沙苑子苷A對(duì)脂肪變L02細(xì)胞中三酰甘油水解及炎癥介質(zhì)的影響

高 晶 魏益謙 孟智睿 邵紫萱 李 麗 張建軍 王景霞

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

血脂異常(Dyslipidemia)指血漿中脂質(zhì)量和質(zhì)的異常，通常指血漿中總膽固醇(Total Cholesterol，TC)和(或)三酰甘油(Triacylglycerol，TG)升高，也包括高密度脂蛋白膽固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C)降低。由于脂質(zhì)不溶于水或微溶于水，在血漿中與蛋白質(zhì)結(jié)合以脂蛋白的形式存在，因此，血脂異常實(shí)際上表現(xiàn)為脂蛋白異常血癥(Dyslipoproteinemia)[1]。長(zhǎng)期高脂飲食及持續(xù)血脂異常會(huì)增加動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)，并可導(dǎo)致腦血管病、心血管病尤其是冠心病及周?chē)懿〉陌l(fā)生，因此積極控制預(yù)防具有重要意義[2]。本病可歸屬于中醫(yī)學(xué)“脂濁”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病多為本虛標(biāo)實(shí)，主要的病機(jī)是肝、脾、腎虛，痰濁瘀血，阻滯經(jīng)脈，而致膏脂布化失度[3]。沙苑子為豆科植物扁莖黃芪(AstragaluscomplanatusR.Br.)的干燥成熟種子，是中醫(yī)臨床常用的溫補(bǔ)腎陽(yáng)的藥物，主要針對(duì)腎陽(yáng)不足，痰濁日久而導(dǎo)致的高脂血癥，具有溫陽(yáng)化濁的作用[4-5]。沙苑子的化學(xué)成分非常豐富，包括多肽類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、鞣質(zhì)、三萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、甾醇等[6]。課題組前期研究顯示沙苑子黃總黃酮具有良好的調(diào)節(jié)血脂的作用，能夠降低高脂大鼠血清TG、TC、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C)水平，升高HDL-C水平，能抑制肝臟固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(Sterol Regulatory Element Binding Protein-1c，SREBP-1c)表達(dá)，上調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome Proliferator Activated Receptor α，PPARα)表達(dá)，減少TG在肝臟的沉積，從而達(dá)到調(diào)脂作用[7-9]。沙苑子苷A是沙苑子總黃酮中含量較高的一種黃酮類(lèi)成分[10]，本研究采用人L02肝細(xì)胞體外脂肪變性模型，探討沙苑子苷A對(duì)脂肪變性細(xì)胞損傷、TG脂肪酶(Adipose Triglyceride Lipase,ATGL)、相關(guān)核受體過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome Proliferators-activated Receptor，PPAR)以及炎癥介質(zhì)的影響，以期進(jìn)一步明確沙苑子降血脂的物質(zhì)基礎(chǔ)及其調(diào)節(jié)血脂的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人正常肝L02細(xì)胞株，購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)：CL-0111。

1.1.2 藥物 沙苑子苷A(Apexbio公司，美國(guó)，批號(hào)：N240321337769)。

1.1.3 試劑與儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó)，批號(hào)：sh30284.01)，胰蛋白酶-EDTA消化液(Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：T4299)，青鏈霉素(Invitrogen公司，美國(guó)，批號(hào)：V900929)，胎牛血清(Gibco公司，美國(guó)，批號(hào)：V900933)，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)(Gibco公司，美國(guó)，批號(hào)：10099-141)，棕櫚酸鈉(Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：P9575)，油酸鈉(Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：07501)，二甲基亞礬(Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：DMSO)，蛋白裂解液(Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：r0278)，二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法蛋白含量測(cè)定試劑盒(批號(hào)：KGP902)、TG試劑盒(批號(hào)：A110-1-1)、TC試劑盒(批號(hào)：A111-1-1)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒(批號(hào)：A003-1-2)、過(guò)氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)試劑盒(批號(hào)：A001-3-2)均購(gòu)于南京建成生物工程研究所，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：APOAF-20TST)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR)檢測(cè)主要實(shí)驗(yàn)材料：引物(北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成)，Trizol(Invitrogen公司，美國(guó)，批號(hào)：15596018)，核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)抑制劑[Fermentas(MBI)公司，美國(guó)，批號(hào)：eo0382]，RNase-free H2O(Fermentas(MBI)公司,美國(guó)，批號(hào)：eo0521)，轉(zhuǎn)錄酶、qPCR Mix(APEXBIO公司，美國(guó)，批號(hào)：K1070-5000)，ATGL抗體(Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：P1872)，PPAR-α(Abcam公司，英國(guó)，批號(hào)：epr18516)，PPAR-γ(Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：SAB4502262)，白細(xì)胞介素-6(Interleukin，IL-6)(Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：I1395)抗體，腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)-α抗體(Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：RAB0522)，抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)(Cell Signaling公司，美國(guó)，批號(hào)：ab6721)，超凈工作臺(tái)(青島海爾股份有限公司，型號(hào)：HCB-1300V)，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：HERAcell 2401)，高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)：5424r)，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本，型號(hào)：CKX31)，EPICS-XL型流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter，美國(guó)，型號(hào)：XL-MCL)，全自動(dòng)生化分析儀(Rayto公司，美國(guó)，型號(hào)：CHEMRAY 120)，酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：1410101)，7500實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司，美國(guó)，型號(hào)：7500)，電泳儀(Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：1645050-OG)、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：1704150)，凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司，美國(guó)，型號(hào)：e142362)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 根據(jù)L02細(xì)胞的給藥濃度不同設(shè)置對(duì)照組、模型組和受試藥低劑量、中劑量、高劑量組。L02細(xì)胞用含10%胎牛血清Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，傳代。于96孔板和(或)24孔板中加入L02細(xì)胞，培養(yǎng)至融合80%，加入含有1% BSA、1 mmol/L的游離脂肪酸(Free Fatty Acids，F(xiàn)FA)混合液(油酸∶軟脂酸為2∶1)的DMEM培養(yǎng)基，構(gòu)建脂肪肝細(xì)胞模型。

1.2.2 給藥方法 受試藥細(xì)胞分別加入1、10、50 μmol/L沙苑子苷A工作液(沙苑子苷A粉末溶于二甲基亞砜配制)預(yù)處理24 h后，再加入FFA混合液孵育24 h，隨后測(cè)定相應(yīng)的指標(biāo)。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1.2.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)L02細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline，PBS)洗滌2次。重懸細(xì)胞，用10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI避光常溫孵育5 min，流式細(xì)胞儀分析測(cè)得數(shù)據(jù)。

1.2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)L02細(xì)胞脂肪堆積 收集各組細(xì)胞，冰PBS洗滌2次×10 min，重懸于1 μmol/L尼羅紅染液1 mL，室溫避光振蕩染色30 min，冰PBS洗滌2次，重懸于500 μL PBS，流式細(xì)胞儀(490 nm excitation/570 nm emission)隨機(jī)計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，各處理組檢測(cè)熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比較，計(jì)算倍數(shù)變化。

1.2.3.3 L02細(xì)胞TG、TC、MDA含量和SOD活力的測(cè)定 收集各組細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TG、MDA含量、SOD活性水平。

1.2.3.4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá) 提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。用生物分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。取2 μg RNA樣本，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄和PCR條件按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置。PCR進(jìn)行35～40個(gè)循環(huán)：預(yù)變性95 ℃，2 min；變95 ℃，30 s；58 ℃退火，30 s；72 ℃延伸30 s。ATGL上游引物為5′-ACATCCGGTGGATGAAGGAG-3′，下游引物為5′-GGCAGTGCCTCTCTGTAGG-3′；PPARα上游引物為5′-ACGATTCGACTCAAGCTGGT-3′，下游引物為5′-AAACGAATCGCGTTGTGTGA-3′；PPARγ上游引物為5′-CTAAAGAGCCTGCGAAAGCC-3′，下游引物為5′-GGCGGTCTCCACTGAGAATA-3′；TNF-α上游引物為5′-CTGCACTTTGGAGTGATCGG-3′，下游引物為5′-AGGGTTTGCTACAACATGGG-3′；IL-6上游引物為5′-AAGCCTCCCAGTGCAAGATT-3′，下游引物為5′-ATGCATGCTTGTCTTGCCTT-3′；GAPDH上游引物為5′-CTCATGACCACAGTCCATGCC-3′，下游引物為5′-TTCCCGTTCAGCTCAGGGAT-3′。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3.5 蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting)法檢測(cè)ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，蛋白裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃離心(離心半徑8 cm、轉(zhuǎn)速12 000 r/min、時(shí)間15 min)取上清液，BCA法測(cè)定蛋白含量，總蛋白50 μg上樣，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Filter Membrane，NC膜)上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉后加入1∶1 000稀釋的相應(yīng)的一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗3次，加入1∶2 000 HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次后，用Western Blotting熒光檢測(cè)試劑盒顯影、定影。結(jié)果用圖像分析儀分析。

2 結(jié)果

2.1 沙苑子苷A對(duì)脂肪變L02細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為(5.43±1.93)%，而模型組L02細(xì)胞的凋亡率為(41.54±11.17)%，顯著升高(P<0.01)。沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組的細(xì)胞凋亡率分別為(33.40±6.11)%、(26.61±5.54)%、(15.73±3.51)%，均有顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度沙苑子苷A對(duì)L02細(xì)胞凋亡的影響

2.2 沙苑子苷A對(duì)肝脂肪變L02細(xì)胞脂肪堆積的影響 與對(duì)照組比較，模型組的脂肪堆積明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組L02細(xì)胞脂肪堆積均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度沙苑子苷A對(duì)L02細(xì)胞脂肪堆積的影響

2.3 沙苑子苷A對(duì)脂肪變L02細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量的影響 與對(duì)照組比較，模型組L02細(xì)胞TG、TC含量均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A中、高劑量L02細(xì)胞TG含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，沙苑子低劑量、中劑量、高劑量L02細(xì)胞TC含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 沙苑子苷A對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量的影響

2.4 沙苑子苷A對(duì)脂肪變L02細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活力的影響 與對(duì)照組比較，模型組L02細(xì)胞MDA含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A中、高劑量L02細(xì)胞MDA含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與對(duì)照組比較，模型組L02細(xì)胞SOD活力水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；沙苑子低劑量、中劑量、高劑量L02細(xì)胞SOD活力水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 沙苑子苷A對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD水平的影響

2.5 沙苑子苷A對(duì)ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組L02細(xì)胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γmRNA表達(dá)均顯著升高(均P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組L02細(xì)胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γmRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05，P<0.01)。與對(duì)照組比較，模型組L02細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)均顯著升高(均P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組L02細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)均顯著降低(均P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 沙苑子苷A對(duì)TG代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6 沙苑子苷A對(duì)ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組L02細(xì)胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γ蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組L02細(xì)胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γ蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05，P<0.01)。與對(duì)照組比較，模型組L02細(xì)胞TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組L02細(xì)胞TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.01)。見(jiàn)表4，圖3。

表4 沙苑子苷A對(duì)TG代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 不同濃度沙苑子苷A對(duì)TG代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

對(duì)沙苑子黃酮類(lèi)成分的研究起源于20世紀(jì)80年代，陳妙華和劉風(fēng)山[11]首次提取出沙苑子特有黃酮成分，命名為沙苑子苷。目前已經(jīng)從沙苑子中提取到超過(guò)16種的黃酮類(lèi)化合物[6，12]，如沙苑子苷A、沙苑子苷B、沙苑子苷C、沙苑子楊梅苷等。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)沙苑子總黃酮的藥理作用研究較多，但是對(duì)單體成分的藥理研究還未見(jiàn)報(bào)道。課題組前期研究用1 mmol/L游離脂肪酸混合物(油酸:棕櫚酸為2:1)作用于人肝細(xì)胞L02細(xì)胞24 h建立了脂肪變肝細(xì)胞模型，本實(shí)驗(yàn)利用此模型觀察沙苑子苷A對(duì)脂肪變L02細(xì)胞的影響，探討其降脂作用及分子機(jī)制。

肝臟參與脂質(zhì)代謝過(guò)程中的多個(gè)重要環(huán)節(jié)，攝取及合成脂肪酸，加工、貯存、氧化分解及輸出脂質(zhì)，當(dāng)肝臟獲得脂肪酸的量超過(guò)其處理能力時(shí)，就會(huì)造成脂肪沉積[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FFA模型組L02細(xì)胞脂肪堆積明顯增加，TG、TC含量升高，MDA含量升高，SOD活性下降，細(xì)胞凋亡率增加，給予沙苑子苷A能顯著減少脂肪堆積，降低TG、TC、MDA含量，增加SOD活性，降低細(xì)胞凋亡率，減輕脂毒性造成的肝細(xì)胞損傷。說(shuō)明沙苑子苷A是沙苑子降脂保肝的有效單體成分之一。

ATGL是機(jī)體脂質(zhì)代謝過(guò)程中的重要脂肪酶之一，是TG水解的第一步，主要把TG分解成甘油二酯，除在脂肪組織高表達(dá)外，ATGL也在骨骼肌、心肌、肝臟等非脂肪細(xì)胞中表達(dá)[14]。研究發(fā)現(xiàn)其不僅在脂肪組織脂解過(guò)程中處于關(guān)鍵脂肪酶的角色，而且在非脂肪組織的脂質(zhì)和能量代謝過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用[15]。盡管肝臟中ATGL的表達(dá)與脂肪組織相比較低，但是已經(jīng)證明ATGL是主要的肝臟TG水解酶，Ong等[16]研究顯示，由腺病毒介導(dǎo)的肝臟ATGL基因敲除小鼠體內(nèi)出現(xiàn)肝脂肪變性，原代肝細(xì)胞內(nèi)TG降解速率也受到抑制；與此同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)ATGL過(guò)表達(dá)小鼠體內(nèi)脂肪酸氧化增加，改善肝臟的脂質(zhì)代謝[17]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，F(xiàn)FA誘導(dǎo)L02細(xì)胞中ATGL的mRNA和蛋白的表達(dá)量比正常細(xì)胞中有明顯的提高，這說(shuō)明了當(dāng)肝細(xì)胞中內(nèi)積累了大量TG時(shí)，細(xì)胞中脂肪分解限速酶ATGL的表達(dá)大量增加，細(xì)胞通過(guò)自身調(diào)節(jié)來(lái)代謝TG，使細(xì)胞恢復(fù)正常，給予沙苑子苷A能使細(xì)胞內(nèi)ATGL mRNA和蛋白表達(dá)量進(jìn)一步提高。

PPARs是調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝核受體家族轉(zhuǎn)錄因子之一，PPARs有3種亞型：PPARα，PPARβ/δ和PPARγ[18]。其中PPARα在肝臟中高度表達(dá)，PPARα的激活在TG的合成以及氧化等代謝途徑發(fā)揮重要作用[19]。PPARγ在脂肪中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化代謝[20]，但是研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥模型大鼠肝臟的PPARγ的蛋白表達(dá)水平顯著降低[21]，非酒精性脂肪肝患者經(jīng)過(guò)降脂藥非諾貝特治療后，觀察組肝組織PPARγ2 mRNA水平顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明非諾貝特可能通過(guò)提高肝組織PPARγ2表達(dá)，使脂肪從肝臟轉(zhuǎn)移并消耗[22]。ATGL的過(guò)表達(dá)可以提高PPARα的活性，激活PPARα信號(hào)通路和脂肪酸通道，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)代謝[23]。在ATGL缺陷型小鼠中，可以通過(guò)用PPARα激動(dòng)劑治療來(lái)恢復(fù)缺陷的PPARα活化[24-25]。用PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮飼喂小鼠，其ATGL mRNA和蛋白表達(dá)都顯著增加,通過(guò)對(duì)ATGL基因啟動(dòng)子的分析證明ATGL受PPARγ的直接調(diào)控[26]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，F(xiàn)FA誘導(dǎo)L02細(xì)胞中PPARα、PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)量比正常細(xì)胞中有明顯的提高，這說(shuō)明了當(dāng)肝細(xì)胞中積累了大量TG時(shí)，細(xì)胞中PPARα、PPARγ的表達(dá)會(huì)自行上調(diào)，細(xì)胞自動(dòng)調(diào)節(jié)來(lái)分解TG使細(xì)胞恢復(fù)正常，給予沙苑子苷A會(huì)使細(xì)胞內(nèi)PPARα、PPARγ表達(dá)量進(jìn)一步提高，PPARα的上調(diào)幅度比PPARγ的幅度略小。說(shuō)明沙苑子苷A可能通過(guò)上調(diào)PPARα、PPARγ的mRNA和蛋白的表達(dá)，使ATGL表達(dá)增加，促進(jìn)肝臟TG的水解，減輕肝臟脂肪的沉積。

TNF-α和IL-6是2個(gè)與肝臟脂肪沉積關(guān)系密切的細(xì)胞因子，與肝組織的炎癥、壞死和纖維化正相關(guān)[27]。Stienstra等[28]研究發(fā)現(xiàn)PPAR-α基因敲除小鼠和野生型小鼠用高脂飲食喂養(yǎng)6個(gè)月后，PPAR-α基因敲除小鼠中IL-6、TNF-α等多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)比野生型小鼠顯著升高。PPARγ通過(guò)降低基質(zhì)金屬蛋白酶9的活性，抑制炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6以及TNF-α的表達(dá)[29]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，F(xiàn)FA誘導(dǎo)L02細(xì)胞中IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)量比正常細(xì)胞中有明顯的提高，這說(shuō)明了當(dāng)肝細(xì)胞中脂肪大量沉積會(huì)造成細(xì)胞受損，引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，給予沙苑子苷會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的IL-6和TNF-α表達(dá)顯著降低，說(shuō)明沙苑子苷A能減輕脂肪變性肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究從體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)沙苑子苷A是沙苑子降脂的有效單體成分之一，其可能通過(guò)上調(diào)PPARα、PPARγ的表達(dá)，使ATGL表達(dá)增加，促進(jìn)肝臟TG的水解，減少肝臟脂肪的沉積，緩解氧化應(yīng)激，降低促炎TNF-α和IL-6的分泌，減輕炎癥反應(yīng)，從而恢復(fù)肝細(xì)胞的正常功能。