基于多重PCR技術(shù)檢測蠟樣芽胞桿菌3種毒素基因方法的建立及評價

姜菲菲,李昊宇,賈慧建,王 丹,趙瀟穎,王岳峰,周 童,孫麗媛

（1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院分子生物教研室，吉林 吉林 132013；2.中國鐵路沈陽局集團(tuán)有限公司吉林疾病預(yù)防控制所，吉林 吉林 132001）

蠟樣芽胞桿菌是一種兼性厭氧的革蘭陽性桿菌，該菌屬于芽胞桿菌科蠟樣芽胞桿菌屬，廣泛存在于自然環(huán)境中，其可以產(chǎn)生內(nèi)生孢子，對環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，能夠抵抗高溫、紫外線、電磁輻射和有害化學(xué)物質(zhì)等不利條件［1］。攜帶有毒素基因的蠟樣芽胞桿菌是引起食源性疾病的主要病原菌之一，近年來關(guān)于其污染情況的研究［2-3］較多。自然界中的微生物易污染食品，因蠟樣芽胞桿菌而爆發(fā)的食物中毒也常有發(fā)生［4-6］。

蠟樣芽胞桿菌屬于人類正常菌群之一，只有攜帶毒素基因的菌株才能引起食物中毒［7］。蠟樣芽胞桿菌能產(chǎn)生多種毒素，根據(jù)其引起食物中毒的癥狀可分為致嘔吐型腸毒素和致腹瀉型腸毒素，然而常規(guī)培養(yǎng)法只能檢測出蠟樣芽胞桿菌，不能證實(shí)蠟樣芽胞桿菌是否產(chǎn)生毒素。蠟樣芽胞桿菌編碼相關(guān)毒素的毒力基因主要有腸毒素基因（entFM和bceT）、細(xì) 胞 毒 素 基 因（cytK）、溶 血 性 基 因（hblA、hblB、hblC和hblD）、非 溶 血 性 基 因（nhe）和嘔吐毒素基因（ces）［8-9］。大部分蠟樣芽胞桿菌均攜帶nhe、cytK和entFM 3種毒素基因，是一種攜帶復(fù)合型毒素的菌株［10］。研究［11］顯示：意大利乳品廠加工干酪中蠟樣芽胞桿菌毒素分析，所有分離株均檢測到nhe、cytK和entFM 3種毒素基因；QU等［12］在中國某農(nóng)場生菜上對于nhe毒素基因的檢測高達(dá)100%；HAMMAD等［13］在埃及零售乳制品中檢測出大量攜帶cytK毒素基因的蠟樣芽胞桿菌，其能產(chǎn)生引起腹瀉的細(xì)胞毒素，毒性較大且為蠟樣芽胞桿菌所特有。nhe基因普遍存在于蠟樣芽胞桿菌中，具有高流行性，是毒性的重要標(biāo)志之一。蠟樣芽胞桿菌除能引起上述食物中毒外，還能引起嚴(yán)重的非胃腸道感染，嚴(yán)重者可致患者死亡［14］。目前，對于蠟樣芽胞桿菌致病毒素的檢測方法主要包括免疫學(xué)方法、質(zhì)譜分析法和分子生物學(xué)方法［15］，診斷形式單一，有關(guān)蠟樣芽胞桿菌nhe、cytK和entFM 3種毒素基因同時檢出的方法尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此本研究采用多重PCR技術(shù)建立nhe、cytK和entFM 3種毒素基因快速檢測方法，為食品安全檢查、污染控制和流行病學(xué)調(diào)查提供更為準(zhǔn)確便捷的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑和儀器蠟樣芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC11778購自廣東環(huán)凱微生物有限公司，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌均為北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院分子生物教研室保存菌種。100 bp DNA marker和2×Taq PCR Master Mix均購自北京天根生化科技有限公司，其他主要試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。TC9600-G多功能梯度PCR儀購自美國Labnet公司，JY300E通用型電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，UV WHITE-2020D紫外凝膠成像分析儀購自美國BioRad公司，NanoDrop One微量核酸蛋白測定儀購自美國Thermo公司，YXQ-LS-75S11立式蒸汽滅菌器購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，TGrinder OSE-Y50第3代變速組織研磨器套裝購自北京天根生化科技有限公司，Thermo Fisher高速離心機(jī)購自上海賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 煮沸法提取DNA采用接種環(huán)挑取適量單個蠟樣芽胞桿菌典型菌落于1.5 mL Eppendorf管中，100 μL ddH2O制備菌懸液，封口膜封閉離心管口并置于100℃金 屬 浴10 min；12 000 g離 心10 min，吸取上清液，棄菌體沉淀，獲得DNA溶液，微量核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度及純度，－20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 特異性引物設(shè)計(jì)在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別選取蠟樣芽胞桿菌nhe、cytK和entFM毒素基因序列為靶基因序列，采用NCBI primer-BLAST 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)種屬特異性引物，目的基因片段間分別相差約100 bp，最大程度避免引物間錯配，NCBI-Nucleotide BLAST軟件分析引物預(yù)期PCR產(chǎn)物片段特異性。見表1。

表1 特異性引物序列Tab.1 Sequences of specific primers

1.4 PCR反應(yīng)體系建立單重PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，10 mg·L－1引物F和R各0.5 μL，10 mg·L－1DNA模 板1 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

多重PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μ L，nhe499、cytK191和entFM363引 物 各0.5 μL，10 mg·L－1蠟樣芽胞桿菌 毒 素 基 因DNA模 板1 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個 循 環(huán)；72℃延 伸10 min，4℃保存。1.5 %瓊脂糖凝膠，85 V電泳60 min，紫外凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

1.5 PCR體系特異性評價采用煮沸法提取蠟樣芽 胞 桿 菌DNA，ddH2O稀 釋 至10 mg·L－1。單 重PCR體系特異性評價分別以nhe499、cytK191和entFM363為引物，蠟樣芽胞桿菌DNA為模板，以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌DNA為陰性對照，ddH2O作為空白對照，對單個引物PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，證實(shí)單重PCR反應(yīng)體系特異性。多重PCR反應(yīng)體系特異性評價中依次減少體系中引物種類，每次減少1種，對多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ddH2O作為空白對照，證實(shí)多重PCR體系特異性。

1.6 多重PCR體系靈敏度評價標(biāo)準(zhǔn)菌株蠟樣芽胞桿菌DNA模板經(jīng)無菌ddH2O稀釋，制備102～10－5mg·L－1梯度混懸液。PCR反應(yīng)體系：DNA模板（102～10－5mg·L－1）1 μL，nhe499、cytK191和entFM363引物混合液3 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，無菌ddH2O 6 μL。PCR擴(kuò)增，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，采用紫外凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

1.7 多重PCR體系穩(wěn)定性評價采用多重PCR體系，分別于制備當(dāng)日及每間隔6個月，提取其DNA，進(jìn)行多重PCR體系穩(wěn)定性檢測，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，紫外凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 蠟樣芽胞桿菌基因組DNA提取采用微量核酸蛋白測定儀測定已成功提取的蠟樣芽胞桿菌基因組DNA，蠟樣芽胞桿菌純度為1.50～1.60，質(zhì)量濃度≥227 mg·L－1，滿足多重PCR體系對DNA高純度的要求，證實(shí)煮沸法可有效提取基因組DNA，不需其他耗材，操作簡便，更節(jié)省時間。見表2。

表2 細(xì)菌基因組DNA純度和濃度Tab.2 Purities and concentrations of genomic DNA of bacteria

2.2 PCR體系特異性nhe499、cytK191和entFM363引物依 次 出 現(xiàn)499、191和363 bp大小條帶；條帶清晰明亮，且無非特異性條帶，表明nhe499、cytK191和entFM363引物具有良好特異性。1號泳道為多重PCR體系特異性試驗(yàn)結(jié)果，出現(xiàn)499、363和191 bp條帶且3條條帶清晰明亮；2、3和4號泳道為3重引物模板之間兩兩驗(yàn)證，依次出現(xiàn)目的基因2重條帶；5、6和7號泳道表明多重PCR體系單一引物模板也依次出現(xiàn)目標(biāo)條帶，證實(shí)PCR體系中引物特異性良好，而且3對引物間互不干擾，無非特異性擴(kuò)增。見圖1。

圖1 PCR體系引物特異性Fig.1 Specificities of primers of PCR system

2.3 多重PCR體系靈敏度多重PCR體系靈敏度試驗(yàn)PCR電泳結(jié)果，DNA模板濃度同時稀釋至10－1mg·L－1時，仍可同時觀察到3條特異性條帶，證實(shí)多重PCR體系中引物具有良好靈敏度，最低檢測限為10－1mg·L－1。見圖2。

圖2 多重PCR體系靈敏度Fig.2 Sensitivities of multiplex PCR system

2.4 多重PCR體系穩(wěn)定性－20℃保存多重PCR體系12個月，期間每間隔6個月進(jìn)行蠟樣芽胞桿菌毒素基因檢測，結(jié)果顯示：不同時間多重PCR體系均能出現(xiàn)特異性條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期，證實(shí)多重PCR體系穩(wěn)定性良好。見圖3。

圖3 各組PCR體系穩(wěn)定性Fig.3 Stabilities of PCR systems in various groups

3 討 論

攜帶毒力基因的蠟樣芽胞桿菌是一種食源性致病菌，因此需要檢測并準(zhǔn)確分析環(huán)境和食品中蠟樣芽胞桿菌是否含致病基因，以防止重大疫情的發(fā)生。目前，蠟樣芽胞桿菌的檢查方法依賴于培養(yǎng)法，金標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定檢測結(jié)果時間長且陽性率低，因個人主觀因素會造成誤差，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受限，且無法檢測毒素基因的存在［16］。直接檢測細(xì)菌毒素需要依靠高效液相色譜、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜等設(shè)備［17］。張秀堯等［18］基于高效液相色譜技術(shù)快速檢測食品中的蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素；董歆等［19］采用質(zhì)譜法直接檢測蛋白質(zhì)組，并應(yīng)用組織切片技術(shù)對感染蠟樣芽胞桿菌后的組織進(jìn)行分子水平分析，但此法需要更加精密的儀器設(shè)備。間接檢測主要依靠免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)，但免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)相對周期長、成本高，動物實(shí)驗(yàn)屬半定性，不夠準(zhǔn)確且費(fèi)用高［20］。

蠟樣芽胞桿菌的毒力是多種多樣的，所有致病菌株的共同標(biāo)記毒素基因尚未見報(bào)道，因此蠟樣芽胞桿菌的多重檢測較為重要。多重PCR檢測技術(shù)具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡便性等優(yōu)勢，其檢測技術(shù)成本低、操作簡便易行且執(zhí)行快速，具有完備的檢測裝備［21-25］。劉變芳等［26］基于多重PCR技術(shù)檢測生鮮肉中攜帶毒素基因的大腸埃希菌，快速簡便且特異性強(qiáng)，能快速檢出生鮮肉中的產(chǎn)毒素大腸埃希菌；薛云浩等［27］利用多重PCR技術(shù)檢測由金黃色葡萄球菌腸毒素而引起的食物中毒，加強(qiáng)對衛(wèi)生的管理；李慧等［28］基于多重PCR對農(nóng)產(chǎn)品中的黃曲霉素進(jìn)行快速檢測。多重PCR技術(shù)的應(yīng)用與蠟樣芽胞桿菌致病毒素基因的快速檢測將為檢測人員提供更準(zhǔn)確便捷的檢測手段，可以作為蠟樣芽胞桿菌檢測較為理想的檢測技術(shù)。

本研究采用煮沸法提取蠟樣芽胞桿菌DNA，提取效果優(yōu)異；采用多重PCR技術(shù)檢測蠟樣芽胞桿菌nhe、cytK和entFM毒素基因，設(shè)計(jì)引物特異性高，與金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌均無PCR擴(kuò)增；在同一反應(yīng)體系中互不干擾，最低檢測限同時可達(dá)10－1mg·L－1，靈敏度高，自制備起每6個月進(jìn)行檢測其穩(wěn)定性一致。因此，多重PCR技術(shù)可用于蠟樣芽胞桿菌的nhe、cytK和entFM毒素基因檢測，本研究為食品監(jiān)管提供了有效的檢測手段。