蛋白含量較低，采用常規(guī)進(jìn)樣體積，通常處于檢測(cè)限和定量限下限甚至檢測(cè)不到，無(wú)法確定注射液中蛋白純度。而注射液在生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中生物穩(wěn)定性較差，必須進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量研究和質(zhì)量控制。本研究旨在建立用于rhIL-12注射液蛋白純度分析的RP-HPLC法，并進(jìn)行方法驗(yàn)證，以期用于產(chǎn)品的質(zhì)量控制，為提高產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、保證藥物的生物安全性和有效性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試品rhIL-12注射液（15 μg／mL）由康立泰生物醫(yī)藥（青島）有限公司提供，批號(hào)為201709005、201807002、201807004、201808006。

1.2 主要試劑及儀器 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；乙腈（acetonitrile，ACN）購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；YMC C4液相色譜柱（250 mm×4.6 mm）購(gòu)自日本YMC公司；Agilent 1260液相色譜儀和Agilent 1260 DAD檢測(cè)器均購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。

1.3 色譜條件 采用YMC C4液相色譜柱（250 mm×4.6 mm）。流動(dòng)相A：0.05%三氟乙酸-水溶液；流動(dòng)相B：0.05%三氟乙酸-乙腈溶液；流速為：1.0 mL／min；柱溫為：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為：280 nm；進(jìn)樣體積為：1 000 μL，連續(xù)進(jìn)樣10針，100 μL／針。線(xiàn)性洗脫0～5 min：20% B；第10針樣品進(jìn)樣后開(kāi)始進(jìn)行梯度洗脫：5～15 min：0.05%A比例由80%逐步變?yōu)?0%，0.05% B比例由20%逐步變?yōu)?0%；25 min：70% B；26～35 min：100% B；35.5～40 min：20% B。

1.4 方法的驗(yàn)證

1.4.1 專(zhuān)屬性 取rhIL-12注射液（批號(hào)：201709005）及空白溶劑（流動(dòng)相A、流動(dòng)相B、制劑Buffer），采用1.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的專(zhuān)屬性［10］。

1.4.2 適用性 將rhIL-12注射液（批號(hào)：201709005）于60℃加熱60 min后，采用1.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以未加熱的同批rhIL-12注射液為對(duì)照，分析rhIL-12注射液與雜質(zhì)的分離度，分離度應(yīng)＞1.5，理論塔板數(shù)應(yīng)≥1 500。

1.4.3 精密性

1.4.3.1 重復(fù)性 由實(shí)驗(yàn)員1將rhIL-12注射液（批號(hào)：201709005）連續(xù)進(jìn)樣6次，按1.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算6次檢測(cè)的主峰保留時(shí)間、主峰面積及主峰百分比的RSD，RSD均應(yīng)≤2.0%。

1.4.3.2 中間精密性 取rhIL-12注射液（批號(hào)：201709005），由實(shí)驗(yàn)員2于不同時(shí)間按1.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)6次試驗(yàn)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)員1和2檢測(cè)主峰保留時(shí)間、主峰面積及主峰純度的RSD，RSD均應(yīng)≤2.0%。

1.4.4 檢測(cè)限及定量限 將rhIL-12注射液（批號(hào)：201709005）進(jìn)行28倍稀釋?zhuān)?.058 6 μg／mL，按1.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)測(cè)定3次空白樣品。以信噪比（S／N）=10為定量限，S／N=3為檢測(cè)限。

1.4.5 耐用性 將流速分別設(shè)定為0.9、1.0和1.1 mL／min，對(duì)rhIL-12注射液（批號(hào)：201709005）進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)流速檢測(cè)2次；另將柱溫分別設(shè)定為28、30、32℃，對(duì)rhIL-12注射液（批號(hào)：201709005）進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)溫度檢測(cè)2次。計(jì)算主峰保留時(shí)間、主峰面積及主峰百分比的RSD，RSD均應(yīng)≤5.0%。

1.5 方法的應(yīng)用 取3批rhIL-12注射液（批號(hào)為2018-07002、201807004、201808006），按1.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定主峰保留時(shí)間，主峰面積及主峰百分比。

2 結(jié)果

2.1 方法的驗(yàn)證

2.1.1 專(zhuān)屬性rhIL-12注射液的保留時(shí)間為16.957 min，積分范圍內(nèi)可見(jiàn)單一目的峰；空白溶劑（流動(dòng)相A、流動(dòng)相B、制劑Buffer）在積分范圍內(nèi)均無(wú)吸收峰。見(jiàn)圖1。表明該方法具有良好的專(zhuān)屬性。

圖1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)色譜圖Fig.1 Chromatogram of specificity test

2.1.2 適用性rhIL-12注射液降解峰雜質(zhì)與目的峰分離情況良好，分離度為2.58，理論塔板數(shù)為17 666，見(jiàn)圖2。表明該方法具有良好的適用性。

圖2 適用性試驗(yàn)色譜圖Fig.2 Chromatogram of suitability test

2.1.3 精密性

2.1.3.1 重復(fù)性 實(shí)驗(yàn)員1對(duì)rhIL-12注射液進(jìn)行連續(xù)6次進(jìn)樣檢測(cè)，圖譜基本一致，見(jiàn)圖3；6次進(jìn)樣檢測(cè)的主峰保留時(shí)間、主峰面積及主峰百分比RSD均<2.0%，見(jiàn)表1。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 實(shí)驗(yàn)員1重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of reproducibility test by person 1

圖3 實(shí)驗(yàn)員1重復(fù)性試驗(yàn)色譜圖Fig.3 Chromatogram of reproducibility test by person 1

2.1.3.2 中間精密性 實(shí)驗(yàn)員2對(duì)同批次rhIL-12注射液進(jìn)行6次試驗(yàn)，所得圖譜基本一致，見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)人員1和2檢測(cè)的主峰保留時(shí)間、主峰面積、主峰百分比RSD分別為0.33%、0.71%、0.03，均<2.0%，見(jiàn)表2。表明該方法具有良好的中間精密性。

表2 實(shí)驗(yàn)員2重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of reproducibility test by person 2

圖4 實(shí)驗(yàn)員2重復(fù)性試驗(yàn)色譜圖Fig.4 Chromatogram of reproducibility test by person 2

2.1.4 檢測(cè)限及定量限r(nóng)hIL-12注射液濃度為0.06 μg／mL，進(jìn)樣體積為1 000 μL時(shí)（連續(xù)10針），滿(mǎn)足S／N=3的要求，確定該方法的檢測(cè)限為0.06 μg，見(jiàn)圖5。樣品濃度為0.58 μg／mL，進(jìn)樣體積為1 000 μL時(shí)，滿(mǎn)足S／N=10的要求，確定該方法的定量限為0.58 μg，見(jiàn)圖6。

圖5 檢測(cè)限試驗(yàn)色譜圖Fig.5 Chromatogram in LOD test

圖6 定量限試驗(yàn)色譜圖Fig.6 Chromatogram in LOQ test

2.1.5 耐用性0.9、1.0和1.1 mL／min 3個(gè)流速檢測(cè)rhIL-12注射液，圖譜基本一致，見(jiàn)圖7，主峰百分比RSD為0.05%，見(jiàn)表3；28、30、32℃3個(gè)柱溫條件下檢測(cè)圖譜基本一致，見(jiàn)圖8，主峰百分比RSD為0.09%，見(jiàn)表4。表明該方法具有良好的耐用性。

表3 不同流速耐用性驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Verification results of durability test at various flow rates

表4 不同柱溫耐用性驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Verification results of durability test at various column temperatures

圖7 不同流速耐用性試驗(yàn)色譜圖Fig.7 Chromatogram of durability test at various flow rates

圖8 不同柱溫耐用性試驗(yàn)色譜圖Fig.8 Chromatogram of durability test at various column temperatures

2.2 方法的應(yīng)用 批號(hào)為201807002、201807004、201808006的rhIL-12注射液純度分別為99.88%、99.00%和99.53%，見(jiàn)圖9和表5。

表5 不同批次rhIL-12注射液純度結(jié)果Tab.5 Purities of rhIL-12 injection of various batches

圖9 不同批次rhIL-12注射液色譜圖Fig.9 Chromatogram of rhIL-12 injection of various batches

3 討論

rhIL-12注射液是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在相應(yīng)藥物研制過(guò)程中，蛋白純度的檢測(cè)方法是藥物篩選及質(zhì)量控制的重要評(píng)價(jià)參數(shù)［14］，檢測(cè)方法必須通過(guò)專(zhuān)屬性、精密度、準(zhǔn)確度等方法驗(yàn)證，滿(mǎn)足方法驗(yàn)證的要求才能保證藥物檢測(cè)結(jié)果的可靠性和安全性［12］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)用于rhIL-12注射液蛋白純度檢測(cè)的RP-HPLC方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，rhIL-12注射液的保留時(shí)間為16.957 min，積分范圍內(nèi)可見(jiàn)單一目的峰，空白溶劑（流動(dòng)相A、流動(dòng)相B、制劑Buffer）未見(jiàn)吸收峰；降解峰雜質(zhì)與目的峰分離情況良好，分離度為2.58，理論塔板數(shù)為17 666；連續(xù)進(jìn)行6次進(jìn)樣檢測(cè)的主峰保留時(shí)間、主峰面積及主峰百分比RSD均<2.0%；不同實(shí)驗(yàn)人員對(duì)同批次rhIL-12注射液進(jìn)行6次試驗(yàn)的主峰保留時(shí)間、主峰面積、主峰百分比RSD均<2.0%；該方法的檢測(cè)限為0.06 μg，定量限為0.58 μg，0.9、1.0和1.1 mL／min 3個(gè)流速檢測(cè)rhIL-12注射液的主峰百分比RSD為0.05%，28、30、32℃3個(gè)柱溫條件下檢測(cè)主峰百分比RSD為0.09%。表明該檢測(cè)方法具有較好的專(zhuān)屬性和精密性，檢測(cè)限較低，靈敏度高，整個(gè)檢測(cè)方法的系統(tǒng)耐用性也較高。因此該方法可提供準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)，具有較大的實(shí)用價(jià)值。

rhIL-12注射液每1次人用劑量為15 μg／mL，蛋白含量較低。在RP-HPLC法中，蛋白質(zhì)在有機(jī)成分濃度較低的洗脫液中，分子與固定相疏水作用強(qiáng)，幾乎完全被固定相吸附。根據(jù)該原理選擇連續(xù)進(jìn)樣，將目的組分吸附在色譜柱上，最后一次完全洗脫后檢測(cè)蛋白純度。該進(jìn)樣方式適用于蛋白含量較低的產(chǎn)品，通過(guò)不斷富集便于準(zhǔn)確分辨主峰與雜質(zhì)峰，計(jì)算蛋白純度。

綜上所述，本文建立的方法適用于較低蛋白濃度的rhIL-12注射液純度檢測(cè)，對(duì)于其他低蛋白濃度樣品的檢測(cè)具有借鑒意義。