肺炎鏈球菌血清型鑒定的分子生物學(xué)檢測方法

竇珍珍(綜述)，劉 鋼(審校)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院感染科，北京 100045)

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)能夠引起肺炎、胸膜炎、中耳炎、腦膜炎、敗血癥等疾病。世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)2005年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全世界每年至少有160萬人死于侵襲性肺炎鏈球菌感染，其中70萬～100萬是<5歲的兒童，且發(fā)病人群主要集中在發(fā)展中國家[1]。我國的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，肺炎鏈球菌是兒童肺炎最常見的病原體，也是細(xì)菌性腦膜炎主要的病原體之一，1970～2005年肺炎鏈球菌引起的細(xì)菌性腦膜炎在占全部確診病例的10%～30%[2]。

目前，接種肺炎鏈球菌疫苗是最有效的預(yù)防肺炎鏈球菌疾病的方法。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法由于試劑相對便宜、結(jié)果客觀、能直接檢測臨床標(biāo)本的可能性[3]而日益受到關(guān)注。不同的科研團(tuán)隊設(shè)計出了不同的檢測方法，以下對各種實(shí)驗方法予以綜述。

1 肺炎鏈球菌疫苗的重要意義

美國2000～2008年推廣使用肺炎鏈球菌7價蛋白多糖結(jié)合疫苗(7-valent polysaccharide-protein conjugate vaccine,PCV7)(PCV7覆蓋的血清型為4、6B、9V、14、18C、19F和23F)期間，人群中侵襲性肺炎鏈球菌疾病的發(fā)病率在<5歲的兒童中下降了77%，因肺炎入院治療的<2歲兒童下降了39%[4]。歐洲有文獻(xiàn)報道稱，應(yīng)用PCV7的國家其侵襲性肺炎鏈球菌疾病的發(fā)病率下降[5]?；赑CV7在降低侵襲性肺炎鏈球菌疾病發(fā)病率的顯著成績，WHO已經(jīng)推薦PCV7作為國家免疫計劃中的優(yōu)先項目[1]。肺炎鏈球菌疫苗中除了PCV7外，目前還有13價蛋白多糖結(jié)合疫苗、23價莢膜多糖疫苗。這些疫苗均為血清型特異性疫苗，它們對人群的保護(hù)作用與疫苗對當(dāng)?shù)刂虏⌒苑窝祖溓蚓逍偷母采w率有關(guān)。雖然目前PCV7在預(yù)防肺炎鏈球菌疾病方面已有效果，但肺炎鏈球菌血清型監(jiān)測仍然十分重要。對于已將PCV7納入國家免疫計劃項目的國家，PCV7對侵襲性肺炎鏈球菌血清型分布的長期影響尚不十分明確。有地區(qū)報道稱，應(yīng)用PCV7后導(dǎo)致了血清型替換現(xiàn)象，即非疫苗血清型定植、致病增多的現(xiàn)象[6-8]。如果肺炎鏈球菌疫苗對侵襲性肺炎鏈球菌血清型覆蓋率降低，對人群的保護(hù)效益可能降低。對未納入PCV7作為國家免疫計劃項目的國家(主要是發(fā)展中國家和地區(qū))，監(jiān)測肺炎鏈球菌的重要性主要體現(xiàn)以下三個方面：①目前肺炎鏈球菌感染死亡病例主要是在發(fā)展中國家；②這些國家和地區(qū)缺乏完善的肺炎鏈球菌血清型監(jiān)測信息；③目前應(yīng)用的PCV7覆蓋的血清型種類的設(shè)計主要是基于歐洲和北美發(fā)達(dá)國家侵襲性肺炎鏈球菌血清型的監(jiān)測，而已有文獻(xiàn)報道稱PCV7的覆蓋率具有顯著的地區(qū)差異[1]。

目前檢測肺炎鏈球菌的金標(biāo)準(zhǔn)是莢膜腫脹實(shí)驗。莢膜特異性抗體和莢膜結(jié)合后在顯微鏡下可觀察到莢膜腫脹顯著，莢膜腫脹實(shí)驗就是利用這種原理用血清型已知的抗體檢測菌株的血清型。這種方法的缺點(diǎn)主要是試劑昂貴、結(jié)果判讀主觀，且檢測過程需要培養(yǎng)細(xì)菌。血清型檢測試劑的昂貴限制了經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)肺炎鏈球菌血清型的檢測，主觀的判讀使部分菌株的結(jié)果有誤，且檢測結(jié)果還依賴于細(xì)菌培養(yǎng)，而使得血清型檢測結(jié)果也受培養(yǎng)陽性率的限制。

2 肺炎鏈球菌莢膜基因結(jié)構(gòu)

肺炎鏈球菌莢膜的生成主要受莢膜基因(capsular polysaccharide synthesis locus,CPS)控制，除血清型3和37外，其余血清型的莢膜均由Wzy/Wzx依賴的途徑生成并由cpsA-D調(diào)節(jié)，這些基因均存在于dexB和aliA之間。cpsA-D是靠近dexB端的前4個相對保守的基因，cpsD和aliA之間的基因是血清型特異性的基因區(qū)域[9](圖1)。血清型37的肺炎鏈球菌通過cps外的tts基因指導(dǎo)，由合酶途徑合成莢膜[10]。但在dexB和aliA之間，血清型37有與33F非常相似的結(jié)構(gòu)，只是在cap37B，cap37E，cap37N和cap37O存在沉默子，這些沉默子導(dǎo)致該區(qū)域的基因結(jié)構(gòu)不能編碼莢膜(圖2)[10]。血清型3亦依賴合酶途徑合成莢膜[11]。血清型3無cpsA-D基因，但是其orf1和dexB之間的一段序列和血清型19F的cpsA、cpsB相似，orf1、orf2分別與cpsC、cpsD相似，orf2下游和cap3A之間是一段長度為1096 bp 19F缺失的序列(圖3)[12]。cap3A、cap3B、cap3C是血清型3特異性序列[13]。雖然cpsA-D在所有的血清型之間相對保守，但cpsA和cpsB仍存在與血清型相關(guān)的多態(tài)性[14-17]。莢膜基因是以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法的基礎(chǔ)。目前，93種血清型的莢膜基因序列都已測出[9](http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pneumoniae/CPS/)，這將助于以分子生物學(xué)方法研究肺炎鏈球菌的血清型。

圖1 血清型cps結(jié)構(gòu)圖

圖2 血清型33F和血清型37 cps結(jié)構(gòu)圖

圖3 血清型3和血清型19Fcps結(jié)構(gòu)圖

3 已有的分子生物學(xué)檢測方法

已有的以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法可分為兩類，一類是以檢測cps基因血清型特異性區(qū)域為基礎(chǔ)的方法，如多重聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、多重PCR反向線性雜交、基因芯片；另一類是以檢測與血清型相關(guān)的cps基因多態(tài)性為基礎(chǔ)的方法，如限制性片段多態(tài)性、以測序為基礎(chǔ)的血清型檢測方法。

3.1多重PCR和連續(xù)多重PCR 多重PCR檢測血清型是利用多種血清型特異性引物的混合物與待測標(biāo)本提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判斷待測標(biāo)本的血清型。2005年，O′Halloran等[18]設(shè)計了用1個反應(yīng)體系檢測PCV7覆蓋的7種肺炎鏈球菌血清型，結(jié)果顯示這種方法能夠準(zhǔn)確預(yù)測所覆蓋的7種血清型的所有菌株。但是，PCV7推廣應(yīng)用后出現(xiàn)的血清型替換現(xiàn)象可使PCV7覆蓋率下降的同時，也削弱該方法檢測肺炎鏈球菌血清型的能力[6-8]。

增加血清型檢測范圍可削弱血清型替換對血清型檢測方法的影響，但是多重PCR體系需要考慮引物的兼容性以及擴(kuò)增產(chǎn)物的大小[19-20]，因此在一個PCR反應(yīng)體系中能夠檢測的血清型的種類是有限的。連續(xù)多重PCR通過多次多重PCR(每次多重PCR引物組成不同)增加了血清型檢測范圍。2006年，Pai等[19]設(shè)計的連續(xù)多重PCR能夠檢測28種常見致病性肺炎鏈球菌。此方法共包含有7步PCR反應(yīng)，每一步PCR反應(yīng)能夠檢測4種血清型，每一步PCR均擴(kuò)增cpsA基因作為內(nèi)對照，常見的致病血清型用第一步PCR和第二步PCR檢測，以便使用最少的PCR反應(yīng)步驟檢測血清型的分布。檢測過程中，血清型特異性PCR產(chǎn)物對應(yīng)的血清型為標(biāo)本的血清型，PCR反應(yīng)后若cpsA陽性但血清型特異性PCR陰性則進(jìn)入下一步PCR，7步PCR完成后若仍只有cpsA陽性，則該標(biāo)本的血清型未包括在連續(xù)多重PCR檢測范圍內(nèi)，cpsA陰性的標(biāo)本為未分型菌株[19]。

連續(xù)多重PCR的檢測效率高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，且檢測成本遠(yuǎn)低于莢膜腫脹實(shí)驗。用連續(xù)多重PCR的方法檢測了隨機(jī)從2002～2003年收集的菌株中挑選的421株菌株，前3步多重PCR能檢測62.5%菌株的血清型，7步PCR完成后401(95.2%)株菌株能確定血清型/群，20株菌株不能確定血清型/群的菌株為未分型菌株或檢測范圍外的血清型[19]。應(yīng)用連續(xù)多重PCR預(yù)測的血清型結(jié)果與莢膜腫脹實(shí)驗預(yù)測結(jié)果均相符[19]。Pai等[19]統(tǒng)計，莢膜腫脹實(shí)驗檢測肺炎鏈球血清型的平均成本是28美元，而應(yīng)用連續(xù)多重PCR，3步PCR完成血清型檢測的成本是2.28美元，7步PCR完成血清型檢測的成本是5.32美元。此外，還可根據(jù)當(dāng)?shù)胤窝祖溓蚓逍土餍星闆r調(diào)整血清型的檢測步驟、增加血清型的檢測范圍。在血清型分布不同的地區(qū)連續(xù)多重PCR的應(yīng)用有很強(qiáng)的靈活性，已有巴西[21]、西班牙[22]、比利時[23]、孟加拉國[24]、芬蘭[25]、韓國[26]、中國[27]、撒哈拉以南的非洲地區(qū)[28]的研究人員根據(jù)當(dāng)?shù)胤窝祖溓蚓逍土餍胁W(xué)資料在原始連續(xù)多重PCR的基礎(chǔ)上設(shè)計并驗證了新的血清型檢測方案。以連續(xù)多重PCR為基礎(chǔ)的血清型檢測方法可直接檢測生物標(biāo)本中的肺炎鏈球菌血清型，孟加拉國的研究人員已經(jīng)利用這種方法檢測了培養(yǎng)陰性的腦脊液中肺炎鏈球菌的血清型[29]。連續(xù)多重PCR還可以檢測存在多種血清型標(biāo)本的血清型。檢測中耳炎患者鼻咽部分泌物中肺炎鏈球菌血清型的研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽部分泌物分離培養(yǎng)的菌株用莢膜腫脹實(shí)驗檢測結(jié)果為19F，而用連續(xù)多重PCR直接從鼻咽部分泌物提取的DNA，可同時檢測出血清型19F和23F[30]。

多重PCR產(chǎn)生錯誤結(jié)果的主要原因是讀膠時產(chǎn)生錯誤[20]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小接近，同一個PCR反應(yīng)體系檢測的血清型種類過多則增加發(fā)生這種錯誤發(fā)生的概率，因此單個PCR反應(yīng)體系檢測的血清型不宜過多。

3.2多重PCR反向線性雜交和基因芯片技術(shù) 多重PCR反向線性雜交和基因芯片技術(shù)檢測肺炎鏈球菌血清型的技術(shù)基礎(chǔ)為特異性探針與目標(biāo)DNA雜交，它們共同的特點(diǎn)是在擴(kuò)大血清型檢測范圍的同時最大限度地減少PCR反應(yīng)次數(shù)。

2006年，Kong等[31]利用多重PCR反向線性雜交技術(shù)，設(shè)計了能夠檢測23組共40種血清型的血清型檢測方法。2007年，Zhou等[32]又設(shè)計了20組共50種少見血清型的檢測方法(不包括6C、6D和11E)。多重PCR反向線性雜交技術(shù)檢測肺炎鏈球菌的血清型，首先對標(biāo)本提取的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增(血清型特異性PCR)，然后利用尼龍膜上結(jié)合的血清型特異性的單核苷酸探針和生物素標(biāo)記的多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物雜交，再利用過氧化物酶標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素和生物素結(jié)合并利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)檢測過氧化物酶，最后利用探針位置及種類與尼龍膜對應(yīng)的膠片檢測熒光。膠片上產(chǎn)生熒光的位置對應(yīng)的探針種類就是被檢測標(biāo)本的血清型[31]。Kong等[31]用設(shè)計的多重PCR反向線性雜交技術(shù)檢測266株菌株，Zhou等[32]用設(shè)計的多重PCR反向線性雜交技術(shù)檢測了152株菌株，除血清型未覆蓋菌株和未分型菌株雜交結(jié)果陰性外，其余菌株的血清型預(yù)測結(jié)果和莢膜腫脹實(shí)驗一致或包含了莢膜腫脹實(shí)驗結(jié)果(血清型組包含2種或以上的血清型)。

基因芯片是不同血清型的DNA探針按照一定順序排列的微小基片。

2007年，Wang等[33]設(shè)計了通過檢測肺炎鏈球菌wzy基因和cap基因(血清型3)來檢測24組共43種血清型的基因芯片(多重PCR發(fā)生交叉反應(yīng)的血清型歸為同一組)?；蛐酒?，每組血清型有兩種探針，同時有兩種16SrDNA探針作為陽性對照，40個T組成的探針作為陰性對照。用這種基因芯片檢測血清型過程如下：DNA樣本經(jīng)一次多重PCR擴(kuò)增后，以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，將雙向引物換成單向引物并加入Cy3-dUTP后，在相同的實(shí)驗條件下再次擴(kuò)增，再次擴(kuò)增的產(chǎn)物與芯片雜交，基因芯片平掃儀檢測雜交后芯片的信號，所收集的數(shù)據(jù)通過相關(guān)軟件分析后可確定血清型種類。

Wang等[33]用設(shè)計的基因芯片檢測了169株標(biāo)本(147株屬于檢測范圍的43種血清型，11株為檢測范圍外的血清型，11株為其他病原體)，結(jié)果與莢膜腫脹實(shí)驗的結(jié)果相符。此外，這種基因芯片檢測血清型的靈敏度較高。研究發(fā)現(xiàn)，DNA提取濃度為1010 cfu/L時，用基因芯片能確定血清型種類，而用多重PCR則無法檢測血清型[32]。因此，在檢測DNA含量較少的臨床標(biāo)本時，基因芯片檢測血清型有顯著的優(yōu)勢。

2011年Tomita等[34]設(shè)計了一種新的檢測血清型的基因芯片。芯片通過與肺炎鏈球菌GT基因(糖基轉(zhuǎn)移酶基因)雜交而能檢測23組共37種血清型(多重PCR發(fā)生交叉反應(yīng)的血清型歸為同一組)?；蛐酒希拷M血清型檢測1～6個GT基因，每一個GT基因有3種不同的探針。此外，基因芯片上包含了16SrDNA以及與肺炎鏈球菌的7個看家基因(aroE/ddl/gdhA/glcK/spi/tktA/xpt)互補(bǔ)的探針作為陽性對照，與肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎衣原體、肺炎支原體、綠膿桿菌、化膿性鏈球菌的看家基因互補(bǔ)的探針作為陰性對照。血清型檢測過程中，基因芯片直接與提取的菌株基因組DNA雜交，分析數(shù)據(jù)判斷血清型。該方法僅檢測了檢測范圍內(nèi)的36種血清型的36株肺炎鏈球菌，其中1株結(jié)果和莢膜腫脹實(shí)驗結(jié)果不符。目前，基因芯片血清型檢測的準(zhǔn)確性還需要更進(jìn)一步的提高。

與連續(xù)多重PCR相比，多重PCR反向線性雜交及基因芯片技術(shù)最大的特點(diǎn)是檢測的血清型種類多，且不需要多次進(jìn)行PCR反應(yīng)，但是這種方法涉及的引物及探針種類多(多重PCR反向線性雜交檢測90種血清型需200種引物或探針)，多種血清型之間可發(fā)生交叉反應(yīng)(多重PCR反應(yīng)線性雜交檢測的90種血清型中有58種血清型能發(fā)生交叉反應(yīng))，能發(fā)生交叉反應(yīng)的血清型需與其他血清型檢測方法結(jié)合方能進(jìn)一步區(qū)分。目前發(fā)現(xiàn)的肺炎鏈球菌血清型種類雖已達(dá)93種，但常見的血清型種類有限，連續(xù)多重PCR前三步PCR反應(yīng)就能夠檢測60%～90%的肺炎鏈球菌菌株的血清型[19,21-23,25-26,28-30]。因此在檢測常見血清型時，上述兩種血清型檢測方法在時間消耗、操作以及血清型檢測成本上并無明顯優(yōu)勢。利用基因芯片檢測血清型的缺點(diǎn)是該方法的設(shè)備有特殊要求(需要基因芯片掃描儀)，對于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的應(yīng)用可能受到限制。

3.3限制性片段長度多態(tài)性 限制性片段長度多態(tài)性是一種可用于檢測基因多態(tài)性的分子生物學(xué)分析方法，同源DNA，因為存在基因多態(tài)性，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶后可產(chǎn)生不同的DNA片段圖譜。Lawrence等[16]發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌cpsA和cpsB基因限制性片段長度多態(tài)性與血清型相關(guān)，根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計了通過檢測限制性片段長度的多態(tài)性而預(yù)測肺炎鏈球菌11種血清型的檢測方法。每種血清型的cpsA-cpsB PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用AluI、HinfI和RsaI3種酶進(jìn)行酶切，同種酶得到的條帶分型用譜圖分析軟件(GelCompar,version 4.1)進(jìn)行對比分析并命名，每一種血清型可獲得3種酶切后的條帶分型。通過研究11種血清型條帶分型，建立條帶分型和血清型關(guān)系數(shù)據(jù)庫。血清型未知的菌株的條帶分型和數(shù)據(jù)庫中條帶分型的相似度≥90%時，認(rèn)為是相同的條帶分型，可以通過對比血清型已知的條帶分型數(shù)據(jù)庫預(yù)測未知肺炎鏈球菌的血清型。

Lawrence等[16]用建立的數(shù)據(jù)庫檢測了93株菌株，87株檢測結(jié)果與莢膜腫脹實(shí)驗相符，1株血清型為1的菌株被預(yù)測為血清型1或19F，4株血清型為6A的菌株被預(yù)測為6B，2株血清型分別為6B和9V的菌株出現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫中，未有條帶分型被錯誤判斷為非疫苗菌株。提示某些菌株只能給出血清型可能范圍，這種方法不能正確區(qū)分血清型6A和6B，新的條帶分型可導(dǎo)致血清型判斷錯誤。

Batt等[35]擴(kuò)增dexB和ailA之間的所有序列(大小為14～23 kpb)，并單獨(dú)應(yīng)用Hinfl酶切獲得條帶分型。通過46種血清型已知的菌株建立了46種血清型條帶分型的數(shù)據(jù)庫。用該數(shù)據(jù)庫檢測了73株菌株，所有菌株的結(jié)果均和莢膜腫脹實(shí)驗相符。與Lawrence等[16]設(shè)計的方法相比，Batt等[35]設(shè)計的方法在構(gòu)建條帶、分型數(shù)據(jù)庫以及條帶對比時更簡單。Lawrence設(shè)計的方法，每種血清型對應(yīng)3種條帶分型。Batt等設(shè)計的方法是每種血清型對應(yīng)1種條帶分型。但是，Batt設(shè)計的方法PCR擴(kuò)增產(chǎn)物高達(dá)14～23 kpb，這在擴(kuò)增產(chǎn)物方面增加了難度。

限制性長度片段多態(tài)性的缺點(diǎn)是每次進(jìn)行檢測都必須有標(biāo)準(zhǔn)株建立比對的數(shù)據(jù)庫，而且，血清型檢測范圍內(nèi)的菌株如出現(xiàn)新的條帶分型，會導(dǎo)致結(jié)果判讀錯誤。

3.4測序為基礎(chǔ)的血清型檢測方法 肺炎鏈球菌cpsA 3′端到cpsB 5′端之間的序列多態(tài)性與血清型相關(guān)[15-16]。Kong等[17,36]通過對90種血清型的這段基因進(jìn)行測序，建立了部分cpsA-cpsB血清型預(yù)測系統(tǒng)。血清型未知的菌株在cpsA 3′端和cpsB 5′端之間的序列和部分cpsA-cpsB血清型預(yù)測系統(tǒng)比對可預(yù)測血清型未知菌株的血清型。

2011年，Leung等[14]設(shè)計了一種新的以測序為基礎(chǔ)的血清型檢測方法。他們擴(kuò)增的區(qū)域位于cpsA下游1351位點(diǎn)到cpsC下游224位點(diǎn)之間，擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)1064 kpb，但是兩側(cè)的測序結(jié)果可能不確切，因此采用中間的732 kpb與基因庫比對，比對后分?jǐn)?shù)最高的對應(yīng)的血清型為血清型檢測結(jié)果。這種新的以測序為基礎(chǔ)的血清型檢測方法通過比對PPV23覆蓋的血清型的基因序列設(shè)計引物，除 PPV23覆蓋的血清型外，還可以擴(kuò)增另外61種血清型。Leung等用該方法檢測了138株菌株，僅1株菌株血清型預(yù)測錯誤。

以這兩種測序為基礎(chǔ)的血清型檢測方法的引物結(jié)合區(qū)都是相對保守區(qū)域，能與引物結(jié)合的血清型種類多，這使血清型檢測過程中涉及的引物種類少(Kong等[17,36]設(shè)計的檢測方法需要三對引物；Leung等[14]設(shè)計的檢測方法需要一對引物)。這一特點(diǎn)簡化了血清型檢測過程。但是，由于引物不是血清型特異性引物，混雜其他血清型的DNA對血清型檢測的影響還需要進(jìn)行進(jìn)一步試驗來判斷。

4 小 結(jié)

與莢膜腫脹實(shí)驗相比，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法雖然有試劑相對便宜、結(jié)果客觀以及有直接檢測培養(yǎng)陰性臨床標(biāo)本的可能性的優(yōu)點(diǎn)，但也有不足。首先，目前設(shè)計的以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法均不能完全區(qū)分所有的血清型。一些血清型相近的菌株莢膜基因差異很小而在PCR過程中會發(fā)生交叉反應(yīng)，如血清型6A和6B在wciP基因上存在單個核苷酸多態(tài)性[37]。一些血清型雖并不相似，但可能因為PCR擴(kuò)增的目的基因相似而發(fā)生交叉反應(yīng)，如35F和47F，33F、33A和37[19,31]。其次，肺炎鏈球菌的血清型屬于莢膜抗原特異性，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法只是一種間接的血清型檢測方法，它的檢測結(jié)果可以與莢膜腫脹實(shí)驗的結(jié)果不一致。有文獻(xiàn)報道稱，用莢膜腫脹實(shí)驗檢測血清型為19F的2株基因背景不一樣的菌株血清型特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為19A，將該菌株wzy基因測序比對后發(fā)現(xiàn)，這2株菌株wzy基因與血清型19Fwzy基因的相似度為92%，而與血清型19Awzy基因的相似程度為80%[25]。因此，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血清型檢測方法不能完全替代莢膜腫脹實(shí)驗。盡管如此，其還是可以與莢膜腫脹實(shí)驗聯(lián)合應(yīng)用以降低血清型檢測成本。目前，連續(xù)多重PCR經(jīng)驗證是使用最多的血清型檢測方法，僅極少量菌株的檢測結(jié)果出現(xiàn)錯誤，極少量的菌株因引物區(qū)的基因多態(tài)性而PCR擴(kuò)增失敗[23]。芬蘭已將連續(xù)多重PCR作為血清型檢測的常規(guī)方法，用連續(xù)多重PCR不能檢測出血清型的菌株或因交叉反應(yīng)血清型不能確定的菌株再用莢膜腫脹實(shí)驗確定血清型。聯(lián)合應(yīng)用連續(xù)多重PCR和莢膜腫脹實(shí)驗，降低了血清型檢測成本[25]。

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