基于p16通路探索參黃沖劑對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡和細胞周期的影響*

劉晶， 畢雪夢， 呂靜萱， 王雪黎， 馮泓琳， 韓旭

基于p16通路探索參黃沖劑對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡和細胞周期的影響*

劉晶， 畢雪夢， 呂靜萱， 王雪黎， 馮泓琳， 韓旭△

（南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

探究參黃沖劑對β-淀粉樣蛋白（Aβ）誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡和細胞周期的影響。利用不同濃度（0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4 g/L）的參黃沖劑處理SH-SY5Y細胞48 h后，用CCK-8法檢測不同濃度的參黃沖劑對SH-SY5Y細胞活力的影響。在此基礎上設置空白組、模型組及低、中、高劑量參黃沖劑組。采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，Hoechst 33342熒光染色法觀察細胞凋亡情況，流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡率，Western blot分析細胞凋亡、細胞周期及p16信號通路相關蛋白的表達變化。與模型組相比，參黃沖劑給藥組細胞凋亡率降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高，促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表達下降；同時，參黃沖劑可以逆轉(zhuǎn)由Aβ25-35導致的G0/G1期阻滯；與模型組相比，參黃沖劑可以上調(diào)p16蛋白的表達，下調(diào)p16下游細胞周期相關蛋白CDK4、CDK6、cyclin D1和p-RB的表達。參黃沖劑可能通過干預p16信號通路，逆轉(zhuǎn)Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞周期阻滯，抑制SH-SY5Y細胞凋亡。

參黃沖劑；阿爾茨海默??；細胞凋亡；細胞周期；p16信號通路

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）是一種中樞神經(jīng)退行性病變，以進行性認知功能障礙和行為損害為主要臨床特征［1］。國際AD協(xié)會2015年的報告顯示，目前世界范圍內(nèi)60歲以上老年人大約有9億人，估計全球共有約5 500萬AD患者，這一數(shù)量將以每20年遞增1倍的速度逐漸增加，預計到2050年將達1.39億［2］。2019年AD和其他形式的癡呆癥在主要死亡原因中位列第七，死亡人數(shù)高達163萬［3］。目前全球用于癡呆的相關費用已增至2015年的8 180億美元，與2010年相比增長了35.4%。隨著老齡化社會的到來，AD患病率和死亡率逐年增高，而目前仍缺乏有效的治療手段，加之高昂的治療費用，可見AD已嚴重危害人們的生活和健康。目前臨床用于治療AD的藥物如膽堿酯酶抑制劑、-甲基-D-天冬氨酸（-methyl-D-aspartic acid， NMDA）受體拮抗劑及β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein， Aβ）靶向抑制劑等藥物，價格昂貴，副作用多，且只能通過暫時緩解記憶力減退的方式幫助患者改善身體機能。因此，探究AD的病因和發(fā)病機制，尋找便宜有效且毒副作用小的治療藥物是當今醫(yī)學研究的熱點內(nèi)容。

近年來，相關研究表明，中醫(yī)藥可以通過補腎化瘀、益氣活血、清心開竅等治法，從減少腦內(nèi)Aβ的生成、抗神經(jīng)細胞凋亡、抑制小膠質(zhì)細胞活化等多種途徑，維持神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮治療AD的作用［4-5］。本研究團隊在南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院國醫(yī)大師周仲瑛教授、省中名醫(yī)韓旭教授帶領下，致力于AD的臨床和基礎研究，根據(jù)多年臨床實踐經(jīng)驗總結，研制出以“滋陰補陽、充髓益智、化瘀祛毒”組方的院內(nèi)制劑參黃沖劑（Shen-Huang granule， SHG），以其切實的臨床療效深受患者信賴。Aβ過度沉積是AD發(fā)生的重要機制，Aβ25-35作為Aβ的片段，對神經(jīng)細胞具有毒性，會加速神經(jīng)細胞凋亡，常被應用于模擬AD模型［6-7］。我們前期研究證實，參黃沖劑可以下調(diào)基因的表達［8］，而p16在老年AD患者的海馬神經(jīng)元中表達增加［9-10］，逆轉(zhuǎn)Aβ誘導的p16表達上調(diào)可能是治療AD的重要機制。AD中神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生受到凋亡相關蛋白如Bcl-2、Bax、caspase及Aβ等多種因素影響［9］。因此，本研究將基于p16信號通路，闡明參黃沖劑對Aβ25-35誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡和細胞周期的作用機制，為參黃沖劑的臨床應用提供分子生物學基礎。

材料和方法

1　細胞及藥物

SH-SY5Y細胞株購自中國科學院細胞庫，目錄號SCSP-5014。參黃沖劑由生曬參、黃精、淫羊藿、熟地黃、何首烏等中藥組成，購自江蘇省中醫(yī)院。將顆粒劑稱重后裝入50 mL離心管中，用超純水溶解至0.5 g/mL，于超凈臺內(nèi)去除離心管蓋子，將溶液分裝至5 mL離心管中，每管2 mL，并用鋁箔紙密封。將封裝好的離心管置于冷凍干燥機內(nèi)，凍干48 h，制成干燥粉末。于超凈臺內(nèi)去除保鮮膜，紫外線照射殺菌30 min，凍干粉制備完成并于-80 ℃冰箱保存。實驗時將凍干粉取出后離心，用無菌生理鹽水溶解至所需濃度后，用0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝備用。

2　試劑及儀器

CCK-8檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：7E530B1和7E572G1）；Hoechst 33342染色試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號：C0003）；細胞周期檢測試劑盒（蘭杰柯科技有限公司，批號：21327482）；胎牛血清（四季青，批號：21090703）；DMEM培養(yǎng)液（Biological Industries，批號：2151415）；細胞染色緩沖液（南京福麥斯生物技術有限公司，批號：FMS20210729001）；β-actin抗體（湖南艾方生物科技有限公司，批號：66032478）；GAPDH抗體（Proteintech，批號：00092829）；p16、CDK4、CDK6和cyclin D1抗體（杭州華安生物技術有限公司，批號：HN1214、HN0927、HN0201和HN0518）；p-RB抗體（Cell Signaling Technology，批號：8516T）；Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3抗體（Affinity，批號：11o9905、44q6915和15z0096）；HRP標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：YH201006和YH203433）BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物（100×）、RIPA裂解液、Ⅰ抗稀釋液和Ⅱ抗稀釋液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：12212020210323、101320201119、092520201124、110420201126和102120201118）。

SCIENTZ-12N系列冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ChemiDoc XRS+型凝膠成像儀（Bio-Rad）；ELx800型酶標儀（BioTek）；FACSCelesta型流式細胞儀（BD Biosciences）；CKX41型倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）；Ts2R型熒光倒置顯微鏡（NIKON）；330A型低速醫(yī)用離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；1300系列Ⅱ級A2型生物安全柜和88880018型渦旋振蕩器（Thermo Fisher）。

3　方法

3.1細胞培養(yǎng)SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期的細胞進行下列實驗。

3.2CCK-8法檢測細胞活力取對數(shù)生長期的細胞，以每孔1×104的密度接種到96孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用不同濃度（0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4 g/L）的參黃沖劑干預48 h，或用不同濃度（0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4 g/L）的參黃沖劑干預24 h后，再加入40 μmol/L Aβ25-35干預24 h。干預結束后棄上清，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)液和10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450 nm處檢測吸光度，并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

3.3倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)取對數(shù)生長的細胞，以每孔3×104的密度接種到12孔板中，置于培養(yǎng)箱24 h后，分為空白組、模型組（40 μmol/L Aβ25-35干預24 h）和中藥組。中藥組分為參黃沖劑低、中、高劑量組，分別在造模的基礎上用0.4、0.8和1.6 g/L參黃沖劑作用48 h。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照記錄。

3.4Hoechst 33342染色法觀察細胞凋亡情況細胞種板培養(yǎng)及分組給藥同3.3，干預完成后，棄上清，用PBS洗滌兩次后，加入多聚甲醛固定20 min后，去除多余的多聚甲醛，加入800 μL的細胞染色緩沖液，5 μL的Hoechst 33342溶液（5 mg/L），于4 ℃孵育25 min后，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核變化，淡藍色為正常細胞，亮藍色為凋亡細胞。

3.5流式細胞術檢測細胞凋亡取對數(shù)生長期的細胞，以每孔2×105的密度接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱24 h后，分組給藥同3.3，干預完成后用不含EDTA的胰酶消化細胞，加入完全培養(yǎng)液終止消化后，離心收集細胞，用預冷的PBS小心清洗2次；用500 μL 1× Binding Buffer重懸細胞；再加入5 μL Annexin V-FITC 及5 μL PI染色，輕輕混勻后，避光環(huán)境，室溫孵育15 min后用流式細胞儀檢測，觀察細胞凋亡情況并計算凋亡率。

3.6流式細胞術檢測細胞周期細胞種板培養(yǎng)同3.5，分組給藥及細胞收集同3.3，取細胞沉淀，PBS清洗2次后，用1 mL的70%冰乙醇溶液重懸細胞，置于4 ℃冰箱固定過夜；再以1 000×離心5 min棄去乙醇，PBS清洗2次后，每管加入0.5 mL的PI/RNase 混合液，室溫避光孵育30 min后，用流式細胞儀檢測并分析細胞周期分布情況。

3.7Western blot檢測細胞凋亡、細胞周期及p16通路相關蛋白的表達取對數(shù)生長期的細胞，種板培養(yǎng)同3.5，分組給藥同3.3。干預完成后，將6孔板置于冰上，每孔加入適量RIPA裂解液，冰上裂解10 min，裂解完成后用細胞刮收集各組細胞，超聲裂解3次，每次15 s，隨后4 ℃、12 000 r/min離心20 min。收集上清，每組取2 μL上清用BCA法進行蛋白定量。在上清中加入適量的loading buffer，95 ℃孵育10 min使蛋白變性。將各組蛋白樣本進行SDS-PAGE；然后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉2 h；封閉結束后，按分子量裁剪目的條帶，并將其放入相應Ⅰ抗（p16、CDK4、CDK6、cyclin D1、p-RB、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和β-actin抗體，均1∶1 000稀釋）中，4 ℃孵育過夜，然后用TBST洗滌3次，每次10 min；再將抗體置于對應的Ⅱ抗（1∶8 000稀釋）中，室溫孵育1 h，孵育完成后，用TBST洗滌3次，每次10 min；加入ECL發(fā)光液進行曝光；用Image Lab軟件分析各條帶灰度值。

4　統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0、GraphPad Prism 8.0.1和Image Lab 5.2軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析比較組間差異，進一步采用LSD-檢驗進行兩兩比較。當<0.05提示差異具有統(tǒng)計學意義。

結果

1　參黃沖劑對SH-SY5Y細胞活力的影響

SH-SY5Y細胞在不同濃度的參黃沖劑干預48 h后呈現(xiàn)出不同程度的生長抑制，在3.32 g/L參黃沖劑干預48 h后，SH-SY5Y細胞生長抑制率達50%；經(jīng)參黃沖劑預處理后，40 μmol/L Aβ25-35干預的細胞活力隨著藥物濃度的增加而升高，見圖1。因此，我們選擇0.4、0.8和1.6 g/L分別作為參黃沖劑低、中、高劑量組的劑量進行后續(xù)實驗。

Figure 1.　The effects of treatment with different concentrations of Shen-Huang granule （SHG） for 48 h or 40 μmol/L Aβ co-intervention for 48 h on the viability of SH-SY5Y cells were determined by CCK-8 assay. Mean±SD. n=5.

2　參黃沖劑對SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組細胞形態(tài)正常，均勻分布，貼壁狀態(tài)良好；與空白組相比，模型組細胞排列不緊，多數(shù)細胞脫落，呈半貼壁狀抱團生長；與模型組相比，不同濃度的參黃沖劑給藥組細胞貼壁情況好轉(zhuǎn)，抱團生長趨勢可見一定程度逆轉(zhuǎn)，見圖2。

Figure 2.　The morphological changes of SH-SY5Y cells in each group observed by inverted microscopy （×200）. SHG-L： low-dose Shen-Huang granule； SHG-M： medium-dose Shen-Huang granule； SHG-H： high-dose Shen-Huang granule.

3　參黃沖劑對SH-SY5Y細胞核染色的影響

利用Hoechst 33342熒光染色法，在倒置熒光顯微鏡下觀察SH-SY5Y細胞核的染色變化，活細胞細胞核呈淡藍色熒光，凋亡細胞核呈亮藍色熒光?？瞻捉M多數(shù)細胞核呈淡藍色，幾乎無凋亡細胞；模型組多數(shù)細胞核呈亮藍色，提示凋亡細胞數(shù)較多；與模型組相比，參黃沖劑各劑量組亮藍色凋亡細胞數(shù)減少，且具有一定的濃度依賴性，見圖3。

Figure 3.　The apoptosis of SH-SY5Y cells in each group was detected by Hoechst 33258 staining under fluorescence microscope （×200）. SHG-L： low-dose Shen-Huang granule； SHG-M： medium-dose Shen-Huang granule； SHG-H： high-dose Shen-Huang granule. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs model group.

4　參黃沖劑對SH-SY5Y細胞凋亡率的影響

Annexin-V/PI雙染色法可用于區(qū)分壞死細胞、早期凋亡細胞及晚期凋亡細胞。依據(jù)流式細胞術結果顯示，Aβ25-35可以誘導SH-SY5Y細胞發(fā)生凋亡，而隨著參黃沖劑給藥濃度的增加，細胞凋亡率減少，表明參黃沖劑可以有效抑制Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡過程，見圖4。

Figure 4.　The effects of pretreatment with Shen-Huang granule （SHG） at different concentrations on the apoptosis of SH-SY5Y cells in 40 μmol/L Aβ25-35 environment were analyzed by flow cytometry. SHG-L： low-dose SHG； SHG-M： medium-dose SHG； SHG-H： high-dose SHG. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs model group.

5　參黃沖劑對SH-SY5Y細胞凋亡相關蛋白的影響

Western blot實驗結果顯示，Aβ25-35干預后，促凋亡蛋白Bax和cleved caspase-3表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低；參黃沖劑可以下調(diào)SH-SY5Y細胞促凋亡蛋白Bax和cleved caspase-3的表達，同時上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，表明參黃沖劑可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白的表達而抑制SH-SY5Y細胞凋亡，見圖5。

Figure 5.　The effects of Shen-Huang granule （SHG） on the expression of apoptosis-related proteins in SH-SY5Y cells in 40 μmol/L Aβ25-35 environment were analyzed by Western blot. SHG-L： low-dose SHG； SHG-M： medium-dose SHG； SHG-H： high-dose SHG. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs model group

6　參黃沖劑對SH-SY5Y細胞周期的影響

流式細胞術結果顯示，與空白組相比，Aβ25-35干預后模型組細胞中G0/G1期細胞比例顯著升高；與模型組相比，參黃沖劑給藥組的G0/G1期細胞比例顯著降低（<0.05），見圖6。這提示Aβ25-35可以誘導SH-SY5Y細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，而參黃沖劑可以在一定能程度上抑制Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞周期阻滯。

Figure 6.　The effects of pretreatment with Shen-Huang granule （SHG） at different concentrations on the cell cycle distribution of SH-SY5Y cells in 40 μmol/L Aβ25-35 environment were analyzed by flow cytometry. SHG-L： low-dose SHG； SHG-M： medium-dose SHG； SHG-H： high-dose SHG. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group； #P<0.05 vs model group.

5　參黃沖劑對SH-SY5Y細胞p16通路及細胞周期相關蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示，Aβ25-35干預后，p16蛋白表達升高，其下游細胞周期相關蛋白cyclin D1、CDK6、CDK4和p-RB表達下調(diào)；參黃沖劑可以有效逆轉(zhuǎn)經(jīng)Aβ25-35干預后SH-SY5Y細胞p16及其下游細胞周期相關因子cyclin D1、CDK6、CDK4和p-RB的蛋白水平，見圖7。以上數(shù)據(jù)表明參黃沖劑能夠通過干預p16通路調(diào)控細胞周期相關蛋白的表達變化。

Figure 7.　The effects of Shen-Huang granule （SHG） on the expression of p16 signaling pathway- and cell cycle-related proteins in SH-SY5Y cells in 40 μmol/L Aβ25-35 environment were analyzed by Western blot. SHG-L： low-dose SHG； SHG-M： medium-dose SHG； SHG-H： high-dose SHG. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs model group

討論

參黃沖劑選用藥性較平和且無毒可久服之中草藥入藥，其中人參、黃精為君滋補腎之陰陽，輔以熟地、首烏、菟絲子、淫羊藿，益精填髓，補助腎氣；同時兼顧老年人易夾瘀血、易成瘀毒體質(zhì)，佐以虎杖活血化瘀祛毒，清補兼用，和調(diào)臟腑；選用石菖蒲作為使藥，補腎開竅，寧神益志，同時引藥效主入腎、腦，強腎抗衰，開竅益智。所謂“治病必求于本”，AD的治療尤重填精補髓， 補益虛損，化瘀祛毒。氣足血旺，鼓動有力，瘀毒自消，腦絡通暢，神機自復。諸藥合用，攻補兼施，標本兼治，相得益彰；諸法相伍，當使氣血和合，以臻“疏其血氣，令其條達而致和平”的治療境地，可助AD患者改善認知，延緩癡呆之效。全方藥性平和，不溫不燥、不偏寒涼，相互配合，甚切AD病機之要。

神經(jīng)元凋亡、Aβ沉積及tau蛋白過度磷酸化等是AD的重要發(fā)病機制［12-13］。Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax可協(xié)同作用于caspase-3下游。Aβ的過度沉積會導致促凋亡蛋白Bax過度釋放，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而誘導神經(jīng)元發(fā)生凋亡［14］。此外，caspase-3作為所有凋亡信號的核心傳導樞紐，是細胞凋亡發(fā)生的重要環(huán)節(jié)［15］。本研究結果顯示，在Aβ25-35干預后，SH-SY5Y細胞凋亡率增加，同時伴隨著促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低；在參黃沖劑干預后，SH-SY5Y細胞凋亡率下降，提示參黃沖劑可能通過抑制促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而抑制Aβ25-35誘導的神經(jīng)元細胞凋亡。

AD早期出現(xiàn)認知障礙的病理機制，可能與細胞周期的失調(diào)導致完全分化的神經(jīng)元出現(xiàn)細胞凋亡密切相關，細胞周期相關因子的檢測可以為神經(jīng)元的早期凋亡提供有力依據(jù)［16-20］。p16信號通路是細胞從G期到S期轉(zhuǎn)換的重要分子信號傳導途徑。一方面，cyclin D1蛋白在G1期與CDK4/6形成復合物，從而推動RB發(fā)生磷酸化，使細胞從G1期進入S期；而另一方面，p16能有效抑制CDK4/6與cyclin D1的結合及活性，致使RB去磷酸化，從而引起G1期阻滯［21-23］。此外，研究發(fā)現(xiàn)在老年阿爾茨海默病患者的海馬神經(jīng)元中p16蛋白表達增加，而逆轉(zhuǎn)Aβ誘導的p16基因表達上調(diào)可以起到治療AD的作用［9-10］。研究結果顯示：在Aβ25-35干預后，SH-SY5Y細胞出現(xiàn) G0/G1期阻滯，同時伴隨著p16蛋白表達上調(diào)，其下游周期相關蛋白cyclin D1、CDK6、CDK4表達下調(diào)，RB磷酸化水平降低，而參黃沖劑可以逆轉(zhuǎn)p16及其下游周期相關蛋白的表達變化。上述研究結果提示參黃沖劑可能通過上調(diào)p16蛋白表達，下調(diào)周期相關蛋白cyclin D1、CDK4和CDK6的表達，進而減少了cyclin D1/CDK4/CDK6復合物的形成，促進RB磷酸化，從而逆轉(zhuǎn)Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞后發(fā)生的細胞周期阻滯。

本研究發(fā)現(xiàn)，參黃沖劑可以抑制促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而抑制Aβ25-35誘導的神經(jīng)元凋亡；同時我們發(fā)現(xiàn)，參黃沖劑可能通過上調(diào)p16蛋白表達，進而降低其下游細胞周期相關蛋白cyclin D1、CDK4和CDK6的表達水平，減少了cyclin D1/CDK4/CDK6復合物的形成，推動了RB磷酸化，進而逆轉(zhuǎn)Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞后發(fā)生的細胞周期阻滯。因此，我們大膽推測，參黃沖劑對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞的保護機制，可能與調(diào)控p16信號通路干預細胞周期阻滯、抑制細胞凋亡有關，但由于參黃沖劑作為復方制劑，其治療AD是否存在其他作用靶點有待進一步研究。

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Role of Shen-Huang granule in apoptosis and cell cycle of human neuroblastoma SH-SY5Y cells induced by Aβ25-35

LIU Jing， BI Xue-meng， Lü Jing-xuan， WANG Xue-li， FENG Hong-ling， HAN Xu△

（，210029，）

To explore the effect of Shen-Huang granule （SHG） on the apoptosis and cell cycle of human neuroblastoma SH-SY5Y cells induced by amyloid β-protein （Aβ） and its mechanism.After treatment with SHG at various concentrations such as 0， 0.2， 0.4， 0.8， 1.6， 3.2 and 6.4 g/L for 48 h， the viability of SH-SY5Y cells was detected by CCK-8 assay， and then the cells were divided into control group， model group， and low-， medium- and high-dose SHG groups. Morphological changes of the cells were observed by inverted microscopy. Hoechst 33342 staining was used to detect cell apoptosis. The apoptosis and cell cycle of SH-SY5Y cells were determined by flow cytometry. The proteins involved in cell cycle， apoptosis and p16 signaling pathway were assayed by Western blot.Compared with model group， SHG decreased the apoptosis rate of SH-SY5Y cells， increased the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2， and decreased the expression of pro-apoptotic proteins Bax and cleaved caspase-3. Meanwhile， SHG reversed the G0/G1phase arrest caused by Aβ25-35. Treatment with SHG increased the expression of p16 protein but decreased the expression of the downstream cell cycle-related proteins such as CDK4， CDK6， cyclin D1 and p-RB.Treatment with SHG inhibits the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by Aβ25-35via p16 signaling pathway

Shen-Huang granule； Alzheimer disease； Apoptosis； Cell cycle； p16 signaling pathway

1000-4718（2022）09-1569-08

2022-03-30

2022-05-25

13057504158； E-mail： hanxu9998@126.com

R285.5； R741.02

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.005

［基金項目］江蘇省自然科學基金資助項目（No. BK20181505）；江蘇省中醫(yī)藥科技發(fā)展專項計劃（No. 2020ZX08）；南京中醫(yī)藥大學自然科學基金資助項目（No. XZR2020011）；江蘇省研究生科研創(chuàng)新計劃（No. KYCX22_1892）

（責任編輯：林白霜，羅森）