多價(jià)肺炎鏈球菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合疫苗的研究進(jìn)展

田雨，馬可 綜述，蘇曉葉 審校

北京智飛綠竹生物制藥有限公司，北京 100176

肺炎鏈球菌是一類(lèi)革蘭染色陽(yáng)性致病菌［1］，首次分離于1881年。肺炎鏈球菌表面黏液層化學(xué)成分為多糖的莢膜，是肺炎鏈球菌主要的致病物質(zhì)，具有抗原性，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特異性可將肺炎鏈球菌分為90多個(gè)血清型［2］，其中，10種最常見(jiàn)的血清型（1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F）導(dǎo)致了全球62%的相關(guān)侵襲性疾?。?］。接種多價(jià)肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗是預(yù)防肺炎鏈球菌相關(guān)疾病的有效途徑，該類(lèi)型疫苗的應(yīng)用大幅降低了肺炎的發(fā)生。由于夾饃多糖屬于T細(xì)胞非依賴(lài)性抗原，不能產(chǎn)生高親和力抗體和免疫記憶，因此不適用于嬰幼兒［4］。將肺炎鏈球菌莢膜多糖與各種蛋白物質(zhì)結(jié)合可提高肺炎疫苗的免疫原性、激發(fā)產(chǎn)生記憶抗體并擴(kuò)大其使用范圍，目前，7、10及13價(jià)肺炎鏈球菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗（簡(jiǎn)稱(chēng)肺炎結(jié)合疫苗）已相繼問(wèn)世，15及20價(jià)肺炎結(jié)合疫苗處于臨床研發(fā)階段。本文就肺炎結(jié)合疫苗研發(fā)、制備方法、免疫原性影響因素和國(guó)內(nèi)接種情況等方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 肺炎鏈球菌疫苗研發(fā)

1.1 肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗 細(xì)菌莢膜多糖是人體內(nèi)具有免疫原性的非蛋白物質(zhì)，機(jī)體針對(duì)莢膜多糖所產(chǎn)生的抗體能有效防止肺炎鏈球菌的感染［5-6］。1945年，首次明確4價(jià)莢膜多糖（血清型1、2、5和7）具有免疫效果，隨后多價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗相繼問(wèn)世［7］。1946年，美國(guó)首次批準(zhǔn)了含有6種血清型的2種肺炎鏈球菌疫苗；1977年，又成功注冊(cè)14價(jià)肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗（包括血清型1、3、4、6A、6B、7F、8、9N、12F、14、18、19F、20、23F）；1983年，23價(jià)肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗（包括血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F）批準(zhǔn)上市，該疫苗血清型能夠覆蓋90%的美國(guó)耐藥菌株及85%～90%的流行菌株［3］，在中國(guó)，這些血清型的覆蓋率為80%。23價(jià)肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗是至今為止含血清型最多的上市產(chǎn)品，成年人免疫后，特異性抗體顯著提高，但近20%的老年人對(duì)其免疫反應(yīng)低下，不能誘發(fā)高親和力抗體和免疫記憶，也不適用于2歲以下的嬰幼兒。

1.2 多價(jià)肺炎結(jié)合疫苗 肺炎鏈球菌莢膜多糖與蛋白的共價(jià)偶聯(lián)能迅速激發(fā)免疫應(yīng)答及誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫記憶抗體［8］，可用于嬰幼兒，彌補(bǔ)了莢膜多糖疫苗的不足。2000年，由輝瑞公司研制的Prevenar成為首個(gè)上市的7價(jià)肺炎結(jié)合疫苗，由7種血清型的莢膜多糖（血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F）與白喉類(lèi)毒素突變體CRM197共價(jià)結(jié)合制成，WHO評(píng)估證明，該疫苗具有較高的安全性［9］。Prevenar于2006年在英國(guó)上市，2008年在中國(guó)上市，隨著該產(chǎn)品的推廣免疫，肺炎鏈球菌性疾病發(fā)病率大幅下降，而非疫苗血清型肺炎鏈球菌感染卻隨之增長(zhǎng)。為應(yīng)對(duì)上述問(wèn)題并提高肺炎結(jié)合疫苗的免疫性能，葛蘭素史克研制的Synflorix10價(jià)肺炎結(jié)合疫苗（血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F）和輝瑞公司的Prevenar13（血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F）相繼獲批準(zhǔn)上市［10］。這兩種疫苗均能激發(fā)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，并具有較高的安全性和耐受性，均可在嬰兒體內(nèi)能誘發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)，使肺炎結(jié)合疫苗的適用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。Synflorix10和Prevenar13疫苗在免疫地區(qū)的血清型覆蓋率分別為70%～84%和74%～88%［11］。

1.3 多價(jià)肺炎結(jié)合疫苗的研究進(jìn)展2019年12月，我國(guó)玉溪沃森生物技術(shù)公司自主研發(fā)生產(chǎn)的13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗上市注冊(cè)申請(qǐng)獲批，這是我國(guó)首個(gè)自主研發(fā)生產(chǎn)的肺炎結(jié)合疫苗，也是全球第2個(gè)13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗，該疫苗包含的血清型與Prevenar13疫苗的血清型相同。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，2月齡～5歲嬰幼兒免疫1～3針后，所有血清型的反應(yīng)率均高達(dá)88%以上［12］，表明2月齡～5歲嬰幼兒可接種該疫苗。默沙東公司研制的15價(jià)肺炎結(jié)合疫苗V114是在Prevenar13基礎(chǔ)上增加了22F和33F血清型［13］，該疫苗的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，健康嬰兒分別免疫V114和13價(jià)結(jié)合疫苗后，V114中增加的22F和33F血清型分別達(dá)到免疫標(biāo)準(zhǔn)的98%和87%，截至目前，該疫苗的Ⅲ期臨床試驗(yàn)也已經(jīng)結(jié)束［14］，并將于2020年底提交成人V114許可申請(qǐng)。2019年2月，輝瑞公司研發(fā)了20價(jià)肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗，該疫苗除含有已上市的13價(jià)肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗包含的血清型外，增加了8、10A、11A、12F、15B／C、22F和33F 7種血清型［15］，拓展了肺炎鏈球菌疫苗免疫預(yù)防范圍，2020年5月，輝瑞公司公布了18～49歲接種該結(jié)合疫苗Ⅲ期批量研究陽(yáng)性結(jié)果［16］，6月開(kāi)始了兩項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)的免疫接種［17］。

2 肺炎結(jié)合疫苗的制備方法

2.1 直接結(jié)合法 直接結(jié)合法是利用肺炎鏈球菌莢膜多糖表面固有的官能團(tuán)與蛋白載體表面的官能團(tuán)進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，多糖表面豐富的官能團(tuán)為與蛋白的直接結(jié)合提供了便利。輝瑞公司13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗使用的胺還原法是典型的直接結(jié)合法，肺炎鏈球菌莢膜多糖表面的鄰位羥基經(jīng)水解或強(qiáng)氧化劑（如高碘酸鈉）氧化后形成末端醛基，可與蛋白表面的氨基形成席夫堿結(jié)構(gòu)，在還原劑（如氰基硼氫化鈉）存在下轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的C-N結(jié)構(gòu)結(jié)合物［18］。另外，多糖表面的末端羥基也可在溴化氰或1-氰基-4-二甲基氨基吡啶翁四氟硼酸鹽［1-cyano-4-（dimethylamino）pyridinium tetrafluoroborate，CDAP］活化的條件下形成氰酸酯鍵，該官能團(tuán)可直接與蛋白表面的氨基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合形成多糖-蛋白結(jié)合物；多糖表面的羧基也可在碳二亞胺存在的情況下與載體蛋白表面的氨基共價(jià)結(jié)合。見(jiàn)圖1。

2.2 間接結(jié)合法 間接結(jié)合法是利用鏈接劑將肺炎鏈球菌莢膜多糖與載體蛋白進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的方法，該方法可降低空間屏蔽作用，從而影響結(jié)合物的免疫原性。目前，比較常用的連接劑是己二酰肼，兩端的-NH2可在碳二亞胺存在時(shí)分別與多糖上的氰酸酯基（表面羥基經(jīng)溴化氰或CDAP活化后獲得）和載體蛋白的羧基反應(yīng)鍵合［19］。見(jiàn)圖1。

2.3 其他方法 多糖與載體蛋白的共價(jià)結(jié)合可在不同官能團(tuán)的基礎(chǔ)上借助不同鏈接劑進(jìn)行偶聯(lián)。多糖表面可利用的官能團(tuán)主要有-OH、-COOH和-NH2，載體蛋白表面可利用的基團(tuán)主要有-COOH、-NH2、-SH、和OH等，上述官能團(tuán)均可通過(guò)圖1所示方法將多糖與蛋白進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。

圖1 多糖-蛋白結(jié)合物制備反應(yīng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of preparation reaction of poly-saccharide-protein conjugate

3 影響肺炎結(jié)合疫苗免疫原性的因素

3.1 載體蛋白 載體蛋白是影響肺炎結(jié)合疫苗免疫原性的重要因素之一。任何攜帶T細(xì)胞輔助表位的蛋白均可作為結(jié)合疫苗的載體蛋白，疫苗制造商常采用具有良好安全性、易于生產(chǎn)且低成本高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)。目前，較常用于肺炎結(jié)合疫苗的載體蛋白有白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197、破傷風(fēng)類(lèi)毒素（tetanus toxoid，TT）、白喉類(lèi)毒素（diphtheria toxoid，DT）及不可分型嗜血桿菌蛋白D，已上市的7和13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗及默沙東公司研發(fā)的15價(jià)肺炎結(jié)合疫苗均采用白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197為載體蛋白；Synflorix10價(jià)肺炎結(jié)合疫苗分別采用不可分型嗜血桿菌蛋白D（1、4、5、6B、7F、9V、14、23F型）、TT（18C型）及DT（19F型）作為載體蛋白；云南沃森生物技術(shù)股份有限公司的13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗采用應(yīng)用廣泛、不具有致病性、耐受性良好且生產(chǎn)工藝成熟的TT作為載體蛋白。除上述常用載體蛋白外，已研發(fā)出更多高性能、廉價(jià)易得的載體蛋白用于肺炎結(jié)合疫苗的制備。如劉建［20］將單一位點(diǎn)突變而成的脫毒肺炎鏈球菌溶血素作為載體蛋白與肺炎莢膜多糖結(jié)合，與傳統(tǒng)載體蛋白TT的結(jié)合物進(jìn)行免疫性對(duì)比研究，結(jié)果證實(shí)，該新型載體優(yōu)于傳統(tǒng)載體TT；周覺(jué)非等［21］以改良胺化還原法將重組B群腦膜炎球菌外膜蛋白與19F型肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合，研究結(jié)果顯示，制備的結(jié)合物免疫動(dòng)物后產(chǎn)生了高滴度的抗19F型肺炎鏈球菌莢膜多糖的抗體，且具有免疫記憶。另外，牛血清白蛋白、霍亂毒素B亞單位、綠膿桿菌外毒素A、百日咳毒素、乙型肝炎病毒表面抗原、淋球菌P-3-2菌毛、大腸埃希菌熱敏感腸毒素等大量可作為載體蛋白的物質(zhì)也均可應(yīng)用于多糖結(jié)合疫苗研究開(kāi)發(fā)［22-26］。

3.2 糖鏈長(zhǎng)度 肺炎鏈球菌多糖結(jié)合物制備過(guò)程中所使用的寡糖池一般由多糖或通過(guò)降解獲得的低聚糖片段組成，這些“糖碎片”的糖鏈長(zhǎng)度（寡糖或多糖）不確定且不均勻，而不同的糖鏈長(zhǎng)度可能會(huì)對(duì)結(jié)合疫苗的免疫原性產(chǎn)生較大影響。LAFERRRIERE等［27］將5種肺炎鏈球菌多糖（3、6A、1SC、19F、23F）進(jìn)行水解，洗脫過(guò)程中進(jìn)行分級(jí)分離，并將適當(dāng)?shù)募?jí)別合并為4個(gè)平均分子量不同的組合，再制備相應(yīng)的多糖-TT結(jié)合物，研究結(jié)果顯示，僅19F結(jié)合物的免疫原性隨著糖鏈長(zhǎng)度的增加而降低。DAUM等［28］在400名美國(guó)嬰兒中評(píng)估了6種不同糖基鏈長(zhǎng)度制備的五價(jià)肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗Pn-CRM197（6B、14、18C、19F、23F）的安全性和免疫原性，研究結(jié)果顯示，Ps（原糖，未水解）結(jié)合疫苗的免疫原性明顯優(yōu)于Os（寡糖，Ps水解后）。張萍等［29］將1型和14型肺炎鏈球菌莢膜多糖用乙酸水解，生成的寡糖與原糖分別與TT結(jié)合，考察結(jié)合疫苗中糖鏈長(zhǎng)度和免疫原性的相關(guān)性，結(jié)果顯示，寡糖結(jié)合物與原糖結(jié)合物的免疫原性差異較小，其研究結(jié)果也證實(shí)了水解過(guò)程未破壞多糖的抗原決定簇。喬瑞潔等［30］以不同重復(fù)單位數(shù)的18C多糖片段與TT制備結(jié)合物，研究多糖片段的大小對(duì)結(jié)合物免疫原性的影響，結(jié)果顯示，較短的多糖片段制備的結(jié)合物免疫原性高，其免疫血清的GMT高、調(diào)理吞噬能力強(qiáng)。

以上糖鏈長(zhǎng)度對(duì)免疫原性影響的研究結(jié)果各有不同，產(chǎn)生影響的原因也尚未明確，比較研究結(jié)果推測(cè)，糖鏈長(zhǎng)度對(duì)免疫原性的影響可能由于血清型及載體蛋白的不同而導(dǎo)致效果產(chǎn)生差異，其影響機(jī)制尚需深入研究。

3.3 結(jié)合方式 多糖與蛋白的結(jié)合方式主要分為直接結(jié)合和間接結(jié)合，直接結(jié)合是利用多糖和蛋白表面的官能團(tuán)進(jìn)行有機(jī)鍵合；間接結(jié)合則是利用“橋連接劑”將多糖與蛋白鏈接。兩種結(jié)合方式可能會(huì)對(duì)肺炎結(jié)合疫苗的免疫原性產(chǎn)生影響，主要表現(xiàn)在橋連接劑既有“橋”的作用也可能具有降低屏蔽效果（龐大體積蛋白對(duì)多糖抗原表位的空間屏蔽）的作用［31］，且連接劑的性質(zhì)也可能會(huì)影響肺炎結(jié)合疫苗免疫原性的表達(dá)。有報(bào)道將1型肺炎鏈球菌多糖分別以溴化氰活化法及胺還原法兩種結(jié)合方式與TT制備結(jié)合物，并評(píng)價(jià)其結(jié)合物的免疫原性，結(jié)果顯示，前者制備的結(jié)合物具有良好的抗原性和免疫原性，且具有免疫加強(qiáng)效應(yīng)，表明溴化氰活化法制備的1型肺炎莢膜多糖結(jié)合物優(yōu)于胺還原法［32］。劉愛(ài)萍等［33］則將14型肺炎多糖以TT及TTAH（己二酸二酰肼衍生的TT）為載體蛋白制備結(jié)合物，并評(píng)價(jià)兩者的免疫原性，即直接結(jié)合法與ADH為橋連劑的間接結(jié)合法的對(duì)比研究，結(jié)果顯示，以小鼠為免疫對(duì)象，兩者均能夠誘導(dǎo)相對(duì)于單純多糖更高的免疫抗體，前者免疫3針，每針均有劑次加強(qiáng)效應(yīng)，后者免疫3針后，也呈現(xiàn)劑次加強(qiáng)趨勢(shì)，但前者獲得的最終抗體量遠(yuǎn)高于后者，該研究結(jié)果證明14型肺炎多糖與TT直接結(jié)合能獲得較高免疫原性。胡浩等［34］課題組對(duì)1型肺炎多糖表面官能團(tuán)的反應(yīng)活性進(jìn)行了研究，結(jié)果證明，1型肺炎多糖與TT及TTAH結(jié)合物的免疫原性差異較小。兩項(xiàng)研究均證明，即使載體蛋白和結(jié)合方式相同，對(duì)免疫原性的影響也因血清型而異。

多糖與載體蛋白的結(jié)合方式多種多樣，多糖血清型、載體蛋白、結(jié)合方式三者變量，任變其一均可能導(dǎo)致免疫原性發(fā)生較大改變，因此，在研究新型多糖-蛋白結(jié)合方式時(shí)應(yīng)更深入調(diào)查，不宜以偏概全。

3.4 其他因素 研究表明，在肺炎鏈球菌4型多糖蛋白結(jié)合疫苗中加入高劑量的游離糖會(huì)降低結(jié)合物的免疫原性［35］。有研究將聚乙二醇-十六烷（polyethylene glycol-hexadecane，PEG-HDA）作為佐劑［36］，并評(píng)價(jià)其免疫原性，結(jié)果顯示，PEG-HDA作為佐劑時(shí)結(jié)合疫苗的抗體滴度明顯高于僅以PEG作為佐劑的結(jié)合疫苗，可明顯提高結(jié)合疫苗在體內(nèi)的免疫原性。楊英英等［37］考察了6A型肺炎結(jié)合疫苗分子大小對(duì)免疫原性的影響，結(jié)果顯示，結(jié)合物的分子大小對(duì)免疫原性無(wú)明顯影響。LEE等［38］利用各種官能團(tuán)對(duì)腫瘤多糖進(jìn)行修飾，與白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197結(jié)合后表現(xiàn)的免疫原性不同，肺炎結(jié)合疫苗也可能因修飾物或修飾位置的不同而表現(xiàn)出不同的免疫原性。

影響肺炎結(jié)合疫苗免疫原性的因素有許多，除了以上幾個(gè)主要影響因素外，結(jié)合物疫苗溶液的離子強(qiáng)度大小、有無(wú)防腐劑、pH及多糖蛋白比等均可能影響結(jié)合物的免疫原性［31］，相關(guān)研究結(jié)論較少，仍需進(jìn)一步探索以獲得更高免疫原性的肺炎多糖結(jié)合疫苗。

4 肺炎疫苗國(guó)內(nèi)接種現(xiàn)狀

肺炎疫苗在中國(guó)屬于二類(lèi)疫苗，需根據(jù)公民自我意愿自費(fèi)接種。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)可獲得的肺炎疫苗有23價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗、7價(jià)肺炎結(jié)合疫苗及13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗。2014—2016年，河北省疾病預(yù)防控制中心收集兒童非重復(fù)性肺炎鏈球菌菌株，其中88.94%分離自2歲以下兒童，共檢出血清型23種，在所涉及的血清型中，7價(jià)肺炎結(jié)合疫苗和13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗的覆蓋率分別為43.27%和86.06%［39］?？梢?jiàn)13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗有較好的覆蓋率。天津市于2010—2016年對(duì)0～6歲二類(lèi)疫苗接種狀況調(diào)研中，7價(jià)肺炎結(jié)合疫苗接種率為3.88%，23價(jià)肺炎結(jié)合疫苗接種率為21.8%，且疫苗受種率隨年齡增長(zhǎng)依次升高，全程受種率分別為1.16%和21.80%［40］，調(diào)查說(shuō)明，兒童肺炎疫苗尤其是肺炎結(jié)合疫苗的受種率尚有待提高。2018年，四川資陽(yáng)市對(duì)老年人（≥60歲）的接種認(rèn)知情況進(jìn)行抽樣調(diào)查，結(jié)果顯示，肺炎疫苗接種率為7.80%，在未接種肺炎疫苗的老年人中愿意接種肺炎疫苗的僅占34.53%，對(duì)肺炎疫苗的總體正確認(rèn)知率為50.52%［41］。同年，上海市進(jìn)行的問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果顯示，有70.75%老年人愿意接種肺炎疫苗，在不愿意接種肺炎疫苗的人群中，49.57%認(rèn)為無(wú)必要接種，15.38%認(rèn)為疫苗預(yù)防作用不大［42］。兩項(xiàng)調(diào)查結(jié)果對(duì)比可知，老年人對(duì)接種肺炎疫苗的認(rèn)知和意愿也因地域而異，這可能與地域文化、經(jīng)濟(jì)條件和／或疫苗宣傳力度等有關(guān)。

5 小結(jié)

肺炎結(jié)合疫苗有效降低了侵襲性肺炎鏈球菌疾病的發(fā)病率，為擴(kuò)大適用范圍及對(duì)非疫苗血清型引起的肺炎鏈球菌病例的上升，繼研發(fā)7價(jià)肺炎結(jié)合疫苗后，10、13及15價(jià)肺炎結(jié)合疫苗相繼問(wèn)世。為提高肺炎結(jié)合疫苗的免疫原性，研究者對(duì)載體蛋白種類(lèi)、糖鏈長(zhǎng)度和結(jié)合方式等影響免疫原性的因素進(jìn)行了深入研究，影響因素會(huì)由于血清型、載體蛋白、結(jié)合方式，離子強(qiáng)度、pH、多糖蛋白比等導(dǎo)致效果不同，因此研究過(guò)程應(yīng)注意限制單一變量且不宜以偏概全。肺炎疫苗可有效預(yù)防肺炎鏈球菌引起疾病，現(xiàn)有的23價(jià)多糖疫苗和13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗既有國(guó)產(chǎn)也有進(jìn)口產(chǎn)品，但以進(jìn)口為主，疫苗價(jià)格較高，影響到其接種率。為提高接種率，進(jìn)而形成群體免疫，在鼓勵(lì)國(guó)內(nèi)企業(yè)研發(fā)新型肺炎疫苗的同時(shí)，政府應(yīng)加大細(xì)菌性肺炎和肺炎疫苗知識(shí)的宣傳力度。