let-7a及其靶基因在肝細胞癌中作用機制的研究進展

梁雨 綜述，沈濤 審校

昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院云南省第一人民醫(yī)院，云南 昆明 650032

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)最具侵襲性的惡性腫瘤之一，被認為是癌癥相關(guān)死亡的第三大常見病因，具有較高的復(fù)發(fā)率和死亡率［1］。肝癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因和多步驟綜合決定的［2］，如包括HCC的大多數(shù)惡性腫瘤中微小RNA（microRNA，miRNA）異常表達，可影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。在過去的幾十年里，隨著診斷和治療科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，盡管HCC的總體生存率得到了提高，但由于HCC對化療和放療不敏感，尤其對于肝癌晚期患者，化療并不能顯示出生存優(yōu)勢，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是亟待解決的難題［3］。因此，開發(fā)有效的治療策略對提高肝癌患者的生存率具有極其重要的意義。

miRNA是長度18～25 nt的非編碼調(diào)控RNA，在基因表達轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。miRNA通過互補堿基配對與特定的mRNA相互作用，從而影響靶基因的表達或穩(wěn)定性。研究顯示，miRNA可通過靶向不同靶基因，參與不同信號通路，從而在疾病的發(fā)生發(fā)展、生物發(fā)育、器官形成、病毒防御、表觀調(diào)控及代謝等生命活動起到調(diào)控作用［4］。同時，作為非侵入性檢測手段獲得的標志物，血清或血漿中的miRNA在疾病診療中的作用也逐漸受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)，在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相關(guān)性肝病中，miRNA表達隨疾病進程不同呈顯著差異，藥物的使用也可使miRNA發(fā)生特異的應(yīng)答性改變［5-6］。隨著對miRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)一些肝癌發(fā)展過程中關(guān)鍵miRNA的抑癌特性，研究顯示，人工miRNA和內(nèi)源性miRNA的結(jié)構(gòu)相似，不會引起內(nèi)源性反應(yīng)，因此，研發(fā)miRNA相關(guān)癌癥治療方法可能是一種安全的治療途徑［7］。目前，miRNA調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移的功能成為了人們關(guān)注的熱點。近年研究較多的let-7基因家族最初發(fā)現(xiàn)于線蟲體內(nèi)，是一種重要的發(fā)育基因，隨后確認為最早的miRNA之一。let-7a作為該家族成員之一，參與了細胞的增殖、凋亡等生物學(xué)過程，且在多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。本文就let-7a及其靶基因在HCC中作用機制的研究進展作一綜述。

1 let-7a與癌癥的關(guān)系

let-7miRNA家族最初在線蟲中被發(fā)現(xiàn)，是發(fā)育過程的主要調(diào)節(jié)因子，分布在9條不同染色體上。let-7存在多種亞型，由13個成員組成，分別為let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-202和miR-98。該家族所有成員的5'端均具有“種子序列”的高度保守核苷酸序列，即“TGAGGTA”。let-7家族基因在發(fā)育階段表達，可促進細胞分化，并隨著細胞分化程度的加深，let-7的表達顯著增加［8］。已發(fā)現(xiàn)包括食管鱗狀細胞癌、肺癌、鼻咽癌和卵巢癌等大部分人類惡性腫瘤中，let-7常表現(xiàn)為丟失、減少或失控等異常表達［9］。

let-7a作為let-7miRNA家族的成員之一，在細胞增殖、凋亡、生長和轉(zhuǎn)移等許多細胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的作用［10］。多項研究發(fā)現(xiàn)，let-7a在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞中表達水平顯著下調(diào)，且let-7a的表達水平與肺癌和乳腺癌患者的生存時間呈正相關(guān)［11-12］。相關(guān)機制研究發(fā)現(xiàn)，let-7a可通過與靶基因3'端非編碼區(qū)相結(jié)合而調(diào)控靶基因的表達，從而在腫瘤的發(fā)展過程中扮演重要角色［13］。另有研究發(fā)現(xiàn)，高表達的let-7a可導(dǎo)致k-Rasm RNA及蛋白水平顯著降低，從而影響肺癌細胞的侵襲和增殖能力［12］。在乳腺癌細胞中，let-7a不僅抑制細胞的體外增殖，還具有誘導(dǎo)凋亡的作用，這可能與腫瘤細胞中c-myc基因及蛋白水平下調(diào)有關(guān)［13］。由此推測，圍繞let-7a及其靶基因展開腫瘤診治具有十分重要的意義。

2 let-7a對HCC的影響及作用機制

2.1let-7a在HCC診斷中的價值 研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞中microRNAlet-7a-3（MIRLET7A3）基因高甲基化導(dǎo)致let-7a基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，表達降低［14］。已有報道顯示，與健康對照比較，HCC患者血清中l(wèi)et-7a表達水平顯著下調(diào)［15］，且HCC患者肝癌組織中l(wèi)et-7a的表達也比癌旁組織顯著降低［16］，其表達水平的降低與腫瘤的癌栓形成顯著相關(guān)［15］。同樣，在HBV感染的HCC患者肝癌組織中，let-7a的表達也比正常組織顯著降低［17-18］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，盡管肝癌組織中l(wèi)et-7a水平降低，但HBV DNA復(fù)制高度活躍（＞106copies／mL）的肝癌組織中，let-7a水平明顯高于復(fù)制不活躍（＜103copies／mL）的肝癌組織，兩者呈正相關(guān)［17］。有研究顯示，HBV mRNA可通過let-7a反應(yīng)元件特異性吸附和隔離let-7a，從而解除let-7a對其靶基因（如c-myc、KRAS等）及靶基因信號通路的調(diào)控［18］，進而促進HCC的進展。這提示let-7a表達水平在早期HCC的診斷、進展及HBV復(fù)制和正常肝轉(zhuǎn)錄監(jiān)測中具有一定價值。

2.2let-7a及其靶基因?qū)CC的影響及作用機制研究發(fā)現(xiàn)，let-7a與肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等相關(guān)，可通過靶向多個靶基因發(fā)揮腫瘤抑制作用［9］。已有研究顯示，類胰島素生長因子-2（insulinlike growth factor-2，IGF-2）、Wnt1、N-鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）、Snail、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、ras基因等均為let-7a作用的靶標基因［19-36］。

2.2.1let-7a與IGF-2 IGF-2作為類胰島素生長因子（insulin-like growth factor，IGF）信號通路的關(guān)鍵調(diào)控分子之一［19］，不僅在細胞的增殖分化、生長發(fā)育等過程中起重要作用，也參與腫瘤發(fā)生等多種病理過程［20］。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌及肝癌發(fā)生期間，IGF-2 mRNA表達上調(diào)，IGF-2的過度表達可誘導(dǎo)如RAS-Raf-MAPK和PI3K／AKT等信號通路激活，直接影響腫瘤細胞的增殖、抗凋亡及轉(zhuǎn)移［21］。利用let-7a模擬物轉(zhuǎn)染Huh7細胞，let-7a的過表達可顯著抑制IGF-2和IGF2BP-2／3轉(zhuǎn)錄，通過熒光素酶報告實驗證實，let-7a可與IGF-2和IGF2BP-2／3轉(zhuǎn)錄本直接結(jié)合，即let-7a可通過直接靶向IGF-2或其mRNA結(jié)合蛋白IGF2BP-2／3這兩種機制來調(diào)控肝癌中的IGF-2的表達［14］。IGF-2的表達可抑制阻礙IGF信號通路，從而達到抑癌的目的。

2.2.2let-7a與Wnt1 Wnt1是Wnt基因家族中的成員之一，參與細胞分化、細胞遷移和增殖等生物學(xué)過程，其相關(guān)途徑包括ERK信號傳導(dǎo)和Wnt信號傳導(dǎo)［22］。Wnt信號傳導(dǎo)途徑在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其他生理過程中具有至關(guān)重要的作用。Wnt1作為Wnt信號通路上游關(guān)鍵因子，其異常表達可誘導(dǎo)如肝癌、胃癌、卵巢癌等多種癌癥的發(fā)生［23］。通過RNA干擾試驗發(fā)現(xiàn)，在肝癌干細胞中，let-7a的過表達和Wnt1的敲除均顯著抑制了肝癌干細胞的自我更新能力，且在臨床肝細胞癌和正常肝組織中，let-7a的表達與Wnt1的表達呈負相關(guān)［24］。let-7a通過下調(diào)Wnt信號通路活性抑制了Wnt1／β-catenin信號通路，阻止肝癌干細胞的自我更新［25］。另外，Wnt／β-catenin可激活β-catenin／TCF的直接轉(zhuǎn)錄靶標Slug，并通過抑制其磷酸化和降解來穩(wěn)定Snail的表達。Snail可直接靶向上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）過程中的標志物E-cad并抑制其表達，從而觸發(fā)EMT并促進腫瘤發(fā)生和侵襲［26］。另外，Snail、Twist等作為EMT轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控腫瘤干細胞的基因表達，從而促進早期癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，即EMT可能是干細胞干性維持的重要因素。已發(fā)現(xiàn)let-7a可負調(diào)節(jié)EMT的早期標志物N-cad和Snail的表達，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移及發(fā)展［25］。因此，利用let-7a可抑制Wnt信號通路活性的特性進行肝癌治療，有望抑制肝癌干細胞自我更新和干性維持。

2.2.3let-7a與STAT3 STAT3是STAT蛋白質(zhì)家族成員之一。該蛋白家族激活后能與特定的DNA片段結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)錄。其中STAT3蛋白通過響應(yīng)各種細胞因子和生長因子（包括IFN、EGF、IL-5、IL-6、HGF、LIF和BMP2）的磷酸化而被激活，并在許多細胞生理過程（如細胞生長和凋亡）中起關(guān)鍵作用［27］。有研究報道，STAT3的表達與實體瘤中抗EGFR治療藥物的療效相關(guān)，let-7a可增強上皮表型肝癌細胞（Huh7、Hep3B和HepG2）對西妥昔單抗的敏感性，但對間質(zhì)表型肝癌細胞（SNU449和SNU387）無影響［28］；進一步研究其作用機制發(fā)現(xiàn)，在這些肝癌細胞系中，let-7a模擬物存在的情況下，STAT3的表達被抑制，進而增強了上皮表型肝癌細胞對西妥昔單抗的敏感性［29］。let-7a通過靶向STAT3抑制癌基因的轉(zhuǎn)錄，降低上皮表型肝癌細胞對西妥昔單抗的耐藥性，從而影響肝癌的發(fā)生發(fā)展［30］。提示西妥昔單抗可能與其他補充藥物，如microRNAs聯(lián)合使用，成為治療肝癌的有前途的二線藥物。

2.2.4let-7a與ras基因ras基因最初是在急性轉(zhuǎn)化性逆轉(zhuǎn)錄病毒試驗中，從Harvey、Kirsten兩株大鼠肉瘤病毒中克隆出來的轉(zhuǎn)化基因。CHEN等［31］從人膀胱癌細胞中克隆出活化的癌基因C-Ha-ras后，ras基因在人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用開始受到極大關(guān)注。ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的特征性基因有3種，即H-ras、K-ras和N-ras，分別定位于11、12、1號染色體。ras基因參予細胞生長和分化的調(diào)控，并在膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤中檢測出基因表達異常，其中K-ras基因?qū)τ谌祟惏┌Y影響最大［32］。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中l(wèi)et-7a的過表達可導(dǎo)致ras基因表達水平降低，從而阻止癌癥的發(fā)展［33-36］。用膽固醇共軛的let-7a（Chol-let-7a）轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2、SMMC7721后，可檢測到let-7amRNA表達上調(diào)，而3種ras基因的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低；同時，經(jīng)Chol-let-7a處理48 h后，HepG2和SMMC7721細胞的自噬活性增強，胞漿中有豐富的溶酶體和吞噬酶體，核形態(tài)有輕微變化，60 h后可見明顯的凋亡和壞死細胞［34］。在肝臟原位移植HepG2細胞的肝癌小鼠模型中，用Chol-let-7a處理后，在肝臟腫瘤組織中可檢測到高表達let-7a，同時，3種ras基因的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，超聲檢測顯示，腫瘤體積明顯減小、腫瘤遷移受到抑制、腫瘤組織細胞壞死增加，即Chollet-7a處理后肝臟腫瘤生長受到抑制［33］。提示let-7a可下調(diào)ras基因的表達并誘導(dǎo)細胞凋亡，從而使腫瘤發(fā)展受到抑制，表明用包括膽固醇等修飾該分子也是一種用于系統(tǒng)性肝癌治療的潛在手段［16］。

2.3let-7a調(diào)控自噬對HCC的影響 自噬是通過清除并降解自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器，實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新，借此維持細胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種生理過程［37］。近年研究顯示，自噬的調(diào)節(jié)異常是人類惡性腫瘤病理過程中的一個重要特征［38］，但在腫瘤的不同發(fā)展階段，自噬扮演著不同的角色。在腫瘤初始階段，由Beclin-1、ATG-5等自噬相關(guān)基因異常表達可導(dǎo)致自噬活動增強抑制腫瘤發(fā)生［39］。研究發(fā)現(xiàn)，HCCLM3細胞在缺氧環(huán)境下，let-7a表達水平明顯下降，細胞自噬活性也明顯降低，同時細胞增殖顯著增高；利用let-7a模擬物處理后，let-7a的過表達提高了HCCLM3細胞在缺氧狀態(tài)下的自噬率，使細胞停滯在G1期，進而抑制了細胞的增殖［40］。隨著肝癌的發(fā)展，腫瘤細胞微環(huán)境的變化及藥物化療所導(dǎo)致多種應(yīng)激狀況下，自噬可提高腫瘤細胞的存活并促進轉(zhuǎn)移［41］。由此提示，let-7a調(diào)控自噬對于肝癌初期階段治療具有巨大的潛在價值。

3 小結(jié)

miRNA在腫瘤基礎(chǔ)研究、臨床診斷、治療、預(yù)后和腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)方面均具有巨大潛力。let-7a作為let-7家族成員之一，在細胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要的生物功能，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在癌癥背景下，miR-let-7a大多被認為是一種腫瘤抑制因子，在肝癌中表達降低，let-7a表達水平的變化引起一系列靶基因的異常表達，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和遷移。而let-7a在腫瘤中的研究仍處于初步階段，更多的靶基因及作用機制尚未明確。因此，let-7a在肝癌中新的作用靶點及在腫瘤發(fā)展過程中產(chǎn)生的分子機制尚需進一步深入研究，有利于進一步揭示其在腫瘤診斷和治療中的潛在價值。