樹突狀細(xì)胞疫苗的研究進(jìn)展

李興航 綜述，李琦涵 審校

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118

1973年，STEINMAN和COHN［1］在小鼠脾細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一群形態(tài)上呈獨(dú)特星形的細(xì)胞群，命名為樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）。之后的研究發(fā)現(xiàn)，DC是一類抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC），在啟動機(jī)體免疫應(yīng)答和維持免疫耐受方面發(fā)揮重要作用，并在天然免疫和適應(yīng)性免疫中起著橋梁的作用。鑒于其在免疫功能的特殊地位，DC疫苗的研究可為常規(guī)疫苗無法治療的疾?。ㄈ缒[瘤）提供新的治療手段，也可為開發(fā)新型預(yù)防性疫苗提供思路。本文基于DC疫苗的研究現(xiàn)狀和前景作一綜述。

1 DC的分類和生物學(xué)功能

DC是一種獨(dú)特的APC，存在于不同的解剖位置和環(huán)境間，如皮膚真皮層、淋巴結(jié)等。能夠捕獲、處理并提呈抗原，具有激活Naive T細(xì)胞、CD4+T和B細(xì)胞的能力，啟動免疫應(yīng)答［2］。

DC根據(jù)成熟度不同，可分為成熟和未成熟DC。未成熟DC能夠高效的從周邊環(huán)境中攝取病原體、死亡的細(xì)胞和其他抗原物質(zhì)，并對其進(jìn)行處理加工。這類DC表面的MHCⅠ和MHCⅡ以及T細(xì)胞共刺激因子和黏附分子的表達(dá)水平均較低，將抗原提呈并激活T細(xì)胞的能力有限，但可通過誘導(dǎo)T細(xì)胞無能和T細(xì)胞耗盡誘導(dǎo)免疫耐受［3-4］。成熟DC的攝取抗原能力下降，但MHC分子、共刺激分子和黏附分子（如CD40、CD80、CD83、CD54等）表達(dá)增加，此外還會分泌和表達(dá)一些細(xì)胞因子（如IL-6、TNF-α、干擾素）和趨化因子受體（如CCR7）［5］。這些分子能將DC順利趨化至外周淋巴器官與T細(xì)胞進(jìn)行作用，從而能夠?qū)⒖乖岢式oT細(xì)胞啟動抗原特異性免疫應(yīng)答。

根據(jù)DC的發(fā)育過程不同，主要分為經(jīng)典DC（cDC）、漿細(xì)胞樣DC（pDC）和單核細(xì)胞來源DC（mo-DC），其功能、分布和表面標(biāo)志物見表1和表2［6］。常規(guī)樹突狀前體細(xì)胞（pre-cDC）、pDC和單核前體細(xì)胞來源于骨髓，通過血液循環(huán)遷移至淋巴結(jié)、脾等淋巴組織和皮膚、肺、腸等非淋巴組織。在皮膚等外周組織中，pre-cDC和單核前體細(xì)胞分別分化為未成熟的cDC和moDC［7］。此外，朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cells，LC）也屬于皮膚表皮中的一類特殊的常駐抗原提呈細(xì)胞群體，可將抗原提呈給CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答。此前大部分文獻(xiàn)認(rèn)為LC屬于DC中的一類，但LC在個(gè)體發(fā)育上明顯不同于DC［8-9］，其來源于胚胎的單核細(xì)胞，并能夠自我更新，另外LC的發(fā)育依賴于巨噬細(xì)胞生長因子CD115／M-CSF-R和IL-34，并不依賴于Flt3L?；谝陨线@些特點(diǎn)，LC在最新的一些報(bào)道中被被歸納為巨噬細(xì)胞群體［10-11］。

表1 人和小鼠體內(nèi)DC亞群分類Tab.1 Classification of DC subsets in humans and mice

表2 人和小鼠體內(nèi)DC亞群主要功能特點(diǎn)Tab.2 Main functional features of DC subsets in humans and mice

另外還有一類天然淋巴細(xì)胞（innate lymphoid cell，ILC）與DC在機(jī)體天然免疫和誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答中具有高度相似之處。ILC、DC和T細(xì)胞構(gòu)成4個(gè)功能性的免疫模塊，并協(xié)同相互作用共同激活T細(xì)胞應(yīng)答［12-13］。ILC1、cDC1和Th1細(xì)胞屬于細(xì)胞內(nèi)防御模塊；ILC2和由轉(zhuǎn)錄因子Klf4定義的cDC2亞群與Th2細(xì)胞對維持屏障免疫具有重要作用；ILC3和依賴于Notch2的cDC2亞群對細(xì)胞外病原體和真菌的免疫是必需的［12］。此外，兩類細(xì)胞發(fā)育的祖細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄譜均有相同之處［13］。

DC不僅能通過抗原依賴的方式啟動特異性免疫應(yīng)答，還能誘導(dǎo)免疫耐受，調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)［14］。理解不同DC亞群的功能特征和與之相關(guān)的免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，也為各類疾病以及針對這些疾病的疫苗的免疫學(xué)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

2 DC疫苗

DC以其強(qiáng)大的抗原攝取、加工和提呈的能力以及在激活機(jī)體免疫應(yīng)答中的重要地位，成為研究疫苗的理想對象。目前，全世界進(jìn)行的關(guān)于DC疫苗的臨床試驗(yàn)已超過200項(xiàng)（數(shù)據(jù)來源：https：／／clinicaltrials.gov）。

2.1 DC疫苗的分類DC疫苗根據(jù)研究時(shí)間和制備策略的不同大致可分為3類［15］：①早期DC疫苗，即使用蛋白質(zhì)或長肽形式的抗原加上促進(jìn)DC成熟的佐劑［16］；②體內(nèi)靶向DC的疫苗；③體外誘導(dǎo)DC負(fù)載抗原后回輸。

傳統(tǒng)DC疫苗的靶向性較差。為增強(qiáng)其靶向性，需尋找和使用與DC具有高親和力的載體或?qū)ふ谊P(guān)于DC的新型佐劑。靶向DC疫苗是通過將抗DC表面相關(guān)受體（如DC表面的C型凝集素DEC205、CD11c等）的抗體與抗原偶聯(lián)后注射進(jìn)入機(jī)體，使抗原能夠直接與DC接觸。體外DC負(fù)載抗原后回輸是通過從人體的外周血分離單個(gè)核細(xì)胞或從骨髓分離CD34+前體細(xì)胞后，經(jīng)多種細(xì)胞因子（如GM-CSF、IL-4、TNF-α）進(jìn)行刺激分化，獲得未成熟或成熟DC。這些DC可在負(fù)載核酸、多肽、蛋白、細(xì)胞、納米顆粒等抗原后回輸至受者體內(nèi)。在體內(nèi)，DC將這些物質(zhì)作為抗原攝取、加工和提呈給機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)或增強(qiáng)人體針對相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防或治療疾病的作用。

2.2 早期DC疫苗 早期的DC疫苗就是通常所說的重組蛋白或多肽疫苗，其研究重點(diǎn)在抗原肽序列的合理設(shè)計(jì)和佐劑的運(yùn)用上。該概念是基于MHC分子在提呈抗原肽中所起作用的研究提出的。此前，學(xué)界廣泛認(rèn)為MHCⅠ類分子結(jié)合肽段稍長的肽，在合適佐劑的作用下，能夠更好地使DC促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的活化，另外一些長肽包含可由DC提呈的更廣泛的表位，促進(jìn)DC對抗原的提呈效果［16］。

LEFFERS等［17-18］開展了一項(xiàng)針對TP53蛋白設(shè)計(jì)的腫瘤疫苗p53-SLP的臨床試驗(yàn)，該疫苗通過構(gòu)建重疊的合成長肽（synthetic long peptide，SLP）促進(jìn)疫苗被DC提呈。p53-SLP能夠誘導(dǎo)p53特異性T細(xì)胞反應(yīng)，但誘導(dǎo)的IFNγ T細(xì)胞和Th1細(xì)胞反應(yīng)較弱，受試者生存率與其他患者無顯著差異，需要進(jìn)一步優(yōu)化疫苗的設(shè)計(jì)［16］。另外，葛蘭素史克研發(fā)了一款針對非小細(xì)胞肺癌患者的疫苗并開展了Ⅲ期臨床試驗(yàn)。該疫苗使用癌睪丸抗原3（melanomaassociated antigen-3，MAGEA-3）的重組融合蛋白，配合佐劑AS15。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，與安慰劑相比，該疫苗并未增加受試者生存期，因此停止了該疫苗的進(jìn)一步研發(fā)［19］。

早期DC疫苗的失敗，可能是對DC在提呈抗原激活免疫和誘導(dǎo)耐受方面的功能了解不夠全面。另外，缺乏有效的DC激活佐劑可能會導(dǎo)致DC保持未激活狀態(tài)或誘導(dǎo)耐受。為解決這些問題，人們開始開發(fā)靶向DC疫苗或?qū)C負(fù)載抗原后回輸來保證DC的激活和對抗原的提呈。

2.3 靶向DC疫苗 靶向DC疫苗的原理是通過將DC表面受體的抗體與需要遞送的抗原偶聯(lián)或融合在一起，使疫苗本身能夠更加高效地被DC攝取、加工和提呈。這些靶向受體包括DEC205、Clec9A、Clec12A、CD11c、CD40、CD11b等［20］。有研究顯示，疫苗靶向DC表面不同受體會具有不同被內(nèi)化的效率，一般情況下，DEC205、Clec9A、CD40較CD11b和CD11c具有更好的內(nèi)化速度。另外，抗原量的多少并不是抗原提呈效率的決定因素［21］。因此，在靶向DC疫苗中選擇合適的靶向受體至關(guān)重要。目前，靶向DC疫苗已針對多種腫瘤、流感病毒、輪狀病毒、HIV、HPV等多種疾病和病原體進(jìn)行了研究［22-26］。

這些受體中，在小鼠和人類中研究最廣泛的DC靶標(biāo)為DEC205。PADILLA-QUIRARTE等［25］將流感病毒M節(jié)段中的M2e與DC表面DEC205（α-DEC-205：M2e）用特異性單克隆抗體（mAb）進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，加入polyI：C佐劑后皮下免疫小鼠，對照組僅免疫M(jìn)2e蛋白或M2e游離肽。實(shí)驗(yàn)組雖無法阻止動物發(fā)病，但對病毒劑量30 LD50的異源性病毒的致死性攻擊具有76%的保護(hù)效果，而對照組僅20%～40%。另一項(xiàng)研究用輪狀病毒VP6與DEC205的mAb交聯(lián)（αDEC-205：VP6），并使用polyI：C作為佐劑，口服免疫小鼠。相比僅用VP6免疫，αDEC-205：VP6能更早誘導(dǎo)出抗VP6抗體。免疫后21 d對小鼠進(jìn)行口服攻毒發(fā)現(xiàn)，αDEC-205：VP6組在第2天，排泄出的輪狀病毒較對照組開始減少，至第6天完全檢測不到，表明αDEC-205：VP6能顯著降低病毒在腸道內(nèi)的復(fù)制［24］。

一些研究還通過將DC靶向肽與抗原融合構(gòu)建DC靶向疫苗。WANG等［27］通過重組植物乳桿菌NC8并攜帶狂犬病病毒數(shù)個(gè)G基因，在肽段的C-末端融合DC靶向肽（DCpep）組成疫苗NC8-pSIP409-dRVG。經(jīng)過3次1×109CFU劑量口服免疫后的小鼠，具有高水平的IgG抗體并具有強(qiáng)烈的Th1型免疫應(yīng)答，能夠保護(hù)60%小鼠免受病毒劑量為100×ICLD50（100倍50%腦內(nèi)致死劑量）的致死性攻擊。

最新研究發(fā)現(xiàn)，可構(gòu)建蛋白融合系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)疫苗的DC靶向。AO等［28］開發(fā)了一種基于埃博拉病毒包膜糖蛋白（EboGP）的嵌合融合蛋白系統(tǒng)，并用該系統(tǒng)開發(fā)出一款HIV疫苗。研究者們用HIV包膜多肽（Env）的C2-V3-C3或C2-V3-C3-V4-C4-V5替換EboGP黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域（mucin-like domain，MLD）的MLD-C5環(huán)肽（分別為EbGPΔM-V3和EbGPΔM-V3-V5）構(gòu)建HIV的DC靶向系統(tǒng)。結(jié)果表明，V3多肽的替代不影響EboGPΔM靶向DC的能力，并能有效刺激NF-κB信號通路。EboGPΔM-V3結(jié)合HIV的VLPs和Env，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的針對HIVgp120和p24的IgA、IgG抗體以及較強(qiáng)的IFNγ、IL-2、IL-4、IL-5和MIP-1水平。證明了該靶向DC疫苗技術(shù)平臺的可行性。

2.4 DC體外負(fù)載抗原后回輸 這類DC疫苗的策略在于通過體外誘導(dǎo)未成熟或成熟DC后，針對不同抗原類型，通過多種手段（如共孵育、細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染等）將抗原負(fù)載至DC上，最后回輸至人或動物體內(nèi)完成免疫，達(dá)到預(yù)防或治療疾病的作用［29-30］，簡要流程見圖1。

針對細(xì)胞類抗原，DC可通過直接攝取死細(xì)胞和細(xì)胞裂解產(chǎn)物達(dá)到負(fù)載抗原的目的，也可通過聚乙二醇或電融合法將活細(xì)胞與DC融合形成融合細(xì)胞。該策略的優(yōu)勢是具有大量的表位信息，可激活多種針對腫瘤抗原的T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但數(shù)量較多的抗原類型也可能同時(shí)會激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞導(dǎo)致自身免疫疾病。

針對蛋白和肽類抗原，普遍是將DC與多肽和蛋白共孵育，使DC直接攝取加工后回輸體內(nèi)。如將腫瘤的腫瘤特異性抗原（tumor-specificantigen，TSA）或腫瘤相關(guān)性抗原（tumor-associatedantigen，TAA）負(fù)載至DC上治療腫瘤，或通過將病原體如SARSCoV-2的S蛋白負(fù)載至DC上回輸，可用于預(yù)防或治療COVID-19。

針對核酸類抗原，可通過病毒載體、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)染法和共孵育方法將核酸疫苗導(dǎo)入DC內(nèi)。目前普遍通過脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)染方法將核酸導(dǎo)入DC內(nèi)，較少采用共孵育方法，因?yàn)樵摲椒ㄐ瘦^低［29］。對于核酸類型，目前多數(shù)疫苗更傾向于mRNA的DC疫苗，因?yàn)閙RNA不會整合至細(xì)胞基因組中，帶來的安全性考慮會更少。

針對納米材料，一般通過調(diào)節(jié)納米顆粒粒徑或?qū){米材料進(jìn)行修飾后。在納米顆粒上搭載蛋白或核酸類的抗原物質(zhì)后負(fù)載DC制成疫苗。納米材料的選擇包括無機(jī)物和有機(jī)物，無機(jī)納米材料如納米金顆粒、氧化鐵納米顆粒，有機(jī)納米材料如一些多肽類納米纖維、殼聚糖等。如一種經(jīng)美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的納米顆粒PLGA，是一種生物降解緩釋聚合物，該納米顆粒易被DC吸收［31］。

目前，這一類DC疫苗在預(yù)防和治療傳染性疾病和惡性腫瘤的研究中備受關(guān)注。2010年4月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了世界上第一款DC疫苗“Sipuleucel-T”上市，用于臨床上治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌［32］。Sipuleucel-T是通過收集患者的血液后，用白細(xì)胞去除術(shù)富集DC前體細(xì)胞后，在細(xì)胞因子GM-CSF的存在下與前列腺酸性磷酸酶（prostate acid phosphatase，PAP）共孵育36～44 h，DC負(fù)載抗原后，回輸給患者。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該疫苗將患者中位總生存期提高了約4個(gè)月，與安慰劑相比具有顯著差異［33］。盡管該疫苗的總體療效并未達(dá)到治愈疾病的目的，但對于DC疫苗的發(fā)展具有重要意義。

在治療性DC疫苗上，近年來基于上述策略的DC疫苗在臨床中對于治療肺癌［34］、乳腺癌［35］、結(jié)腸癌［36］、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［37］、肝癌［38］等多種實(shí)體瘤和血液?。?9］均有突破性進(jìn)展。在預(yù)防性DC疫苗上，研究者也試圖開始用DC疫苗預(yù)防COVID-19［15］。部分DC疫苗的臨床研究信息見表3，數(shù)據(jù)來源于https：／／clinicaltrials.gov。

表3 部分DC負(fù)載抗原的臨床研究Tab.3 Clinical study of partial antigens loaded on DCs

3 DC疫苗的挑戰(zhàn)及前景

3.1 DC亞群的選擇 由于DC在體內(nèi)的稀缺性，目前許多DC疫苗選擇使用的是由PBMC通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)而來的MoDC。但MoDC似乎達(dá)不到預(yù)期效果，推測是因?yàn)镸oDC遷移至淋巴結(jié)能力有限；此外MoDC對于具備激活哪一類T細(xì)胞的能力有待確認(rèn)［40］。一些研究表明，使用MoDC疫苗后，T細(xì)胞的啟動實(shí)際上需要內(nèi)源性DC［41］。目前已有多項(xiàng)在鼠和人體上的研究使用了cDC1或cDC2等。如TAY等［42］通過誘導(dǎo)出CD133+DC負(fù)載腫瘤mRNA后用于治療乳腺癌的研究中，在小鼠體內(nèi)獲得了較好的效果。ZHOU等［43］通過誘導(dǎo)CD103+cDC，較MoDC顯示出更好的對骨肉瘤的療效，與CTLA-4免疫檢查點(diǎn)療法結(jié)合可獲得100%腫瘤消退的效果。此外，CD8+cDC1、CD11b+cDC2和pDC也均有相關(guān)的研究［44-47］。因此，不同亞群DC似乎可在疾病的預(yù)防和治療中起不同的作用，但究竟選擇何種DC亞群目前仍需進(jìn)一步研究。

3.2 靶點(diǎn)的選擇 目前DC疫苗的制備，可選擇單一表位（如SARS-CoV-2 S蛋白），也可聯(lián)合多種表位或直接選擇腫瘤總mRNA或腫瘤細(xì)胞裂解物進(jìn)行DC負(fù)載。選擇合適的疫苗靶點(diǎn)對疾病的預(yù)防和治療至關(guān)重要，但對于一些腫瘤以及病毒感染性疾?。ㄈ鏗CV）尚無非常明確的靶點(diǎn)。選擇疾病靶點(diǎn)過多可能引發(fā)自身免疫疾病，過少則有可能療效有限或是無效靶點(diǎn)。目前很多工作（如腫瘤新抗原的尋找）也正希望突破這個(gè)難點(diǎn)。如果未來尋找到有效、明確的疾病靶點(diǎn)應(yīng)用至DC疫苗將推動其快速發(fā)展。

3.3 遞送系統(tǒng)的選擇和優(yōu)化 在體外誘導(dǎo)DC的過程中，不同種類和不同劑量的細(xì)胞因子培養(yǎng)出的DC表型上具有很大差異。這些DC遷移至淋巴結(jié)的能力和對下游T細(xì)胞的刺激能力均不同。如經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的未成熟DC因MHCⅠ和MHCⅡ等共刺激分子表達(dá)較低，無法較好激活T細(xì)胞。此外，DC的遷移能力與體內(nèi)的細(xì)胞因子、細(xì)胞表面CCR7等受體密切相關(guān)。通過不同細(xì)胞因子組合可促進(jìn)DC表面CD83和CCR7的高表達(dá)，同時(shí)具備分泌IL-12p70的能力［48］。另外有研究通過在疫苗注射部位上使用破傷風(fēng)類毒素預(yù)處理后，增強(qiáng)DC以依賴于CCL3的方式發(fā)生趨化作用［49］。另外，不同的遞送方式（皮內(nèi)、皮下、靜脈）也會有不同的結(jié)果。皮內(nèi)和皮下遞送方式，DC會遷移至引流淋巴結(jié)中，但遷移率僅在5%左右［50-51］；靜脈遞送方式，DC會集中在肝、脾、腎等組織器官，但療效較差［52］。

3.4 DC疫苗產(chǎn)業(yè)化的困難 由于DC在人體內(nèi)的稀少性和不同個(gè)體間的免疫排斥，DC疫苗的制備均需個(gè)性化的獨(dú)家定制，這給DC疫苗的普及帶來諸多問題。與其他個(gè)性化治療一樣，DC疫苗的費(fèi)用非常昂貴，Sipuleucel-T的每個(gè)療程高達(dá)9萬多美元。因此，該疫苗的可及率非常低。另外，在GMP條件下對自體DC進(jìn)行高效的擴(kuò)增和誘導(dǎo)、保證DC疫苗的一致性和標(biāo)準(zhǔn)化、建立DC疫苗的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等難題，均在DC疫苗的產(chǎn)業(yè)化上亟待解決［53-54］。

4 小結(jié)

DC作為唯一能激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，其在機(jī)體的免疫過程中至關(guān)重要。過去二十年間，DC疫苗的研究取得了重大進(jìn)展，DC疫苗也在不斷進(jìn)行細(xì)化和優(yōu)化以獲得更好的遷移能力和免疫效果。然而，目前對于DC功能、疾病發(fā)生的機(jī)制和靶點(diǎn)的了解有限，DC疫苗想要取得突破性進(jìn)展仍需對這些基礎(chǔ)理論進(jìn)行更加深入和詳細(xì)的探討。繼續(xù)進(jìn)行對DC參與的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中其他細(xì)胞在免疫過程中的研究，如ILC、巨噬細(xì)胞，也可為DC疫苗的設(shè)計(jì)提供新的參考。綜上所述，DC疫苗是近年來備受關(guān)注的一類新型疫苗，能從抗原提呈的角度進(jìn)行疾病的預(yù)防和治療，具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>